高通量筛选碳水化合物降解酶的新型不溶性显色底物检测试剂盒
2016年9月20日
一种用于酶筛选的高通量检测方法被描述。该多重即用型检测试剂盒包含预先选定的 C显色 P聚合物 H水凝胶（CPH）基质与复杂 我不溶性 C显色 B生物质（ICB）底物。靶向酶为多糖降解酶 内-酶和蛋白酶。
该显色检测方法的总体目标是以高通量形式，针对一系列不同的显色底物筛选多种酶。该方法有助于回答酶发现领域中的关键问题，例如寻找能够降解生物质的新酶活性。该技术的主要优势在于，显色底物具有四种不同的颜色，使该技术具备高通量、极高可靠性和成本效益的特点。
首先，通过向每个孔中加入 200 微升活化溶液来激活 96 孔滤膜分析试剂盒板。在室温下静置孵育 10 分钟，不进行振荡。使用离心机和任何标准的 96 孔收集板进行后续操作。
为了离心去除现有的活化溶液，向显色聚合物水凝胶（CPH）底物中加入100微升无菌水，并通过抽真空或离心去除稳定剂。重复洗涤两次。为准备酶反应，向检测试剂盒板的每个孔中加入150微升100 mM醋酸钠缓冲液（pH 4.5）以及5微升三种不同浓度的内切纤维素酶溶液。
将产品板置于检测试剂盒板下方，以收集振荡过程中反应板可能产生的泄漏液体。然后将检测试剂盒板置于水平摇床中，在室温下以100 rpm转速孵育30分钟。为获得可靠的数据，孵育期间必须对反应混合物进行振荡。
将检测试剂盒板置于产品板下方，放入离心机中，在 2,700 × g 条件下离心 10 分钟，以将反应产物转移至产品板的各孔中。离心结束后，目视检查产品板，确认每孔中的液体体积是否大致相同。
使用酶标仪，在630 nm波长下测定收集板中不同绿色CPH底物的吸光度。根据文本方案分析并绘制数据。若要使用红色不溶性显色生物质或ICB-小麦秸秆进行显色测定，首先向测定板的每个孔中加入200微升活化溶液。
然后，将酶标板在室温下静置孵育10分钟。用100微升无菌水洗涤孔三次，以去除稳定剂。随后，每孔加入150微升100 mM乙酸钠缓冲液（pH 4.5）和5微升不同浓度的内切木聚糖酶溶液（10单位/毫升）。
将产物板置于底物板下方，以收集振荡过程中底物板可能产生的泄漏液体。在室温下以100 rpm的转速孵育反应2小时。孵育结束后，将含有下方产物板的检测试剂盒板放入离心机中，以2,700 × g离心10分钟，使反应产物转移至产物板的各孔中。
检查每个孔中的液体体积是否大致相同。然后，使用酶标仪在517 nm处测定红色ICB-小麦秸秆收集板的吸光度。根据文本方案进行数据分析。
图中展示了不同酶浓度下CPH-阿拉伯木聚糖对木聚糖酶的剂量反应示例，其中可直观观察到酶浓度降低的情况。采用更详细的分光光度法定量方法，以吸光度对酶浓度作图。信号强度与酶活性相对应。
在此酶筛选实验示例中，一种内切纤维素酶在三种不同浓度下针对多种CPH底物进行了测试。如图所示，该酶对CPH-葡聚糖、CPH-木聚糖和CPH-木葡聚糖表现出除纤维素酶活性外的额外活性，而对CPH-半乳甘露聚糖仅表现出较低活性。在相同条件下，使用市售的酶作为阳性对照对相同的CPH底物进行了消化处理。
本实验结果表明，所有底物的降解程度均随酶浓度的增加而升高。在本实验中，共包含5种ICB底物和19种CPH底物，用于分析彩绒革菌（Phanerochaete chrysosporium）在三种不同pH条件下分泌的酶。P. chrysosporium 的酶可降解多种葡聚糖、淀粉和木聚糖。
半纤维素阿拉伯聚糖和果胶半乳聚糖以及RGI的信号可能较弱。所产酶在酸性条件下的活性高于中性或弱碱性条件。一旦掌握，若操作得当，该技术可在一小时之内完成。
在进行该实验操作时，重要的是要记住在孵育过程中混匀反应体系。该技术在开发完成后，将为高通量筛选领域的研究人员探索生物技术中新的酶活性提供有效途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用该筛选试剂盒。
概述
本文介绍了一种利用多重底物进行酶筛选的高通量显色检测方法。该检测试剂盒包含显色聚合物水凝胶（CPH）和不溶性显色生物质（ICB）底物，用于检测多糖降解内切酶和蛋白酶。
关键研究组成部分
科学领域
- 酶筛选
- 生物技术
- 高通量检测
背景
- 酶的发现对于包括生物质降解在内的多种应用至关重要。
- 显色底物可实现对酶活性的可视化追踪。
- 该检测方法设计可靠且成本低廉。
- 不同底物可产生多种颜色，有助于增强分析效果。
研究目的
- 建立一种针对多种底物筛选酶的方法。
- 鉴定用于降解生物质的新酶活性。
- 促进酶学研究中的高通量筛选。
使用的方法
- 使用活化溶液活化96孔滤板分析试剂盒的微孔板。
- 在受控条件下孵育酶反应体系。
- 使用离心机收集反应产物。
- 在特定波长下测定吸光度，用于数据分析。
主要结果
- 针对多种CPH和ICB底物观察到酶活性。
- 较高的酶浓度导致底物降解增加。
- 不同底物表现出不同程度的酶活性。
- 与中性或碱性条件相比，酸性条件增强了酶活性。
结论
- 该检测方法为酶的筛选提供了可靠的平台。
- 它使研究人员能够高效地探索新的酶活性。
- 掌握该技术后可在一小时内快速完成操作。
常见问题
行业高管相关性
高通量酶筛选在底物可获得性和检测可扩展性方面面临瓶颈，限制了对生物燃料、纺织和食品工业应用至关重要的碳水化合物活性酶（CAZymes）进行快速功能表征。本显色检测方法通过在96孔板中实现多重、颜色编码的底物测试，弥补了技术空白，提高了早期酶发现中的预测可靠性，并支持酶工程流程中的决策判断。该方法通过在多种多糖底物上提供定量、可重复的活性读数，增强了从靶点识别到类临床前验证的转化连续性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过将候选基因与在特定多糖底物上的生化活性相关联，实现对假定CAZymes的功能性解析。
- 操作价值：利用颜色多重化的CPH底物支持快速假设验证，在不牺牲数据可靠性的前提下提高筛选通量。
- 预测价值：通过量化剂量依赖性酶活性，有助于工业用酶开发中的机制性风险降低和靶点优先排序。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：提供可模拟复杂生物质的标准化不溶性显色底物（CPH 和 ICB），实现生理相关条件下的酶活性评估。
- 操作价值：通过标准化的活化、洗涤和离心步骤确保检测的可重复性，降低高通量工作流程中的变异度。
- 可扩展性价值：兼容标准的96孔板读数仪和液体处理系统，可整合到现有的筛选平台中，用于酶组合或发酵液的评价。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过在不同 pH 条件下检测酶活性，模拟与疾病相关的体系，反映工业过程环境。
- 操作价值：通过关联多种生物质类型（如小麦秸秆、葡聚糖、木聚糖）中酶浓度与底物降解的关系，支持基于风险评估的推进决策。
- 预测价值：通过识别对洗涤剂或生物燃料应用中制剂稳定性至关重要的 pH 依赖性活性模式，增强转化生物标志物的一致性。
流程与工作流整合
该检测适用于从早期发现到先导物鉴定的整个研究流程，可在投入蛋白质工程或发酵放大之前，支持针对碳水化合物降解酶的假设验证、通路解析和生物学风险评估。
- 发现生物学：通过针对特定多糖底物（如 CPH-葡聚糖、CPH-木聚糖）筛选酶活性，阐明代谢通路，推断底物特异性及功能作用。
- 筛选：通过在 630 nm（CPH）和 517 nm（ICB）处进行吸光度测定，提供即用型检测方法和定量输出结果，实现对酶变异体或反应条件的可靠比较。
- 分析：提供支持统计分析与阳性结果筛选的剂量-反应数据，帮助研究团队根据酶活性和特异性对候选酶进行排序。
- 转化研究：通过在工业相关条件下（如酸性 pH、复杂生物质底物）评估酶的性能，将发现研究与临床前研究的连续性相连接。
- 企业级复用：作为可重复使用的平台，适用于在生物基产业的多个项目中对酶文库、发酵液或酶组合进行高通量筛选。
运营与企业影响
- 科学价值：通过在不溶性、类天然底物上直接测量活性，减少假阳性结果，从而提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过规定试剂体积、孵育时间及离心参数，实现标准化和可重复性，最大限度降低依赖操作者的变异。
- 战略价值：通过快速筛选数百种酶候选物，减少低通量生化检测相关的时间和成本，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：生成定量活性数据，为酶工程项目的决策提供依据，支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备酶动力学和显色测定优化方面的专业知识，以确保底物制备和反应监测的准确性。
- 依赖于能够进行630 nm和517 nm吸光度检测的酶标仪，以及可兼容96孔板的离心机，用于产物转移。
- 需在不同实验团队间对缓冲条件（如乙酸钠，pH 4.5）和孵育参数（如100 rpm振荡）进行标准化，以确保实验结果的可重复性。
- 在检测非多糖类底物时需考虑方法适应性问题，因为该检测体系针对碳水化合物活性酶优化，对于其他酶类可能需要调整缓冲体系或底物条件。
- 存在一些实际限制，例如在激活和稳定步骤中需避免振荡，并在离心后通过目视确认各孔产物体积相等，以保证数据解读的可靠性。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Chromogenic Assay with CPH Substrates, Detection, and Quantification
2:41
Chromogenic Assay with Insoluble Chromogenic Biomass Substrates, Detection, and Quantification
4:15
Results: Enzymatic Degradation of Chromogenic Polymer Hydrogel Substrates
6:02
Conclusion
