使用新型不溶性生色底物检测试剂盒碳水化合物降解酶的高通量筛选

该显色测定的总体目标是针对选定的不同显色底物以高通量形式筛选各种酶。这种方法可以帮助回答酶发现领域的关键问题，例如寻找用于生物质降解的新酶活性。该技术的主要优点是显色底物有四种不同的颜色可供选择，使该技术具有高通量、极其可靠且具有成本效益。

首先，通过向每个孔中加入 200 微升活化溶液来激活 96 孔过滤测定试剂盒板。在室温下孵育 10 分钟，不要搅拌。使用离心机和任何标准 96 孔板进行收集。

要离心现有的活化溶液，向显色聚合物水凝胶或 CPH 底物中加入 100 微升无菌水，然后施加真空或离心以去除稳定剂。再重复洗涤两次。为了制备酶反应，向检测试剂盒板的每个孔中加入 150 μL 100 mM 乙酸钠缓冲液（pH 值为 4.5）和 5 μL 三种不同浓度的纤维素内切酶溶液。

将产品板放在检测试剂盒板下方，以收集振荡过程中反应板的任何潜在泄漏。然后将检测试剂盒板在室温下置于卧式摇床中以 100 rpm 的速度孵育 30 分钟。为了获得可靠的数据，有必要在孵育过程中搅拌反应混合物。

将检测试剂盒板及其下方的产品板放入离心机中，并以 2， 700 x g 的速度旋转 10 分钟。将反应产物转移到产物板的孔中。离心后，目视检查产品板，检查每个孔中的液体体积是否大致相同。

使用读板器，读取不同绿色 CPH 底物在 630 nm 处的收集板的吸光度。根据文本协议分析和绘制数据。要使用红色不溶性显色生物质或 ICB-小麦秸秆进行显色测定，首先在测定板的每个孔中加入 200 微升活化溶液。

然后，将板在室温下孵育 10 分钟，不要搅拌。使用 100 微升无菌水清洗孔 3 次，去除稳定剂。然后，加入 150 微升 100 mM 乙酸钠缓冲液 pH 4.5 和 5 微升 10 单位/毫升的不同内切木聚糖酶溶液。

将产品板放置在基板下方，以收集振荡过程中基板的任何潜在泄漏。在室温下以 100 rpm 的转速孵育反应物 2 小时。孵育后，将检测试剂盒板及其下方的产品板放入离心机中，并以 2， 700 x g 的速度旋转 10 分钟，以将反应产物转移到产品板的孔中。

检查每个孔中的液体体积是否大致相同。然后，使用读板器读取红色 ICB - 小麦秸秆在 517 nm 处的收集板的吸光度。根据文本协议进行数据分析。

这里显示的是 CPH-阿拉伯木聚糖对不同浓度酶的木聚糖酶的剂量反应的实例，其中可以直观地观察到酶浓度的降低。使用更详细的分光光度定量来绘制吸光度与酶浓度的关系图。与信号强度相对应酶活性。

在这个用于酶筛选的测定示例中，针对不同的 CPH 底物测试了三种浓度的内切纤维素酶。如图所示，CPH-葡聚糖、CPH-木聚糖、CPH-木葡聚糖表现出除纤维素酶外的活性，而对 CPH-半乳甘露聚糖的活性较低。在相同条件下，用市售酶消化相同的 CPH 底物作为阳性对照。

这里的结果表明，所有底物的降解水平都随着酶浓度的增加而增加。本实验以 19 种 CPH 底物组成 5 种 ICB 底物，分析 3 种不同 pH 条件下 Phanerochaete chrysosporium 的分泌酶。P.chrysosporium 酶降解各种葡聚糖、淀粉和木聚糖。

可以检测到半纤维素阿拉伯聚糖和果胶半乳聚糖以及 RGI 的较低信号。产生的酶在酸性条件下比在中性或微碱性条件下更活跃。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在不到一个小时的时间内完成。

在尝试此程序时，请务必记住在孵育过程中混合反应物。开发后，该技术为高通量筛选领域的研究人员探索生物技术的新型酶活性铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何使用筛查试剂盒有很好的了解。