角膜上皮伤口愈合过程中的热休克蛋白27的功能为基础的RNA干扰研究

该 RNA 转染测定的总体目标是使用 HSP27 特异性小干扰 RNA 来评估 HSP27 在角膜上皮伤口愈合中的潜在作用。这种方法可以帮助回答有关热休克蛋白 27 在上皮伤口愈合过程中功能的关键问题。该技术的主要优点是小干扰 RNA 是敏感的 RNA 蔗糖，用于特异性靶向信使 RNA 转录本以诱导其降解。

它已被用于识别新的害虫空间、各种细胞过程。虽然这种技术可以提供对角膜上皮伤口愈合的见解，但它也可能适用于其他系统，例如皮肤和粘膜。演示该程序的是我实验室的技术人员 Soon-Suk Kang。

要开始此程序，请在 6 孔板中培养人角膜上皮细胞，并在 37 摄氏度和 5% 的二氧化碳下使用支气管上皮生长培养基，直到它们 95% 汇合。接下来，用 100 μL 还原血清培养基稀释 2.5 μL 或 7.5 μL 转染试剂进行转染。然后，将 HSP27 特异性 siRNA 和加扰对照 siRNA 溶解在 100 μL 或减血清培养基中，以分别制备 10 纳摩尔的 HSP27 特异性 siRNA 和 15 纳摩尔的加扰对照 siRNA。

然后，将 100 μ L siRNA 溶液与 100 μ L 稀释转染试剂混合，并在室温下孵育混合物 15 分钟。随后，向细胞中添加 siRNA 脂质复合物。孵育 4 小时后，将培养基更换为完全支气管上皮生长培养基，并在 37 摄氏度下孵育细胞两天，然后进行蛋白质印迹分析。

在此步骤中，使用 100 μL 冰冷裂解缓冲液在生物安全柜中提取 HSP27 特异性和加扰对照 siRNA 转染的 HCEC。然后将细胞在冰上孵育 30 分钟以诱导细胞裂解。接下来，将裂解物以 10， 000 倍 G 离心 15 分钟。

随后，将上清液转移到新鲜的 1.5 毫升试管中，并储存在零下 80 摄氏度。之后，使用 Bradford 蛋白测定法测定细胞裂解物的蛋白质浓度。然后将等量的总细胞蛋白上样到 10% 或 12% 丙烯酰胺凝胶上。

将凝胶置于 SDS 页面，并以 200 毫安电流将分离的蛋白质条带电泳转移到硝酸纤维素过滤器上，持续 1 小时和 4 摄氏度。接下来，用 TBST 中的 5% 脱脂牛奶封闭硝酸纤维素滤膜 1 小时。然后添加一抗抗体，并在 4 摄氏度下在摇床上孵育膜过夜。

第二天，用 TBST 洗涤膜 3 次，每次洗涤 10 分钟。然后使用 5% BSA 中的辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔抗体检测免疫反应性条带。随后，将膜在 western blotting luminol 试剂中在室温下孵育 1 分钟。

从试剂溶液中取出膜。然后，用吸水毛巾去除多余的液体，并将其放入塑料片保护器中。然后，将覆盖的膜放入胶片盒中，蛋白质面朝上。

将 X 光片放在膜顶部并曝光 1 分钟。在生物安全柜中，通过将无菌移液器吸头拖过 HSP27 特异性或加扰对照 siRNA 转染 HCEC 的汇合培养物来形成伤口。受伤后立即用 1XPBS 洗涤细胞两次，并将它们在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的支气管上皮生长培养基中维持 24 小时。

受伤后 24 小时，使用正置显微镜以 100 倍拍摄 HCECs 图像，并使用图像分析软件中的滤镜命令进行背景展平。使用 select measurements 命令，定义具有相同大小的多边形形状的感兴趣区域，该多边形可以从头到尾垂直覆盖初始缠绕。然后，确定每个样品受伤区域中的三个不同感兴趣区域。

使用 count size measure 菜单选项自动计算每个字段中的细胞数。此处显示的 Western blot 分析显示，磷酸化 HSP27 和磷酸化 Akt 的表达均显著降低。其中，在 HSP27 特异性 siRNA 转染的 HCECs 中，backs 的表达显著增加。

与对照 siRNA 转染细胞相比，10 纳摩尔和 15 纳摩尔 HSP27 特异性 siRNA 转染细胞中磷酸化 HSP27 表达分别降低了 30% 和 40%。此外，在 10 纳摩尔和 15 纳摩尔的 HSP27 特异性 siRNA 转染细胞中，非磷酸化 HSP27 表达分别降低了 20% 和 30%。划痕诱导的定向伤口测定表明，伤口后 24 小时，HSP27 特异性 siRNA 转染 10 和 15 纳摩尔的细胞迁移减少。

式细胞术显示，与加扰对照 siRNA 转染细胞相比，转染 HCEC 的 HSP27 特异性 siRNA 经历了更多的凋亡和坏死细胞死亡。一旦掌握了 RNA 转染技术，如果作得当，可以在 24 小时内完成。在这些程序之后，可以生成像锁口这样的事件，以回答其他问题，例如热休克蛋白 27 在角膜上皮伤口愈合中的初始功能。

观看此视频后，您应该对如何使用热休克蛋白 27 特异性小干扰 RNA 来评估热休克蛋白 27 在角膜上皮伤口愈合中的潜在作用有很好的了解。不要忘记，使用小干扰 RNA 和试剂可能很危险，并且在执行这些程序时应始终使用生物安全柜和防护面罩等前体。