间隙连接通讯:天然产物的生物标志物的功能，以评估毒物和毒素的不利影响，以及健康的益处
2016年12月25日
本协议描述，通过间隙连接通道测量细胞间通讯手术刀装载荧光染料转移技术。间隙连接通讯是一个主要的细胞过程，其中组织稳态维持这种细胞信号中断了不良的健康影响。
总体目标是提供一种简单的检测方法，以测量通过哺乳动物细胞群的间隙连接细胞间通讯，从而满足广泛的体外药理学和毒理学需求。这种方法可以帮助回答毒理学领域的关键问题，例如化合物是否通过调节间隙连接细胞间通讯来影响组织的发育或维持。该技术的主要优点是，它可以简单快速地评估大量细胞中响应毒物和毒素的间隙连接功能。
演示该程序的是我实验室的本科生研究助理 Ajna Uzuni。开始实验时，将 3 次 10 至 5 个 WB-F344 大鼠肝上皮细胞接种到直径为 35 毫米的培养板上，该培养板上含有 Eagle 改良培养基和 5% 胎牛血清。在培养箱中培养细胞，直到它们达到 100% 汇合，并继续对细胞进行实验处理。
为了继续进行剂量反应实验，将 10 μL 和 20 μL 先前制备的 2 毫摩尔菲 100% 乙腈储备液，以及 4 μL、6 μL 和 8 μL 20 毫摩尔菲 100% 乙腈储备液加入三板细胞中，每增加 2 mL 生长培养基储备液。接下来，将 4 μL、6 μL、8 μL、10 μL 和 20 μL 的 100% 乙腈溶液加入到三板细胞中，每增加一体积的乙腈溶液含有 2 mL 生长培养基，作为载体对照。加入乙腈后，孵育板。
为了进行时间响应实验，将 7 微升 20 毫摩尔菲的 100% 乙腈储备液加入到三块细胞板中，每个时间点含有 2 毫升生长培养基。然后，向三板细胞中加入 7 微升 100% 乙腈，每个时间点含有 2 毫升生长培养基，作为载体对照。孵育每个指定时间点的板。
轻轻倒出培养基，丢弃培养基。用 3 mL PBS 冲洗细胞，并在两次冲洗之间倾析或吸出。将溶解在 PBS 中的 1 毫升每毫升 1 毫克荧光素黄染料移液到每个细胞板中。
用食指和拇指捏住手术刀，将染料预加载到细胞中。将手术刀垂直于培养板边缘并距培养板边缘 5 毫米，然后利用重力让手术刀从该垂直角度轻轻滚动至 15 度角。将刀片滚动穿过整个板的三个不同区域的细胞群。
接下来，将细胞与 LY 溶液在室温下孵育 3 分钟。倒出或吸出 LY 并冲洗细胞以去除所有细胞外染料并消除细胞外背景荧光。然后，加入 0.5 毫升 4% 磷酸盐缓冲福尔马林溶液以固定细胞。
使用落射荧光显微镜以 200 倍放大倍率观察固定细胞。对齐所有板，使压痕线平行于水平视野。生成了用递增剂量的菲处理的 WB-F344 大鼠肝上皮细胞的一系列 SL-DT 图像。
荧光素黄荧光染料迁移的减少是由菲剂量增加引起的，表明毒物诱导的间隙连接细胞间通讯 （GJIC） 的抑制作用增加。对从 SL-DT 图像获得的对照分数或 FOC 值进行平均，进行统计分析，然后绘制成图表。按照此程序，可以执行其他方法，例如单个转导蛋白的蛋白质印迹，以回答其他问题。
比如，这些化合物是否激活了细胞穿孔的促有丝分裂事件？
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概述
本方案描述了一种使用刀片加载-荧光染料转移的技术，用于检测通过间隙连接通道的细胞间通讯。该方法提供了一种简单的检测手段，用于评估哺乳动物细胞中的间隙连接性细胞间通讯，这对于理解组织稳态至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 毒理学
背景
- 间隙连接细胞间通讯对于维持组织稳态至关重要。
- 这种通讯的中断可能导致不良的健康效应。
- 该技术可实现对间隙连接功能的快速评估。
- 可广泛应用于多种药理学和毒理学研究中。
研究目的
- 检测化合物对间隙连接细胞间通讯的影响。
- 提供一种评估组织发育与维持的可靠方法。
- 促进毒理学研究中关于毒素对细胞通讯影响的研究。
使用的方法
- 将 WB-F344 大鼠肝上皮细胞接种于培养板中。
- 培养细胞至达到 100% 汇合度。
- 对细胞施加实验处理。
- 利用荧光染料转移法评估细胞间通讯。
主要结果
- 该技术可用于评估大细胞群体中的间隙连接功能。
- 可揭示毒性物质对细胞间通讯的影响机制。
- 已在多种体外研究中证明其有效性。
- 快速简便的实验方案提高了研究效率。
结论
- 该方法是毒理学研究中的重要工具。
- 它有助于理解缝隙连接在组织健康中的作用。
- 未来的研究可进一步拓展其在药理学中的应用。
常见问题
行业重要性概述
间隙连接细胞间通讯（GJIC）可作为功能性生物标志物，用于评估毒性物质对组织稳态的破坏作用，并评价天然产物的保护效应。刀片划痕-荧光染料转移（SL-DT）技术能够实现对GJIC抑制作用的快速、群体水平评估，有助于在早期发现阶段进行机制性风险排除。该检测方法可根据化合物对器官功能相关细胞通讯通路的影响，提供可靠的预测依据，从而优先筛选候选化合物。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过将化合物暴露与间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）功能障碍联系起来，探究毒性作用机制，从而验证治疗假说。
- 操作价值：通过直接测量活细胞群体中细胞间通道的功能活性，实现功能靶点的有效验证。
- 预测价值：通过识别对组织维持和稳态产生不良影响的早期生物标志物，支持研发项目的优先级筛选。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过建立间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）功能的基础水平，为后续实验流程提供经过验证的生物系统。
- 操作价值：提供可标准化的、定量的染料转移读数，适用于自动化操作和高通量成像分析。
- 可扩展性：可适用于体内组织切片，并可用于自动荧光显微镜检测，以提高样本通量。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过跨物种保守的间隙连接细胞间通讯（GJIC）机制，将发现阶段的研究结果与临床前验证相连接。
- 机制性风险降低：明确所观察到的表型是否源于细胞间通讯受阻，而非脱靶效应。
- 基于风险的决策：通过量化GJIC调节中的构效关系，为推进研发的决策标准提供依据。
流程与工作流整合
SL-DT 检测作为一种发现阶段的工具，用于提供机制性见解，在先导化合物优化之前用于筛选具有高组织破坏风险的化合物。
- Discovery Biology：通过量化毒物或天然产物如何改变细胞间信号网络，支持假设验证。
- Screening：提供可重复的、基于群体的功能性读数，反映组织水平的通讯，实现检测就绪。
- Analytics：生成对照分数（FOC）值，支持在不同剂量和时间点之间进行统计学比较。
- Translational Research：通过将间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）功能与临床前模型中的组织完整性结果相关联，与生物标志物策略保持一致。
- Enterprise Reuse：作为可重复使用的平台，广泛应用于毒理学、药理学和营养保健品开发项目中。
运营与企业影响
- 科学价值：通过直接检测缝隙连接通道活性的功能性读数，减少机制上的不确定性。
- 操作价值：采用简单的刀片加载和固定终点成像，确保实验的标准化与可重复性。
- 战略价值：通过将早期间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）干扰与后续不良组织效应相关联，提升“进行/不进行”决策的准确性。
- 组合影响：通过识别能够维持细胞间通讯稳态的化合物，实现基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备细胞培养、荧光染料操作和落射荧光显微镜方面的专业知识。
- 依赖于标准化的手术刀操作技术和一致的孵育时间，以确保染料传递的可靠性。
- 需要团队之间就图像分析的阈值和形态测量参数达成共识。
- 通过优化染料加载和固定参数，可适用于多种哺乳动物细胞类型和组织切片。
- 仅限于评估通道功能活性，无法区分连接蛋白的表达、磷酸化状态或门控状态。
