Name: 角膜上皮伤口愈合过程中的热休克蛋白27的功能为基础的RNA干扰研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 了解利用HSP27特异性小干扰RNA评估热休克蛋白27在角膜上皮伤口愈合中作用的RNA转染实验方法。该技术可特异性靶向降解mRNA，为研究上皮细胞修复机制提供有效工具。

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本研究由韩国首尔市韩国蔚山大学医学院学生研究基金（13-14）以及韩国首尔市峨山生命科学研究所基金（2014-464）资助。

1. 细胞系
<ol>
	<li>在37 °C、5% CO2 培养箱中，使用支气管上皮细胞生长培养基（BEGM），将106个端粒酶永生化的人角膜上皮细胞（HCECs）接种于6孔板中（密度：1039.9 个细胞/mm2），培养至细胞融合度达到95%。</li>
</ol>
2. 建立上皮划痕伤口后的蛋白质印迹分析
<ol>
	<li>在生物安全柜（II级，A2型）中，用无菌的200 µl移液枪头在汇合培养的人角膜上皮细胞（HCEC）培养板孔表面划线，每皿划四次，并将HCEC分别在37 °C、5% CO2的培养箱中孵育1、5、10、30、60和120分钟。</li>
	<li>根据角膜上皮损伤后的不同孵育时间，使用一个6孔板处理六个不同的样本。</li>
	<li>用1× PBS清洗受损的HCEC单层细胞三次，然后向每个孔中加入2.0 ml BEGM培养基。</li>
	<li>每孔加入2 ml 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化5分钟，将细胞悬液转移至15 ml离心管中，在900 × g下离心5分钟，并用1 ml移液枪吸除胰蛋白酶-EDTA溶液。</li>
	<li>用1 ml 1× PBS重悬HCEC，并将其转移至1.5 ml离心管中。</li>
	<li>在10,000 × g下离心15秒，用1 ml移液枪吸除1× PBS。</li>
	<li>将HCEC重悬于100 µl预冷的裂解缓冲液中（10 mM Tris，10 mM NaCl，2 mM EDTA，25 mM NaF，2 mM Na3VO4，1 mM苯甲基磺酰氟[PMSF]，蛋白酶抑制剂[1 µM pepstatin A，1 µM亮抑酶肽，0.1 µM抑肽酶]，以及0.5% Triton X-100 [pH 7]），并充分混匀。</li>
	<li>将细胞在冰上孵育30分钟以诱导细胞裂解。</li>
	<li>在4 °C、10,000 × g条件下离心裂解物15分钟，然后将上清液转移至新的1.5 ml离心管中（每份90 µl），并于-80 °C保存。</li>
	<li>使用Bradford蛋白定量法测定细胞裂解物的总蛋白浓度。9</li>
	<li>将30 µg总细胞蛋白上样至10%或12%丙烯酰胺凝胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），随后在4 °C条件下以200 mA电流电泳1小时，将分离的蛋白条带转移至硝酸纤维素膜，用于后续Western blot分析。</li>
	<li>用含5%脱脂奶粉的Tris-缓冲盐水吐温20（TBST）溶液封闭硝酸纤维素膜1小时；然后在含5%牛血清白蛋白（BSA）的溶液中加入针对非磷酸化HSP27的一抗（兔多克隆抗体，1:1,000稀释）或针对磷酸化HSP27的一抗（兔多克隆抗体，1:1,000稀释），在摇床上4 °C孵育过夜。</li>
	<li>用TBST洗涤膜三次，每次10分钟，然后在含5% BSA的溶液中加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1:10,000稀释），进行免疫反应条带检测。</li>
	<li>将膜在Western blot发光底物（每张10 cm × 5 cm膜使用6–7 ml）中室温孵育1分钟。</li>
	<li>将膜从试剂溶液中取出，用吸水纸吸去多余液体，并放入塑料膜保护袋中。</li>
	<li>在暗室安全灯下，将包被好的膜放入胶片暗盒中，确保蛋白面朝上。</li>
	<li>将X光胶片覆盖于膜上，曝光1分钟。</li>
</ol>
3. siRNA 转染实验10
<ol>
	<li>将HCEC细胞以每孔5×105个细胞的密度接种于6孔板中，在37 °C、5% CO2的培养箱中使用BEGM培养基培养，直至细胞融合度达到95%。</li>
	<li>用100 µl低血清培养基稀释转染试剂（2.5或7.5 µl），使稀释倍数为41或14.3；同时将HSP27特异性siRNA和乱序对照siRNA分别溶于100 µl低血清培养基中，配制成终浓度为10或50 nM的HSP27特异性siRNA和乱序对照siRNA溶液。</li>
	<li>取100 µl siRNA溶液与100 µl稀释后的转染试剂按1:1比例混合，室温孵育15分钟。</li>
	<li>将siRNA-脂质复合物加入细胞中，4小时后更换为完全BEGM培养基，并在37 °C继续培养细胞2天。</li>
	<li>按照第4.1至4.7节所述方法，通过蛋白质印迹法分析转染后的细胞。</li>
</ol>
4. 针对siRNA转染细胞的蛋白质印迹分析11
<ol>
	<li>在生物安全柜中，使用 100 µl 冰冷裂解缓冲液（10 mM Tris、10 mM NaCl、2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）、25 mM NaF、2 mM Na3VO4、1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）、蛋白酶抑制剂和 0.5% Triton X-100，pH 7）提取转染了 HSP27 特异性 siRNA 和阴性对照 siRNA 的 HCEC。</li>
	<li>将细胞在冰上孵育 30 分钟以诱导细胞裂解。</li>
	<li>在 10,000 × g 离心 15 分钟后收集裂解物沉淀，将上清液转移至新的 1.5 ml 离心管中（每份 90 µl），并于 -80 °C 保存。</li>
	<li>使用 Bradford 蛋白质测定法测定细胞裂解物的蛋白浓度。9</li>
	<li>将含有等量总细胞蛋白的样品上样至 10% 或 12% 丙烯酰胺凝胶，进行 SDS-PAGE 电泳，并在 4 °C 条件下以 200 mA 电流将分离的蛋白条带电转移至硝酸纤维素膜 1 小时，用于后续 Western 印迹分析。</li>
	<li>用含 5% 脱脂奶粉的吐温-20 三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBST）在室温封闭硝酸纤维素膜 1 小时，然后加入针对磷酸化与非磷酸化 HSP27（1:1,000 稀释）、磷酸化 Akt（1:1,000 稀释）、非磷酸化 Akt（1:1,000 稀释，作为细胞存活标志物）、Bcl-2 相关 X 蛋白（1:1,000 稀释，作为促凋亡蛋白）以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH；1:200 稀释，作为上样对照）的一抗，溶于 5% 牛血清白蛋白（BSA）中，在 4 °C 摇床上孵育过夜。</li>
	<li>用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟，随后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体（1:10,000 稀释），溶于 5% BSA 中，检测免疫反应性条带。</li>
	<li>将膜在 Western 印迹发光试剂（每 10 cm × 5 cm 膜使用 6–7 ml）中室温孵育 1 分钟。</li>
	<li>从试剂溶液中取出膜，用吸水纸吸去多余液体，并将其放入塑料保护膜中。</li>
	<li>在暗室安全灯下，将包覆好的膜放入胶片暗盒中，使蛋白面朝上。</li>
	<li>将 X 光胶片置于膜上方，曝光 1 分钟。</li>
</ol>
5. 划痕诱导的定向损伤检测法评估细胞迁移12
<ol>
	<li>在生物安全柜中，用无菌移液器吸头在转染了HSP27特异性siRNA或乱序对照siRNA的HCEC融合培养细胞的孔表面划线，制造伤口。</li>
	<li>损伤后立即用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，并将细胞置于37 °C、5% CO₂培养箱中的BEGM培养基中继续培养。2 损伤后在培养箱中孵育24小时。</li>
	<li>使用直立显微镜在划痕后24小时以100倍放大倍数拍摄HCEC图像，并利用滤镜进行背景平整处理 图像分析软件中的命令。</li>
	<li>使用“选择测量”命令，以相同尺寸的多边形定义兴趣区域（AOI），该多边形应能垂直覆盖初始伤口的整个长度，且在每个样本的损伤区域中确定三个不同的兴趣区域（AOI）。</li>
	<li>使用“计数/尺寸测量”菜单选项自动统计每个视野中的细胞数量。</li>
</ol>
6. 凋亡的流式细胞术分析
<ol>
	<li>将转染HSP27特异性siRNA和对照siRNA的HCEC细胞（每孔含10 nM siRNA）以5×105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，在含5% CO2的37 °C培养箱中用BEGM培养基培养，直至细胞融合度达到95%。</li>
	<li>每孔加入2 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化5分钟，将细胞悬液转移至15 ml离心管中，以900 × g离心5分钟，并用1 ml移液器吸除胰蛋白酶-EDTA溶液。</li>
	<li>用预冷的PBS洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于1×结合缓冲液（0.1 M HEPES/NaOH [pH 7.4]、1.4 M NaCl和25 mM CaCl2）中，调整细胞浓度为106个细胞/ml。</li>
	<li>取100 µl细胞悬液（含1 × 105个细胞）转移至5 ml培养管中。</li>
	<li>加入5 µl异硫氰酸荧光素标记的Annexin V和5 µl碘化丙啶。</li>
	<li>轻轻涡旋混匀细胞，于室温避光孵育15分钟。</li>
	<li>每管加入200 µl 1×结合缓冲液，并在1小时内使用流式细胞仪进行分析。</li>
</ol>

<ol><li>Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Corneal epithelial wound healing.</a> Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).</li>
<li>Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+shed+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in shed human corneal cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).</li>
<li>Guay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+actin+filament+dynamics+by+p38+map+kinase-mediated+phosphorylation+of+heat+shock+protein+27%5BTitle%5D)+AND+%22J.+cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27.</a> J. cell. Sci. 110, Pt 3 357-368 (1997).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+heat+shock+protein+mRNAs+under+in+vivo+glutathione+depletion+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina.</a> Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).</li>
<li>Rane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+controls+apoptosis+by+regulating+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation.</a> J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).</li>
<li>Shin, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+tumor+cell+migration+and+invasion+with+biphenyl+isoxazole+derivative+KRIBB3%2C+a+synthetic+molecule+that+inhibits+Hsp27+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation.</a> J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+phosphorylated+heat+shock+protein+27+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing.</a> Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).</li>
<li>Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+profiles+in+HeLa+cells+in+response+to+overexpression+or+siRNA-mediated+depletion+of+NASP%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45(2009).</li>
<li>Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+prostaglandin+analogues+on+tear+proteomics+and+expression+of+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+in+the+conjunctiva+and+corea%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea.</a> Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).</li>
<li>Voegeli, T. S., Currie, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+knocks+down+Hsp27+and+increases+angiotensin+II-induced+phosphorylated+NF-kappaB+p65+levels+in+aortic+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells.</a> Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).</li>
<li>Shi, B., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenite+pre-conditioning+reduces+UVB-induced+apoptosis+in+corneal+epithelial+cells+through+the+anti-apoptotic+activity+of+27+kDa+heat+shock+protein+%28HSP27%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27).</a> J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).</li>
<li>Shen, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+corneal+epitheliotrophic+capacity+among+different+human+blood-derived+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations.</a> Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).</li>
<li>Song, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+phosphorylation+is+involved+in+epithelial+cell+apoptosis+as+well+as+epithelial+migration+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing.</a> Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).</li>
</ol>

作者声明在本研究中提到的任何材料或方法均无财务或所有权利益。

在本研究中，我们利用角膜上皮损伤模型评估了HSP27的潜在作用 体外 方法。关键步骤包括使用siRNA转染以敲低HSP27，从而观察HSP27在应激细胞中的功能。值得注意的是，这些实验揭示了HSP27在角膜上皮损伤修复过程中对上皮细胞迁移和凋亡的作用。与以往研究不同10 使用针对大鼠HSP27特异性siRNA转染血管平滑肌细胞的方法，我们采用siRNA转染技术对人角膜内皮细胞（CECs）进行基因表达修饰，有效敲低HSP27特异性基因表达，以研究HSP27的功能。尽管我们在靶序列、细胞密度、终末siRNA浓度及孵育时间等方面存在差异，但仍严格遵循制造商推荐的实验方案。在替代方法方面，可使用HSP27基因敲除小鼠模型，以验证HSP27磷酸化是否参与上皮细胞迁移和细胞凋亡过程。然而，在小鼠模型中监测HSP27磷酸化变化较为困难，因其磷酸化仅在上皮损伤修复的极短时间内发生。
本研究存在若干局限性。首先， 体外 我们培养人角膜内皮细胞（CECs）的环境显然不同于 体内 人类角膜内皮细胞生存环境的影响。其次，本研究中使...

角膜上皮细胞（CECs）会持续脱落进入泪膜，同时由角膜缘和角膜上皮基底层的细胞不断补充。1 多种外源性应激因素可诱导角膜内皮细胞（CECs）的凋亡与脱落。2 热休克蛋白（HSPs）具有高度保守性，可根据分子大小分为两个家族。3 最大的热休克蛋白家族包括 HSP90、HSP70 和 HSP60，较小的家族包括 HSP27。4 HSP27的磷酸化在细胞存活中起重要作用，并因其在肌动蛋白重塑中的作用而成为细胞迁移所必需的过程。5-7 因此，我们尝试检测HSP27磷酸化在CEC迁移和凋亡中的潜在作用 体外 上皮伤口愈合模型
利用小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）的RNA干扰（RNAi）技术在基础生物学和应用生物学领域均引起了广泛关注，因为它有望实现对任意目标基因表达的抑制。8 本研究中，我们采用特异性靶向HSP27的siRNA，评估HSP27在角膜内皮细胞（CEC）伤口愈合及细胞凋亡过程中的作用。传统的细胞基因沉默RNAi方法通常使用合成的RNA双链体，包括两条未经修饰的21个核苷酸长度的寡核苷酸，可退火形成siRNA。本研究所采用的RNAi siRNA是一种简便且高效的细胞转染方法，该试剂适用于多种永生化细胞系。在本研究中，我们展示了相关分析所采用的技术方法，包括划痕诱导的定向伤口愈合实验、蛋白质印迹（western blotting）、siRNA转染实验、免疫荧光染色以及流式细胞术。

<table><tbody><tr><td>生物安全柜</td><td>CHC LAB Co.Ltd,&amp;nbsp; 大田，大韩民国&amp;nbsp;</td><td>CHC-777A2-06</td><td>II级，A2型&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Stealth RNAi&amp;trade; siRNA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td></td><td>RNAi siRNA；随机对照siRNA和HSP27特异性siRNA</td></tr><tr><td>BEGM&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>Lonza, Inc.，马里兰州沃克维尔</td><td>CC-3171, CC4175</td><td>支气管上皮细胞生长培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.，密苏里州圣路易斯</td><td>P8340 ,P7626</td><td>1 &amp;#956;M Pepstatin A，1 &amp;#956;M Leupeptin，0.1 &amp;#956;M Aprotinin</td></tr><tr><td>Bradford蛋白测定&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories，加利福尼亚州赫克力士</td><td>#500-0001</td><td>Bradford蛋白测定&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>硝酸纤维素滤膜&amp;nbsp;</td><td>Amersham，英国小查尔方特</td><td>RPN3032D</td><td>Western印迹膜</td></tr><tr><td>非磷酸化HSP27&amp;nbsp;</td><td>Abcam Inc.，马萨诸塞州剑桥</td><td>ab12351</td><td>1:1,000稀释（总HSP27）</td></tr><tr><td>磷酸化HSP27（Ser85）</td><td>Abcam Inc.，马萨诸塞州剑桥</td><td>ab5594</td><td>1:1,000稀释，HSP27在Ser85位点发生磷酸化</td></tr><tr><td>Lipofectamine&lt;sup&gt;&amp;reg; &lt;/sup&gt;RNAiMAX转染试剂&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德</td><td>13-778-075</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>磷酸化Akt（Ser473）</td><td>Cell Signaling Technology，马萨诸塞州丹弗斯</td><td>No. 4060</td><td>1:1,000稀释，Akt在Ser473位点发生磷酸化（细胞存活标志物）</td></tr><tr><td>非磷酸化Akt&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology，马萨诸塞州丹弗斯</td><td>No. 4061</td><td>1:1,000稀释（总Akt）</td></tr><tr><td>Bcl-2相关X蛋白&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology，马萨诸塞州丹弗斯</td><td>No. 4062</td><td>1:1,000（抗凋亡蛋白标志物）</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Santa Cruz Biotechnology，加利福尼亚州圣克鲁兹</td><td>No. 4063</td><td>1:1,000上样对照标志物（看家基因）</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>NCI1460KR</td><td>1:10,000稀释</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德</td><td>31985</td><td>用于转染的低血清培养基</td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td>Olympus, Inc.，日本东京</td><td>Image-Pro Plus 5.0</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG，德国卡尔斯鲁厄</td><td>T145.2</td><td></td></tr><tr><td>Tris&amp;nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc.，俄亥俄州索伦</td><td>No-0497</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠&amp;nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc.，俄亥俄州索伦</td><td>No-0241</td><td></td></tr><tr><td>六孔培养板</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>140675</td><td>每孔直径35.00 mm</td></tr><tr><td>24孔培养皿</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>N-Bioteck, Inc.，韩国首尔</td><td>NB1015</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Santa Cruz Biotechnology，加利福尼亚州圣克鲁兹</td><td>sc-2323&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BDFACSCanto&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; II</td><td>BD Biosciences，新泽西州富兰克林湖</td><td></td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>X射线胶片</td><td>Kodak，纽约州罗切斯特</td><td></td><td>带绿色400荧光屏的医用X射线暗盒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Western印迹发光试剂（luminol）</td><td>Santa Cruz Biotechnology，加利福尼亚州圣克鲁兹</td><td>sc-2048&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V细胞凋亡检测试剂盒I</td><td>BD Biosciences，新泽西州富兰克林湖</td><td>556547</td><td></td></tr></tbody></table>

基于rna干扰的热休克蛋白27在角膜上皮伤口愈合过程中功能的研究

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

小干扰RNA（siRNA）是RNA干扰技术中最常用的方法之一，可用于短期沉默蛋白质编码基因。siRNA是一种人工合成的RNA双链，可特异性靶向mRNA转录本并诱导其降解，已被广泛用于揭示多种细胞过程中的新信号通路。目前关于磷酸化热休克蛋白27（HSP27）在角膜上皮损伤修复中作用的研究报道较少。本文中，将培养的人角膜上皮细胞分为两组：一组转染随机对照siRNA，另一组转染HSP27特异性siRNA。随后进行划痕诱导的定向损伤实验、蛋白质印迹分析（Western blotting）以及流式细胞术检测。我们得出结论：HSP27在角膜上皮损伤修复过程中发挥作用，可能涉及上皮细胞的凋亡与迁移。本文提供了样本制备及研究方案的逐步详细说明。

与未划痕损伤的HCECs相比，划痕损伤后5、10和30分钟时磷酸化HSP27的表达显著增加13。Western印迹分析显示，在转染HSP27特异性siRNA的HCECs中，磷酸化HSP27和磷酸化Akt的表达均显著降低，而Bax的表达则显著升高（图1A-E）。与转染对照siRNA的细胞相比，转染10 nM和50 nM HSP27特异性siRNA的细胞中磷酸化HSP27的表达分别减少了30%和40%，但对照组中磷酸化HSP27的表达未见降低（图1A-B）。此外，转染10 nM和50 nM HSP27特异性siRNA的细胞中非磷酸化HSP27的表达分别减少了20%和30%，而对照组中非磷酸化HSP27的表达未见减少（图1A和C）。
划痕诱导的定向损伤实验表明，在损伤后24小时，转染了特异性针对HSP2...

本文介绍了一种利用热休克蛋白27（HSP27）特异性小干扰RNA评估HSP27在角膜上皮伤口愈合过程中功能的实验方案。RNA干扰是研究多种细胞类型中蛋白质功能时，有效敲低基因表达的最佳方法。

基于RNA干扰的热休克蛋白27在角膜上皮伤口愈合过程中功能的研究

小干扰RNA（siRNA）是用于短期沉默蛋白质编码基因的最广泛应用的RNA干扰方法之一。siRNA是一种……

本RNA转染实验的总体目标是利用HSP27特异性的小干扰RNA，评估HSP27在角膜上皮伤口愈合过程中的潜在作用。该方法有助于解答关于热休克蛋白27在上皮伤口愈合过程中功能的关键问题。该技术的主要优势在于，小干扰RNA是一种特异性设计的RNA分子，可靶向特定的信使RNA转录本并诱导其降解。该技术已被用于鉴定新型害虫在多种细胞过程中的作用。尽管此方法可为角膜上皮损伤修复提供深入见解，但也可能适用于其他系统，如皮肤和黏膜。本实验操作将由我实验室的技术员 Soon-Suk Kang 演示。开始本实验时，将人角膜上皮细胞在六孔板中用支气管上皮细胞生长培养基于37°C、5%二氧化碳条件下培养，直至细胞融合度达到95%。接着，将2.5微升或7.5微升转染试剂用100微升低血清培养基稀释，用于转染。然后，将HSP27特异性siRNA和乱序对照siRNA分别溶解于100微升低血清培养基中，配制成终浓度分别为10纳摩尔的HSP27特异性siRNA和15纳摩尔的乱序对照siRNA。随后，将100 µL siRNA溶液与100 µL稀释的转染试剂混合，在室温下孵育15分钟。接着，将siRNA脂质复合物加入细胞中。孵育4小时后，更换为完全支气管上皮生长培养基，并在37°C下继续孵育细胞2天，然后进行Western blot分析。在此步骤中，于生物安全柜内使用 100 微升冰预冷的裂解缓冲液提取转染了 HSP27 特异性 siRNA 和乱序对照 siRNA 的 HCEC。然后将细胞在冰上孵育 30 分钟以诱导细胞裂解。接着，将裂解物在 10,000 × g 离心 15 分钟。随后，将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，并于-80摄氏度保存。之后，使用Bradford蛋白测定法测定细胞裂解物的蛋白浓度。然后，将含有等量总细胞蛋白的样品上样至10%或12%的丙烯酰胺凝胶中。将凝胶进行SDS-PAGE电泳，并在4°C条件下以200毫安电流将分离的蛋白质条带电泳转移至硝酸纤维素膜上，持续1小时。随后，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液在室温下封闭硝酸纤维素膜1小时。然后加入一抗，于4°C摇床孵育过夜。第二天，用 TBST 清洗膜三次，每次十分钟。然后使用含 5% BSA 的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体检测免疫反应性条带。随后，将膜在室温下与 Western 印迹发光试剂（luminol reagents）孵育一分钟。从试剂溶液中取出膜，用吸水纸巾吸去多余液体，然后将其放入塑料保护膜袋中。随后，将带有保护膜的膜放入胶片暗盒中，确保蛋白面朝上。将X射线胶片置于膜上，曝光一分钟。在生物安全柜中，用无菌移液器吸头在转染了HSP27特异性siRNA或乱序对照siRNA的HCEC融合培养层上划线制造伤口。划伤后立即用1×PBS洗涤细胞两次，并将其置于支气管上皮细胞生长培养基中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时。损伤后24小时，使用直立显微镜在100倍下拍摄HCEC图像，并利用图像分析软件中的滤镜命令进行背景平整。使用“选择测量”命令，以相同大小的多边形定义感兴趣区域，该多边形应能垂直覆盖初始伤口的整个长度。然后，在每个样本的损伤区域中确定三个不同的感兴趣区域。使用计数大小测量菜单选项自动统计每个视野中的细胞数量。此处展示的蛋白质印迹分析结果显示，在转染了HSP27特异性siRNA的HCEC中，磷酸化HSP27和磷酸化Akt的表达均显著降低，而Bax的表达则显著升高。与转染对照siRNA的细胞相比，转染10纳摩尔和15纳摩尔HSP27特异性siRNA的细胞中，磷酸化HSP27的表达分别减少了30%和40%。此外，在转染10纳摩尔和15纳摩尔HSP27特异性siRNA的细胞中，非磷酸化HSP27的表达分别减少了20%和30%。划痕诱导的定向伤口实验表明，损伤后24小时，转染10纳摩尔和15纳摩尔HSP27特异性siRNA的细胞迁移能力降低。此外，与转染乱序对照 siRNA 的细胞相比，转染 HSP27 特异性 siRNA 的 HCEC 细胞表现出更多的凋亡和坏死性细胞死亡，流式细胞术结果证实了这一点。一旦掌握 RNA 转染技术，若操作得当，可在 24 小时内完成。通过执行这些步骤，可构建类似锁口的模型，以进一步探究热休克蛋白 27 在角膜上皮伤口愈合中的初始功能。观看本视频后，您应能够充分了解如何使用热休克蛋白27特异性的小干扰RNA来评估热休克蛋白27在角膜上皮伤口愈合中的潜在作用。请务必注意，操作小干扰RNA及相关试剂可能存在危险，进行这些实验操作时应始终使用生物安全柜和防护面罩等防护设备。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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