Name: 角膜上皮伤口愈合过程中的热休克蛋白27的功能为基础的RNA干扰研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 了解利用HSP27特异性小干扰RNA评估热休克蛋白27在角膜上皮伤口愈合中作用的RNA转染实验方法。该技术可特异性靶向降解mRNA，为研究上皮细胞修复机制提供有效工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由韩国首尔市韩国蔚山大学医学院学生研究基金（13-14）以及韩国首尔市峨山生命科学研究所基金（2014-464）资助。

1. 细胞系
<ol>
	<li>在37 °C、5% CO2 培养箱中，使用支气管上皮细胞生长培养基（BEGM），将106个端粒酶永生化的人角膜上皮细胞（HCECs）接种于6孔板中（密度：1039.9 个细胞/mm2），培养至细胞融合度达到95%。</li>
</ol>
2. 建立上皮划痕伤口后的蛋白质印迹分析
<ol>
	<li>在生物安全柜（II级，A2型）中，用无菌的200 µl移液枪头在汇合培养的人角膜上皮细胞（HCEC）培养板孔表面划线，每皿划四次，并将HCEC分别在37 °C、5% CO2的培养箱中孵育1、5、10、30、60和120分钟。</li>
	<li>根据角膜上皮损伤后的不同孵育时间，使用一个6孔板处理六个不同的样本。</li>
	<li>用1× PBS清洗受损的HCEC单层细胞三次，然后向每个孔中加入2.0 ml BEGM培养基。</li>
	<li>每孔加入2 ml 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化5分钟，将细胞悬液转移至15 ml离心管中，在900 × g下离心5分钟，并用1 ml移液枪吸除胰蛋白酶-EDTA溶液。</li>
	<li>用1 ml 1× PBS重悬HCEC，并将其转移至1.5 ml离心管中。</li>
	<li>在10,000 × g下离心15秒，用1 ml移液枪吸除1× PBS。</li>
	<li>将HCEC重悬于100 µl预冷的裂解缓冲液中（10 mM Tris，10 mM NaCl，2 mM EDTA，25 mM NaF，2 mM Na3VO4，1 mM苯甲基磺酰氟[PMSF]，蛋白酶抑制剂[1 µM pepstatin A，1 µM亮抑酶肽，0.1 µM抑肽酶]，以及0.5% Triton X-100 [pH 7]），并充分混匀。</li>
	<li>将细胞在冰上孵育30分钟以诱导细胞裂解。</li>
	<li>在4 °C、10,000 × g条件下离心裂解物15分钟，然后将上清液转移至新的1.5 ml离心管中（每份90 µl），并于-80 °C保存。</li>
	<li>使用Bradford蛋白定量法测定细胞裂解物的总蛋白浓度。9</li>
	<li>将30 µg总细胞蛋白上样至10%或12%丙烯酰胺凝胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），随后在4 °C条件下以200 mA电流电泳1小时，将分离的蛋白条带转移至硝酸纤维素膜，用于后续Western blot分析。</li>
	<li>用含5%脱脂奶粉的Tris-缓冲盐水吐温20（TBST）溶液封闭硝酸纤维素膜1小时；然后在含5%牛血清白蛋白（BSA）的溶液中加入针对非磷酸化HSP27的一抗（兔多克隆抗体，1:1,000稀释）或针对磷酸化HSP27的一抗（兔多克隆抗体，1:1,000稀释），在摇床上4 °C孵育过夜。</li>
	<li>用TBST洗涤膜三次，每次10分钟，然后在含5% BSA的溶液中加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1:10,000稀释），进行免疫反应条带检测。</li>
	<li>将膜在Western blot发光底物（每张10 cm × 5 cm膜使用6–7 ml）中室温孵育1分钟。</li>
	<li>将膜从试剂溶液中取出，用吸水纸吸去多余液体，并放入塑料膜保护袋中。</li>
	<li>在暗室安全灯下，将包被好的膜放入胶片暗盒中，确保蛋白面朝上。</li>
	<li>将X光胶片覆盖于膜上，曝光1分钟。</li>
</ol>
3. siRNA 转染实验10
<ol>
	<li>将HCEC细胞以每孔5×105个细胞的密度接种于6孔板中，在37 °C、5% CO2的培养箱中使用BEGM培养基培养，直至细胞融合度达到95%。</li>
	<li>用100 µl低血清培养基稀释转染试剂（2.5或7.5 µl），使稀释倍数为41或14.3；同时将HSP27特异性siRNA和乱序对照siRNA分别溶于100 µl低血清培养基中，配制成终浓度为10或50 nM的HSP27特异性siRNA和乱序对照siRNA溶液。</li>
	<li>取100 µl siRNA溶液与100 µl稀释后的转染试剂按1:1比例混合，室温孵育15分钟。</li>
	<li>将siRNA-脂质复合物加入细胞中，4小时后更换为完全BEGM培养基，并在37 °C继续培养细胞2天。</li>
	<li>按照第4.1至4.7节所述方法，通过蛋白质印迹法分析转染后的细胞。</li>
</ol>
4. 针对siRNA转染细胞的蛋白质印迹分析11
<ol>
	<li>在生物安全柜中，使用 100 µl 冰冷裂解缓冲液（10 mM Tris、10 mM NaCl、2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）、25 mM NaF、2 mM Na3VO4、1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）、蛋白酶抑制剂和 0.5% Triton X-100，pH 7）提取转染了 HSP27 特异性 siRNA 和阴性对照 siRNA 的 HCEC。</li>
	<li>将细胞在冰上孵育 30 分钟以诱导细胞裂解。</li>
	<li>在 10,000 × g 离心 15 分钟后收集裂解物沉淀，将上清液转移至新的 1.5 ml 离心管中（每份 90 µl），并于 -80 °C 保存。</li>
	<li>使用 Bradford 蛋白质测定法测定细胞裂解物的蛋白浓度。9</li>
	<li>将含有等量总细胞蛋白的样品上样至 10% 或 12% 丙烯酰胺凝胶，进行 SDS-PAGE 电泳，并在 4 °C 条件下以 200 mA 电流将分离的蛋白条带电转移至硝酸纤维素膜 1 小时，用于后续 Western 印迹分析。</li>
	<li>用含 5% 脱脂奶粉的吐温-20 三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBST）在室温封闭硝酸纤维素膜 1 小时，然后加入针对磷酸化与非磷酸化 HSP27（1:1,000 稀释）、磷酸化 Akt（1:1,000 稀释）、非磷酸化 Akt（1:1,000 稀释，作为细胞存活标志物）、Bcl-2 相关 X 蛋白（1:1,000 稀释，作为促凋亡蛋白）以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH；1:200 稀释，作为上样对照）的一抗，溶于 5% 牛血清白蛋白（BSA）中，在 4 °C 摇床上孵育过夜。</li>
	<li>用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟，随后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体（1:10,000 稀释），溶于 5% BSA 中，检测免疫反应性条带。</li>
	<li>将膜在 Western 印迹发光试剂（每 10 cm × 5 cm 膜使用 6–7 ml）中室温孵育 1 分钟。</li>
	<li>从试剂溶液中取出膜，用吸水纸吸去多余液体，并将其放入塑料保护膜中。</li>
	<li>在暗室安全灯下，将包覆好的膜放入胶片暗盒中，使蛋白面朝上。</li>
	<li>将 X 光胶片置于膜上方，曝光 1 分钟。</li>
</ol>
5. 划痕诱导的定向损伤检测法评估细胞迁移12
<ol>
	<li>在生物安全柜中，用无菌移液器吸头在转染了HSP27特异性siRNA或乱序对照siRNA的HCEC融合培养细胞的孔表面划线，制造伤口。</li>
	<li>损伤后立即用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，并将细胞置于37 °C、5% CO₂培养箱中的BEGM培养基中继续培养。2 损伤后在培养箱中孵育24小时。</li>
	<li>使用直立显微镜在划痕后24小时以100倍放大倍数拍摄HCEC图像，并利用滤镜进行背景平整处理 图像分析软件中的命令。</li>
	<li>使用“选择测量”命令，以相同尺寸的多边形定义兴趣区域（AOI），该多边形应能垂直覆盖初始伤口的整个长度，且在每个样本的损伤区域中确定三个不同的兴趣区域（AOI）。</li>
	<li>使用“计数/尺寸测量”菜单选项自动统计每个视野中的细胞数量。</li>
</ol>
6. 凋亡的流式细胞术分析
<ol>
	<li>将转染HSP27特异性siRNA和对照siRNA的HCEC细胞（每孔含10 nM siRNA）以5×105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，在含5% CO2的37 °C培养箱中用BEGM培养基培养，直至细胞融合度达到95%。</li>
	<li>每孔加入2 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化5分钟，将细胞悬液转移至15 ml离心管中，以900 × g离心5分钟，并用1 ml移液器吸除胰蛋白酶-EDTA溶液。</li>
	<li>用预冷的PBS洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于1×结合缓冲液（0.1 M HEPES/NaOH [pH 7.4]、1.4 M NaCl和25 mM CaCl2）中，调整细胞浓度为106个细胞/ml。</li>
	<li>取100 µl细胞悬液（含1 × 105个细胞）转移至5 ml培养管中。</li>
	<li>加入5 µl异硫氰酸荧光素标记的Annexin V和5 µl碘化丙啶。</li>
	<li>轻轻涡旋混匀细胞，于室温避光孵育15分钟。</li>
	<li>每管加入200 µl 1×结合缓冲液，并在1小时内使用流式细胞仪进行分析。</li>
</ol>

<ol><li>Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Corneal epithelial wound healing.</a> Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).</li>
<li>Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+shed+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in shed human corneal cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).</li>
<li>Guay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+actin+filament+dynamics+by+p38+map+kinase-mediated+phosphorylation+of+heat+shock+protein+27%5BTitle%5D)+AND+%22J.+cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27.</a> J. cell. Sci. 110, Pt 3 357-368 (1997).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+heat+shock+protein+mRNAs+under+in+vivo+glutathione+depletion+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina.</a> Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).</li>
<li>Rane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+controls+apoptosis+by+regulating+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation.</a> J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).</li>
<li>Shin, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+tumor+cell+migration+and+invasion+with+biphenyl+isoxazole+derivative+KRIBB3%2C+a+synthetic+molecule+that+inhibits+Hsp27+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation.</a> J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+phosphorylated+heat+shock+protein+27+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing.</a> Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).</li>
<li>Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+profiles+in+HeLa+cells+in+response+to+overexpression+or+siRNA-mediated+depletion+of+NASP%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45(2009).</li>
<li>Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+prostaglandin+analogues+on+tear+proteomics+and+expression+of+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+in+the+conjunctiva+and+corea%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea.</a> Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).</li>
<li>Voegeli, T. S., Currie, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+knocks+down+Hsp27+and+increases+angiotensin+II-induced+phosphorylated+NF-kappaB+p65+levels+in+aortic+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells.</a> Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).</li>
<li>Shi, B., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenite+pre-conditioning+reduces+UVB-induced+apoptosis+in+corneal+epithelial+cells+through+the+anti-apoptotic+activity+of+27+kDa+heat+shock+protein+%28HSP27%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27).</a> J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).</li>
<li>Shen, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+corneal+epitheliotrophic+capacity+among+different+human+blood-derived+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations.</a> Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).</li>
<li>Song, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+phosphorylation+is+involved+in+epithelial+cell+apoptosis+as+well+as+epithelial+migration+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing.</a> Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).</li>
</ol>

作者声明在本研究中提到的任何材料或方法均无财务或所有权利益。

在本研究中，我们利用角膜上皮损伤模型评估了HSP27的潜在作用 体外 方法。关键步骤包括使用siRNA转染以敲低HSP27，从而观察HSP27在应激细胞中的功能。值得注意的是，这些实验揭示了HSP27在角膜上皮损伤修复过程中对上皮细胞迁移和凋亡的作用。与以往研究不同10 使用针对大鼠HSP27特异性siRNA转染血管平滑肌细胞的方法，我们采用siRNA转染技术对人角膜内皮细胞（CECs）进行基因表达修饰，有效敲低HSP27特异性基因表达，以研究HSP27的功能。尽管我们在靶序列、细胞密度、终末siRNA浓度及孵育时间等方面存在差异，但仍严格遵循制造商推荐的实验方案。在替代方法方面，可使用HSP27基因敲除小鼠模型，以验证HSP27磷酸化是否参与上皮细胞迁移和细胞凋亡过程。然而，在小鼠模型中监测HSP27磷酸化变化较为困难，因其磷酸化仅在上皮损伤修复的极短时间内发生。
本研究存在若干局限性。首先， 体外 我们培养人角膜内皮细胞（CECs）的环境显然不同于 体内 人类角膜内皮细胞生存环境的影响。其次，本研究中使...

角膜上皮细胞（CECs）会持续脱落进入泪膜，同时由角膜缘和角膜上皮基底层的细胞不断补充。1 多种外源性应激因素可诱导角膜内皮细胞（CECs）的凋亡与脱落。2 热休克蛋白（HSPs）具有高度保守性，可根据分子大小分为两个家族。3 最大的热休克蛋白家族包括 HSP90、HSP70 和 HSP60，较小的家族包括 HSP27。4 HSP27的磷酸化在细胞存活中起重要作用，并因其在肌动蛋白重塑中的作用而成为细胞迁移所必需的过程。5-7 因此，我们尝试检测HSP27磷酸化在CEC迁移和凋亡中的潜在作用 体外 上皮伤口愈合模型
利用小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）的RNA干扰（RNAi）技术在基础生物学和应用生物学领域均引起了广泛关注，因为它有望实现对任意目标基因表达的抑制。8 本研究中，我们采用特异性靶向HSP27的siRNA，评估HSP27在角膜内皮细胞（CEC）伤口愈合及细胞凋亡过程中的作用。传统的细胞基因沉默RNAi方法通常使用合成的RNA双链体，包括两条未经修饰的21个核苷酸长度的寡核苷酸，可退火形成siRNA。本研究所采用的RNAi siRNA是一种简便且高效的细胞转染方法，该试剂适用于多种永生化细胞系。在本研究中，我们展示了相关分析所采用的技术方法，包括划痕诱导的定向伤口愈合实验、蛋白质印迹（western blotting）、siRNA转染实验、免疫荧光染色以及流式细胞术。

<table><tbody><tr><td>生物安全柜</td><td>CHC LAB Co.Ltd,&amp;nbsp; 大田，大韩民国&amp;nbsp;</td><td>CHC-777A2-06</td><td>II级，A2型&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Stealth RNAi&amp;trade; siRNA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td></td><td>RNAi siRNA；随机对照siRNA和HSP27特异性siRNA</td></tr><tr><td>BEGM&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>Lonza, Inc.，马里兰州沃克维尔</td><td>CC-3171, CC4175</td><td>支气管上皮细胞生长培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.，密苏里州圣路易斯</td><td>P8340 ,P7626</td><td>1 &amp;#956;M Pepstatin A，1 &amp;#956;M Leupeptin，0.1 &amp;#956;M Aprotinin</td></tr><tr><td>Bradford蛋白测定&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories，加利福尼亚州赫克力士</td><td>#500-0001</td><td>Bradford蛋白测定&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>硝酸纤维素滤膜&amp;nbsp;</td><td>Amersham，英国小查尔方特</td><td>RPN3032D</td><td>Western印迹膜</td></tr><tr><td>非磷酸化HSP27&amp;nbsp;</td><td>Abcam Inc.，马萨诸塞州剑桥</td><td>ab12351</td><td>1:1,000稀释（总HSP27）</td></tr><tr><td>磷酸化HSP27（Ser85）</td><td>Abcam Inc.，马萨诸塞州剑桥</td><td>ab5594</td><td>1:1,000稀释，HSP27在Ser85位点发生磷酸化</td></tr><tr><td>Lipofectamine&lt;sup&gt;&amp;reg; &lt;/sup&gt;RNAiMAX转染试剂&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德</td><td>13-778-075</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>磷酸化Akt（Ser473）</td><td>Cell Signaling Technology，马萨诸塞州丹弗斯</td><td>No. 4060</td><td>1:1,000稀释，Akt在Ser473位点发生磷酸化（细胞存活标志物）</td></tr><tr><td>非磷酸化Akt&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology，马萨诸塞州丹弗斯</td><td>No. 4061</td><td>1:1,000稀释（总Akt）</td></tr><tr><td>Bcl-2相关X蛋白&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology，马萨诸塞州丹弗斯</td><td>No. 4062</td><td>1:1,000（抗凋亡蛋白标志物）</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Santa Cruz Biotechnology，加利福尼亚州圣克鲁兹</td><td>No. 4063</td><td>1:1,000上样对照标志物（看家基因）</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>NCI1460KR</td><td>1:10,000稀释</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德</td><td>31985</td><td>用于转染的低血清培养基</td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td>Olympus, Inc.，日本东京</td><td>Image-Pro Plus 5.0</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG，德国卡尔斯鲁厄</td><td>T145.2</td><td></td></tr><tr><td>Tris&amp;nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc.，俄亥俄州索伦</td><td>No-0497</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠&amp;nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc.，俄亥俄州索伦</td><td>No-0241</td><td></td></tr><tr><td>六孔培养板</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>140675</td><td>每孔直径35.00 mm</td></tr><tr><td>24孔培养皿</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>N-Bioteck, Inc.，韩国首尔</td><td>NB1015</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Santa Cruz Biotechnology，加利福尼亚州圣克鲁兹</td><td>sc-2323&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BDFACSCanto&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; II</td><td>BD Biosciences，新泽西州富兰克林湖</td><td></td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>X射线胶片</td><td>Kodak，纽约州罗切斯特</td><td></td><td>带绿色400荧光屏的医用X射线暗盒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Western印迹发光试剂（luminol）</td><td>Santa Cruz Biotechnology，加利福尼亚州圣克鲁兹</td><td>sc-2048&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V细胞凋亡检测试剂盒I</td><td>BD Biosciences，新泽西州富兰克林湖</td><td>556547</td><td></td></tr></tbody></table>

基于rna干扰的热休克蛋白27在角膜上皮伤口愈合过程中功能的研究

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

小干扰RNA（siRNA）是RNA干扰技术中最常用的方法之一，可用于短期沉默蛋白质编码基因。siRNA是一种人工合成的RNA双链，可特异性靶向mRNA转录本并诱导其降解，已被广泛用于揭示多种细胞过程中的新信号通路。目前关于磷酸化热休克蛋白27（HSP27）在角膜上皮损伤修复中作用的研究报道较少。本文中，将培养的人角膜上皮细胞分为两组：一组转染随机对照siRNA，另一组转染HSP27特异性siRNA。随后进行划痕诱导的定向损伤实验、蛋白质印迹分析（Western blotting）以及流式细胞术检测。我们得出结论：HSP27在角膜上皮损伤修复过程中发挥作用，可能涉及上皮细胞的凋亡与迁移。本文提供了样本制备及研究方案的逐步详细说明。

与未划痕损伤的HCECs相比，划痕损伤后5、10和30分钟时磷酸化HSP27的表达显著增加13。Western印迹分析显示，在转染HSP27特异性siRNA的HCECs中，磷酸化HSP27和磷酸化Akt的表达均显著降低，而Bax的表达则显著升高（图1A-E）。与转染对照siRNA的细胞相比，转染10 nM和50 nM HSP27特异性siRNA的细胞中磷酸化HSP27的表达分别减少了30%和40%，但对照组中磷酸化HSP27的表达未见降低（图1A-B）。此外，转染10 nM和50 nM HSP27特异性siRNA的细胞中非磷酸化HSP27的表达分别减少了20%和30%，而对照组中非磷酸化HSP27的表达未见减少（图1A和C）。
划痕诱导的定向损伤实验表明，在损伤后24小时，转染了特异性针对HSP2...

本文介绍了一种利用热休克蛋白27（HSP27）特异性小干扰RNA评估HSP27在角膜上皮伤口愈合过程中功能的实验方案。RNA干扰是研究多种细胞类型中蛋白质功能时，有效敲低基因表达的最佳方法。

基于RNA干扰的热休克蛋白27在角膜上皮伤口愈合过程中功能的研究

小干扰RNA（siRNA）是用于短期沉默蛋白质编码基因的最广泛应用的RNA干扰方法之一。siRNA是一种……

本RNA转染实验的总体目标是利用HSP27特异性的小干扰RNA，评估HSP27在角膜上皮伤口愈合过程中的潜在作用。该方法有助于解答关于热休克蛋白27在上皮伤口愈合过程中功能的关键问题。该技术的主要优势在于，小干扰RNA是一种特异性设计的RNA分子，可靶向特定的信使RNA转录本并诱导其降解。该技术已被用于鉴定新型害虫在多种细胞过程中的作用。尽管此方法可为角膜上皮损伤修复提供深入见解，但也可能适用于其他系统，如皮肤和黏膜。本实验操作将由我实验室的技术员 Soon-Suk Kang 演示。开始本实验时，将人角膜上皮细胞在六孔板中用支气管上皮细胞生长培养基于37°C、5%二氧化碳条件下培养，直至细胞融合度达到95%。接着，将2.5微升或7.5微升转染试剂用100微升低血清培养基稀释，用于转染。然后，将HSP27特异性siRNA和乱序对照siRNA分别溶解于100微升低血清培养基中，配制成终浓度分别为10纳摩尔的HSP27特异性siRNA和15纳摩尔的乱序对照siRNA。随后，将100 µL siRNA溶液与100 µL稀释的转染试剂混合，在室温下孵育15分钟。接着，将siRNA脂质复合物加入细胞中。孵育4小时后，更换为完全支气管上皮生长培养基，并在37°C下继续孵育细胞2天，然后进行Western blot分析。在此步骤中，于生物安全柜内使用 100 微升冰预冷的裂解缓冲液提取转染了 HSP27 特异性 siRNA 和乱序对照 siRNA 的 HCEC。然后将细胞在冰上孵育 30 分钟以诱导细胞裂解。接着，将裂解物在 10,000 × g 离心 15 分钟。随后，将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，并于-80摄氏度保存。之后，使用Bradford蛋白测定法测定细胞裂解物的蛋白浓度。然后，将含有等量总细胞蛋白的样品上样至10%或12%的丙烯酰胺凝胶中。将凝胶进行SDS-PAGE电泳，并在4°C条件下以200毫安电流将分离的蛋白质条带电泳转移至硝酸纤维素膜上，持续1小时。随后，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液在室温下封闭硝酸纤维素膜1小时。然后加入一抗，于4°C摇床孵育过夜。第二天，用 TBST 清洗膜三次，每次十分钟。然后使用含 5% BSA 的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体检测免疫反应性条带。随后，将膜在室温下与 Western 印迹发光试剂（luminol reagents）孵育一分钟。从试剂溶液中取出膜，用吸水纸巾吸去多余液体，然后将其放入塑料保护膜袋中。随后，将带有保护膜的膜放入胶片暗盒中，确保蛋白面朝上。将X射线胶片置于膜上，曝光一分钟。在生物安全柜中，用无菌移液器吸头在转染了HSP27特异性siRNA或乱序对照siRNA的HCEC融合培养层上划线制造伤口。划伤后立即用1×PBS洗涤细胞两次，并将其置于支气管上皮细胞生长培养基中，在37摄氏度、5%二氧化碳

rna-interference-based-investigation-function-heat-shock-protein-27

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

角膜上皮伤口愈合过程中的热休克蛋白27的功能为基础的RNA干扰研究

本文展示了在人糖尿病供体角膜器官培养模型中，利用腺病毒基因治疗使角膜上皮干细胞标志物表达显著降低及伤口愈合延迟等异常情况趋于正常化的实例。同时，还描述了在富含干细胞的角膜缘上皮细胞培养体系中对该治疗过程的优化方法。...

用于糖尿病性角膜病变的腺病毒基因治疗：对人器官培养角膜和角膜缘上皮细胞伤口愈合及干细胞标志物表达的影响

高通量小干扰RNA筛选是一种重要工具，有助于更快速地阐明化学性角膜上皮损伤的分子机制。本文介绍了用于氢氟酸和氯化苦诱导角膜上皮损伤的高通量筛选暴露模型与方法的建立及验证。...

高通量siRNA筛选氯化苦和氟化氢诱导的角膜上皮细胞损伤

本方案描述了一种在小鼠眼部表面造成擦伤并随后观察其伤口愈合过程的方法。该方案利用眼部钻头，在麻醉小鼠状态下部分去除眼表上皮。...

使用眼部钻头建立角膜上皮擦伤作为角膜伤口愈合模型

本文描述了一种用于角膜伤口愈合研究的离体角膜器官培养模型的实验方案。该模型系统可用于评估药物在有序的三维多细胞环境中促进再生性愈合或产生药物毒性的效应。...

离体角膜器官培养模型在伤口愈合研究中的应用

本文描述了一种使用环钻和钝性高尔夫球棒状刮匙在小鼠角膜中央制造上皮擦伤伤口的实验方案。该角膜伤口愈合模型具有高度可重复性，目前正被用于评估在疾病背景下受损的角膜伤口愈合情况。...

一种用于研究角膜伤口愈合的上皮擦伤模型

本文建立了基于小鼠和兔的动物模型，用于角膜上皮机械性和化学性损伤的研究，以筛选新的治疗方法及其潜在机制。...

Ex Vivo 和 In Vivo 角膜上皮机械性与化学性损伤动物模型

本方案展示了在鸡胚体内对角膜进行损伤处理的各个步骤。in ovo...

研究胚胎期受伤鸡角膜中的无瘢痕组织再生

本实验方案通过机械摩擦损伤斑马鱼的眼表，以在细胞水平上评估其后续的伤口闭合情况。该方法利用眼科钻头部分去除角膜上皮，并采用扫描电子显微镜追踪伤口闭合过程中细胞形态的变化。...

斑马鱼角膜伤口愈合：从擦伤到伤口闭合的成像分析

本研究描述了一种利用3D打印支架实现去核眼球高分辨率活细胞成像的新型实验方案。通过该方案，可观察角膜上皮损伤后去核眼球中细胞钙信号活动 离体 眼球可在实时下被观察到。...

活细胞成像技术在完整样本中的应用 离体 使用新型3D打印支架的球形体培养

我们通过角膜上皮刮除联合角膜缝线的方法建立了一种大鼠严重角膜炎症模型。该研究评估了角膜炎症模式、上皮细胞增殖以及炎症条件下角膜缘干细胞的变化。...

基于角膜上皮刮除联合角膜缝线建立大鼠重度角膜炎模型

利用器官培养的猪角膜和上皮伤口愈合评估治疗和化学毒性

了解利用HSP27特异性小干扰RNA评估热休克蛋白27在角膜上皮伤口愈合中作用的RNA转染实验方法。该技术可特异性靶向降解mRNA，为研究上皮细胞修复机制提供有效工具。

基于RNA干扰的热休克蛋白27在角膜上皮伤口愈合过程中功能的研究

探索更多视频