Name: 使用新型不溶性生色底物检测试剂盒碳水化合物降解酶的高通量筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 了解使用新型不溶性生色底物检测试剂盒进行碳水化合物降解酶高通量筛选的方法。该技术可在96孔板中快速检测多糖降解内切酶和蛋白酶活性，为酶学研究提供可靠且经济高效的筛选平台。

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我们感谢英国利兹大学的 J. Paul Knox 教授提供了实验室用于拍摄，以及 Susan E. Marcus 提供的出色技术协助。JS 感谢 WallTraC 项目（欧盟第七框架计划（资助协议编号：263916））和“21 世纪生物质”项目（丹麦创新基金会；项目编号：103408）提供的资助。SKK 感谢 SET4Future 项目（丹麦战略研究委员会）、由丹麦战略研究委员会资助的 Bio-Value 战略项目、丹麦技术与创新委员会（资助项目编号：0603-00522B）以及“基于生物学方法解析复杂多糖系统酶解机制”项目（资助项目编号：107279）提供的经费支持。本文仅代表作者观点，欧盟对本文所含信息的任何使用不承担任何责任。

1. 采用CPH底物在96孔板中进行显色分析
<ol>
	<li>激活检测试剂盒板
	<ol>
		<li>向每孔中加入 200 µl 激活液（随试剂盒提供），以激活 96 孔过滤板（含蓝色 CPH-木聚糖）检测试剂盒板（材料列表），随后在室温下静置孵育 10 分钟，不进行振荡。</li>
		<li>使用真空 manifold（内部装有间隔块，并以任意标准透明 96 孔板作为收集板）抽真空，以去除残留的激活液。也可改用离心机，在 2,700 × g 条件下离心 10 分钟完成此步骤。</li>
		<li>通过向每孔加入 100 µl 无菌水清洗 CPH 底物，并施加真空（或离心力）以去除稳定剂。重复此步骤两次，此时板已准备就绪，可供使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酶反应 
	注意：始终设置仅含缓冲液的阴性对照，若条件允许，还应设置已知活性的酶作为阳性对照。使用适当数量的重复样本进行实验。CPH 底物在 pH 3.0 至 10.0 范围内稳定，每孔中缓冲液与酶溶液的总体积不得超过 180 µl。也可使用植物提取物或培养液代替纯化的酶溶液。
	<ol>
		<li>向检测试剂盒板的每孔中加入 150 µl 100 mM 醋酸钠缓冲液（pH 4.5）和 5 µl endo-纤维素酶溶液（终浓度为 1 U/ml）。</li>
		<li>将产品板（一种适用于微孔板读数仪的透明孔板）置于检测试剂盒板下方，用于收集反应板在振荡过程中可能渗漏的液体。</li>
		<li>将检测试剂盒板置于水平摇床中，在 25 °C 下以 150 rpm 振荡孵育 30 分钟。 
		注意：孵育期间确保检测试剂盒板内反应体系充分混合，对获得一致且可重复的结果至关重要。CPH 底物在高达 90 °C 的温度下仍保持稳定。当使用 CPH 底物检测含有未知酶浓度的培养液时，孵育时间可延长至 24 小时。需注意，合适的孵育时间取决于酶的活性水平；但通常情况下，若在 24 小时内未检测到明显活性，则表明该酶可能无法降解所测试的底物。具有活性的酶会将 CPH 底物中的不溶性显色多糖降解为可溶性显色寡糖，后者表现为有颜色的上清液。</li>
		<li>将洁净的产品板放入真空 manifold 内，并将间隔块置于其中。</li>
		<li>将检测试剂盒板置于上方，施加真空（最大负压为 -60 kPa）。也可改用离心机，在 2,700 × g 条件下离心 10 分钟。 
		注意：含有显色寡糖的滤液现已收集于产品板中，可用于后续分析8。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测与定量
	<ol>
		<li>通过肉眼观察，检查产品板各孔中液体体积是否大致相同。</li>
		<li>使用酶标仪在 595 nm 波长下测定收集板中蓝色 CPH-木聚糖的吸光度。</li>
		<li>数据分析时，从加酶孔的读数中减去仅含缓冲液的阴性对照孔的读数。根据重复孔的数据计算平均值及均值标准误（SEM）8。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 采用ICB底物的96孔显色检测法
<ol>
	<li>酶反应
	<ol>
		<li>向每孔含有红色ICB-小麦秸秆的检测试剂盒板中加入150 µl 100 mM乙酸钠缓冲液（pH 4.5）和5 µl 31 U/ml endo-木聚糖酶溶液（最终孔中酶浓度：1 U/ml）。 
		注意：检测试剂盒板（含ICB底物的96孔滤板）的制备方法如文献所述（见材料清单）。ICB底物在pH 3.0至10.0范围内的缓冲液中稳定。实验中应始终设置仅含缓冲液的阴性对照、商用酶作为阳性对照，并使用适当数量的重复孔以满足统计学要求。
		<ol>
			<li>不要像激活CPH底物板那样激活ICB底物，而是通过加入100 µl水洗涤三次，并进行真空过滤或离心，以去除稳定剂。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将产物收集板置于底物板下方，以收集在振荡过程中可能从底物板泄漏的液体。</li>
		<li>在25 °C、150 rpm振荡条件下孵育反应2小时。 
		注意：活性酶会将ICB底物中的不溶性显色多糖降解为可溶性寡糖，表现为有颜色的上清液。ICB底物在高达90 °C的温度下仍保持稳定。若使用未经纯化的酶（如培养液），应将孵育时间延长至最多24小时。</li>
		<li>将产物收集板放入真空装置内，并将间隔块置于其中。</li>
		<li>将检测试剂盒板置于上方，施加真空（最大负压-60 kPa）或使用离心机，使反应产物从检测试剂盒板过滤至产物收集板的各孔中。 
		注意：含有显色寡糖的滤液现已进入收集板，可用于后续分析8。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测与定量
	<ol>
		<li>通过肉眼观察，检查收集板各孔中液体体积是否大致相同。</li>
		<li>使用酶标仪在517 nm波长下读取收集板中红色ICB-小麦秸秆样品的吸光度。</li>
		<li>数据分析时，从加酶孔的读数中减去仅含缓冲液的阴性对照值。根据重复孔的数据计算平均值及平均值的标准误差（SEM）8。 
		注意：若用于筛选未知酶，建议进行系列稀释，以获得更详细的酶活性动态范围数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lombard, V., Ramulu, H. G., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carbohydrate-active+enzymes+database+%28CAZy%29+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D490-D495 (2014).</li>
<li>Cantarel, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Carbohydrate-Active+EnZymes+database+%28CAZy%29%3A+an+expert+resource+for+Glycogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics.</a> Nucleic Acids Res. 37, D233-D238 (2009).</li>
<li>Agblevor, F. A., Murden, A., Hames, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+of+analysis+of+biomass+sugars+using+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Improved method of analysis of biomass sugars using high-performance liquid chromatography.</a> Biotechnol. Lett. 26 (15), 1207-1211 (2004).</li>
<li>Black, G. E., Fox, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+analysis+of+sugar+monomers+from+complex+matrices+using+chromatography+in+conjunction+with+mass+spectrometry+or+stand-alone+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the analysis of sugar monomers from complex matrices using chromatography in conjunction with mass spectrometry or stand-alone tandem mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. A. 720 (1-2), 51-60 (1996).</li>
<li>Miller, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Dinitrosalicylic+Acid+Reagent+for+Determination+of+Reducing+Sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar.</a> Anal. Chem. 31, 426-428 (1959).</li>
<li>Somogyi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notes+on+Sugar+Determination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Notes on Sugar Determination.</a> J. Biol. Chem. 195 (1), 19-23 (1952).</li>
<li>Zantinge, J. L., Huang, H. C., Cheng, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+diffusion+assay+for+screening+of+beta-glucanase-producing+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Microplate diffusion assay for screening of beta-glucanase-producing microorganisms.</a> Biotechniques. 33 (4), 798(2002).</li>
<li>Kračun, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+versatile+chromogenic+substrates+for+high-throughput+analysis+of+biomass-degrading+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">A new generation of versatile chromogenic substrates for high-throughput analysis of biomass-degrading enzymes.</a> Biotechnol Biofuels. 8, (2015).</li>
<li>Leemhuis, H., Kragh, K. M., Dijkstra, B. W., Dijkhuizen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cyclodextrin+glycosyltransferase+into+a+starch+hydrolase+with+a+high+exo-specificity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering cyclodextrin glycosyltransferase into a starch hydrolase with a high exo-specificity.</a> J. Biotechnol. 103 (3), 203-212 (2003).</li>
<li>Nyyssonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+high-throughput+functional+screening+and+next+generation+sequencing+for+identification+of+plant+polymer+decomposing+enzymes+in+metagenomic+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Coupled high-throughput functional screening and next generation sequencing for identification of plant polymer decomposing enzymes in metagenomic libraries.</a> Front Microbiol. 4, 282(2013).</li>
<li>Sweeney, M. D., Xu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomass+Converting+Enzymes+as+Industrial+Biocatalysts+for+Fuels+and+Chemicals%3A+Recent+Developments%5BTitle%5D)+AND+%22Catalysts%22%5BJournal%5D)">Biomass Converting Enzymes as Industrial Biocatalysts for Fuels and Chemicals: Recent Developments.</a> Catalysts. 2 (2), 244-263 (2012).</li>
<li>Biely, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+xylan+deacetylating+enzymes+on+monoacetyl+derivatives+of+4-nitrophenyl+glycosides+of+beta-D-xylopyranose+and+alpha-L-arabinofuranose%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Action of xylan deacetylating enzymes on monoacetyl derivatives of 4-nitrophenyl glycosides of beta-D-xylopyranose and alpha-L-arabinofuranose.</a> J. Biotechnol. 151 (1), 137-142 (2011).</li>
<li>Mackenzie, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polysaccharide+utilization+locus+from+an+uncultured+bacteroidetes+phylotype+suggests+ecological+adaptation+and+substrate+versatility%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A polysaccharide utilization locus from an uncultured bacteroidetes phylotype suggests ecological adaptation and substrate versatility.</a> Appl Environ Microbiol. 81 (1), 187-195 (2015).</li>
</ol>

涉及96孔板CPH底物检测法和96孔板ICB底物检测法的两项专利申请已提交（WO2015036000和丹麦专利申请PA 2015 70311）。

我们正在使用新一代的多色CPH和ICB底物，这些底物基于氯三嗪染料（底物的完整列表见表1），并组装在一种定制设计的商用检测试剂盒中。酶对底物的消化会产生小分子、可溶性的染色产物，这些产物可在检测溶液中被检测，并可通过酶标仪进行定量9。该检测方法专为评估内切酶活性而设计，其灵敏度与使用偶氮素交联（AZCL）底物的方法相似10，而针对外切酶活性则有其他可用方法11,12。该检测试剂盒的局限性在于其仅适用于检测内切酶活性，因为CPH以及ICB底物很可能由于染料和交联分子造成的空间位阻，无法被外切酶降解8。
该实验采用96孔板进行，每个独立反应在孔中发生。反应液必须在板内充分混匀，以获得可重复的数据。反应后的上清液经滤过进入产物板，可通过吸光度光谱法定量测定每孔的吸光度。该实验的基本原理和布局如图1所示。该实验包括一个含有底物的实验板（96孔滤板），经酶孵育后，上清液被滤入透明孔板中，测定吸光度，从而对酶的特异性和活性进行半定量分析。已有研究表明，利用CPH底物的这一筛选实验也可用于琼脂平板体系，其中可溶性反应产物在过夜孵育后形成有色晕圈。8
如图2所示，该检测试剂盒可用于筛选纯化的酶及其潜在的副反应活性。副反应活性可能源于单个酶的混杂特异性，也可能由于所分析的样品是多种酶的混合物，因而需要研究它们之间的协同效应。此外，如先前研究所示，酶混合物、肠道微生物群13以及真菌的培养液8，还有内源性植物酶和细菌（未发表数据）均可作为酶的来源。
ICB底物可用于处理在生物质降解的工业过程中常遇到的复杂细胞壁组分混合物。这些底物旨在评估多糖的可及性，并为如何有效优化降解酶组合以提高降解效率提供信息。如图3所示，CPH和ICB底物可并行用于酶的筛选——从而揭示酶在偏好底物（CPH）环境以及更接近天然大分子组装结构的复杂环境（ICB，除偏好底物外还包含其他组分）中的特异性和活性信息。使用多种颜色可实现对不同底物上多种酶活性的同时检测，从而提高检测的高通量性和多重性。不同染料的光谱可通过简单的线性回归解析，大多数情况下仅通过肉眼观察即可识别多底物活性。此类实验及其结果的模拟示例如图4所示。
该检测工具箱及其应用的广泛适用性非常适用于对具有未知活性的酶和培养液进行初筛。该检测方法最重要的特点是高通量性、可定制性、操作简便性和灵活性。基于此，我们认为，这一新型工具组合将显著改进并加速工业和学术研究中的酶筛选流程。

近年来，基因组和宏基因组挖掘技术迅速发展，克隆和表达重组酶的中高通量策略也取得了显著进展。此外，生物信息学资源及相关数据库（如CAZy）1,2也大幅扩展。然而，在将微生物酶多样性应用于工业的过程中仍存在诸多挑战，酶活性的实验测定已成为当前的一大瓶颈。例如，据估计，利用现有方法，我们仅能可靠预测CAZy数据库中不超过4%的蛋白质的功能活性。尽管已有多种方法可用于监测酶活性，但这些方法均存在一定局限性。基于色谱结合质谱分析的成熟技术可用于评估糖苷水解酶（GH）活性产生的寡聚片段3,4，但这些方法操作繁琐，通量普遍较低。基于还原糖测定的方法，如二硝基水杨酸5法和Nelson-Somogyi6法，被广泛用于GH活性检测，但这些检测方法通量有限，且易受副反应干扰。个别显色性多糖底物（如偶氮蓝交联底物，AZCL）也常用于酶活性测定，但逐一采购各类底物并手动将底物粉末分配至检测板孔中，操作繁琐且成本较高7。
我们开发了一代基于氯三嗪染料的新型显色聚合物水凝胶（CPH）底物，该底物与96孔过滤板联用时可构成高通量检测系统。此外还开发了额外的不溶性显色生物质（ICB）底物，可用于评估在木质纤维素生物质等复杂聚合物混合物中底物的可及性。每种底物可呈现四种颜色之一，不同颜色的底物可在同一孔中组合使用。本方案表明，该方法可广泛应用于多种多糖和蛋白质，并可用于糖苷水解酶（GHs）、裂解性多糖单加氧酶（LPMOs）及蛋白酶的筛选。文中提供了96孔板使用的具体操作流程，代表性结果展示了CPH与ICB底物试剂盒作为酶筛选工具的高效性。
无论使用何种底物，所述检测试剂盒的一个显著优势在于，经过活化步骤后，试剂盒可在15分钟内准备就绪并投入使用。这避免了像某些其他方法那样，需要耗费时间从原始底物材料开始逐项组装检测体系7。CPH和ICB底物具有优异的储存稳定性（室温下至少可保存一年）、pH稳定性和温度稳定性8，且无需特殊设备或专业培训。CPH或ICB检测基于96孔滤板进行，在滤板中完成酶与底物的反应。如果酶对特定底物具有活性，则会生成可溶性染色寡聚物，形成有色的上清液，随后可通过真空 manifold 或离心机将该上清液过滤至标准透明96孔板中8。
底物使用在可见光谱（VIS）范围内有吸收的氯三嗪染料进行染色，如果将不同颜色（红色、蓝色、黄色和绿色）的多种CPH底物混合于同一孔中，且酶作用于不止一种底物时，可通过线性回归分辨出各自的信号。反应完成后，含有上清液的微孔板可使用标准的多功能微孔板读数仪在可见光范围内测定吸光度。将不同颜色的多种底物混合于同一孔中，可提高检测系统的通量，在96孔板中最多可完成384个实验（每孔含4种不同颜色的底物）。
CPH 底物是评估酶特异性活性的有力工具，而 ICB 底物则用于评价酶在复杂底物混合物环境中降解特定组分的能力，这种环境更接近酶在生物质中通常所遇到的情况。尽管 ICB 底物无法提供有关单个酶特异性的信息，但它们仍是评估酶、酶组合或发酵液商业性能的有效工具。

<table><tbody><tr><td>检测试剂盒板</td><td>Glycospot</td><td></td><td>定制检测试剂盒板</td></tr><tr><td>活化溶液</td><td>Glycospot</td><td></td><td>用于活化CPH底物</td></tr><tr><td>350 ml接收板间隔块（用于真空多孔板装置）</td><td>Pall Corporation</td><td>5015</td><td>间隔块</td></tr><tr><td>96孔MultiScreen HV滤膜板，0.45 &amp;micro;m，透明，非无菌</td><td>Millipore</td><td>MSHVN4510</td><td>检测板</td></tr><tr><td>96孔聚丙烯微量板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>651201</td><td>洗涤底物后的收集板</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96孔微量板</td><td>Thermo Scientific</td><td>269620</td><td>产物板</td></tr><tr><td>隔膜泵 MZ 2 NT</td><td>Vacuubrand</td><td>732000</td><td>与真空多孔板装置配合使用的真空泵</td></tr><tr><td>Infors HT Ecotron</td><td>Infors HT</td><td>4950132 (Buch &amp;amp; Holm)</td><td>水平摇床</td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Molecular Devices</td><td>10067-750 (VWR)</td><td>96孔板吸光度读数仪</td></tr><tr><td>真空多孔板装置</td><td>Pall Corporation</td><td>5017</td><td>真空多孔板装置</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;endo&lt;/em&gt;-纤维素酶（EGII）（&lt;em&gt;Trichoderma longibrachiatum&lt;/em&gt;）</td><td>Megazyme</td><td>E-CELTR</td><td>纤维素酶 [&lt;em&gt;cel&lt;/em&gt;]</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;endo&lt;/em&gt;-&amp;beta;-1,4-甘露聚糖酶（&lt;em&gt;Cellvibrio japonicus&lt;/em&gt;）&amp;nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>E-BMACJ</td><td>甘露聚糖酶 [&lt;em&gt;man&lt;/em&gt;]</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;endo&lt;/em&gt;-&amp;beta;-1,3-葡聚糖酶（&lt;em&gt;Trichoderma spp.&lt;/em&gt;）</td><td>Megazyme</td><td>E-LAMSE</td><td>&amp;beta;-葡聚糖酶 [&lt;em&gt;glu&lt;/em&gt;]</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;endo&lt;/em&gt;-&amp;beta;-1,4-D-半乳聚糖酶（&lt;em&gt;Aspergillus niger&lt;/em&gt;）&amp;nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>E-EGALN</td><td>半乳聚糖酶 [&lt;em&gt;gal&lt;/em&gt;]</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;endo&lt;/em&gt;-&amp;beta;-1,4-木聚糖酶 M4（&lt;em&gt;Aspergillus niger&lt;/em&gt;）&amp;nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>E-XYAN4</td><td>木聚糖酶 [&lt;em&gt;xyl&lt;/em&gt;]</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;endo&lt;/em&gt;-木葡聚糖酶（GH5）（&lt;em&gt;Paenibacillus sp.&lt;/em&gt;）&amp;nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>E-XEGP</td><td>木葡聚糖酶 [&lt;em&gt;xg&lt;/em&gt;]</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-淀粉酶（&lt;em&gt;Bacillus licheniformis&lt;/em&gt;）&amp;nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>E-BLAAM</td><td>淀粉酶 [&lt;em&gt;amy&lt;/em&gt;]</td></tr></tbody></table>

高通量筛选碳水化合物降解酶的新型不溶性显色底物检测试剂盒

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) 在 体内 具有多种功能，并广泛应用于生物燃料、纺织、洗涤剂、造纸和食品工业中的工业加工过程。深入理解 CAZymes 对基础生物学和工业应用均具有重要意义。自然界中存在大量 CAZymes（尤其在微生物中），已有数十万种被收录并描述于 carbohydrate active enzyme 数据库（CAZy）中。然而，假定酶的发现速度已超过我们对其活性进行生化表征的能力。造成这一现象的原因之一在于，基因组和转录组测序技术及其相关生物信息学工具的进步使得候选 CAZymes 能够被快速识别，而用于确定酶生化特性的技术发展则相对缓慢。为弥补这一技术差距，本文介绍了一种基于不溶性显色底物的新型高通量检测试剂盒。共制备了两种不同类型的底物：Chromogenic Polymer Hydrogel（CPH）底物（由纯化的多糖和蛋白质制成）和 Insoluble Chromogenic Biomass（ICB）底物（由复杂的生物质材料制成）。CPH 和 ICB 底物均以 96 孔高通量检测系统形式提供。CPH 底物可制成四种不同颜色，可混合使用，从而提高检测通量。本实验方案描述了 96 孔板检测方法，并展示了该检测方法在筛选酶、酶复合物及发酵液活性中的应用。

本实验的高通量和多重检测能力基于排列在96孔滤板中的不溶性显色聚合物（或蛋白质）水凝胶（CPH）底物。将酶及阴性对照加入检测试剂盒板中（图1A），酶会降解相应的底物，产生有色的上清液（图1B）。反应完成后，将上清液转移至透明孔的产物板中，可直接使用适用于96孔板的分光光度计测定吸光度（图1C）。
不同酶浓度（0.00 - 0.75 U/ml）下CPH-阿拉伯木聚糖对木聚糖酶的剂量反应示例见图1D，其中可直观观察到酶浓度降低的效果。可通过更详细的分光光度法定量分析，绘制吸光度与酶浓度的关系曲线（图1E）。信号强度对应于酶活性。误差棒（三次重复实验的平均值标准误，SEM）反映了该检测方法的可重复性。有关该检测方法可重复性的更详细实验已在其他文献中发表8。
<img alt="木聚糖酶检测板示意图及吸光度图；酶浓度分析设置。" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. CPH-阿拉伯木聚糖的木聚糖酶处理。 A) 检测试剂盒板的示意图，将CPH底物（例如，CPH-阿拉伯木聚糖）加入96孔滤板的孔中，随后立即加入酶1、酶2以及仅含缓冲液的对照（酶1具有内切-木聚糖酶活性）；B) 酶1降解CPH-阿拉伯木聚糖后产生有色上清液；C) 通过真空辅助过滤将上清液转移至产物板后，采用分光光度法测定吸光度；D) 产物板，显示在4种不同颜色下，以不同浓度的内切-β-1,4-木聚糖酶在100 mM醋酸钠缓冲液（pH 4.5）中于室温反应60分钟后生成的CPH-阿拉伯木聚糖反应产物；E) 使用分光光度法对D中的反应产物进行定量分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54286/54286fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在酶筛选中使用该检测方法有多种选择。一种选择是使用含有不同多糖的96孔板进行筛选， 例如， 少量（纯化的） 内-活性未知的酶。在这种情况下，结果将显示目标酶能够降解哪些多糖。为了展示这一原理，一种 内源性-纤维素酶在不同CPH底物上进行了测试 25 °C. 分别使用三种不同的酶浓度（0.5 U/ml、1.0 U/ml 和 5 U/ml）孵育 30 分钟。结果在产物板中清晰可见（图 2A）。此产品的说明书 内皮-供应商提供的纤维素酶标明对木葡聚糖（刺槐）、大麦β-葡聚糖、葡甘露聚糖、桦木木聚糖具有副反应活性，对半乳甘露聚糖具有较低的副反应活性。与此一致，该酶对CPH-β-葡聚糖（大麦）、CPH-木葡聚糖（刺槐）、CPH-木聚糖（山毛榉木）表现出除纤维素酶活性外的额外活性，对CPH-半乳甘露聚糖表现出较低活性。图2B）。未对葡甘露聚糖进行测试。在与前述实验相同的条件下，使用市售酶（三种不同酶浓度：0.1 U/ml、0.5 U/ml 和 1.0 U/ml）作为阳性对照消化相同的 CPH 底物。所有底物均被阳性对照酶降解，且信号强度随酶浓度升高而增强。图2C).
<img alt="酶活性测定，吸光度结果；纤维素、葡聚糖底物上的有色孔，内切纤维素酶。" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 八种不同的CPH底物在振荡条件下孵育 25 °C 30 分钟。 A) 不同CPH底物经消化后的产物板 内皮-纤维素酶，不同浓度。 B) 活性及多种副活性的定量分析 内皮-纤维素酶。误差线表示三次重复实验的平均值标准误。 C) 不同商业酶对相应CPH底物的活性（内切纤维素酶和2-HE-纤维素；E-LAMSE与CPH-葡聚糖、CPH-酵母聚糖、CPH-β-葡聚糖（大麦）；E-XYAN4与CPH-木聚糖；E-XEGP与CPH-木葡聚糖；E-BLAAM与CPH-直链淀粉；E-BMACJ与CPH-半乳甘露聚糖；所有酶均来自Megazyme）。误差线表示两个重复的平均值标准误。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54286/54286fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
不溶性显色生物质（ICB）底物是对显色底物体系的有益补充，因为它们在一定程度上保留了植物细胞壁中多糖的天然排列结构，而多糖正是生物质的主要组分。在本示例中，使用CPH和ICB底物来分析Phanerochaete chrysosporium在液体培养基中培养时所分泌的酶。检测试剂盒板的布局如图3A所示，包含19种CPH底物和5种ICB底物（每种底物设4个孔，图3B）。P. chrysosporium培养三天后，收集培养上清液进行分析。向每个孔中加入125 µl浓度为200 mM的缓冲液，并加入25 µl培养上清液。采用三种不同的pH条件进行测试：乙酸钠缓冲液（pH 4.0）、磷酸钠缓冲液（pH 6.0）或（pH 8.0）（图3C）。将该板在25 °C、150 rpm振荡条件下孵育2小时。
将反应产物转移至产物板（图3D）并进行分析。P. chrysosporium 产生了可降解多种葡聚糖、淀粉和木聚糖的酶（图3E）。对于半纤维素中的阿拉伯聚糖（甜菜来源）和果胶半乳聚糖，以及RGI（大豆来源），检测到的信号较低。所产酶在酸性条件（pH 4.0）下的活性高于中性或弱碱性条件（pH 8.0）。对ICB底物较低的作用活性（图3F）表明，当多糖处于更接近天然的状态时，酶的作用效率与纯多糖条件下不同，因此ICB底物能够更真实地反映酶在应用于原始或预处理植物材料时的实际效率。
<img alt="碳水化合物测定结果；pH 4、6、8 时的吸光度；微孔板，比色分析，柱状图。" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 利用含 19 种 CPH 和 5 种 ICB 底物的多底物板，对 Phanerochaete chrysosporium 3 天液体培养物的培养上清液进行筛选。A) 实验板布局示意图，每种底物设 4 个孔（灰色背景 = CPH 底物，橙色背景 = ICB 底物）。B) 含底物的测定板照片。C) 实验所用缓冲条件示意图（200 mM 醋酸钠，pH 4.0；磷酸钠，pH 6.0 和磷酸钠，pH 8.0）。D) 反应体系在 25 °C 下孵育 2 小时后的产物板照片。E) 在 517 nm 处检测吸光度，并对每种 CPH 底物的结果进行绘图，F) 为相应酶对 ICB 底物的测定结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54286/54286fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
也可使用不同颜色的CPH底物混合物，在一个孔中研究协同效应，并通过单个酶或酶混合物处理后分析反应上清液。
在下图图4所示的示例中，红色CPH-纤维素和黄色CPH-木聚糖底物以大致相等的比例混合，加入96孔滤板的各个孔中。图4A显示了在室温下处理1小时后的显色反应产物，反应体系中未加酶（对照）、仅加纤维素酶cel（2 U/ml）、仅加木聚糖酶xyl（1 U/ml）或同时加入两种酶（每种处理设3个重复），反应缓冲液为100 mM乙酸钠缓冲液（pH 4.5）。在分析时，通过扫描350 nm至700 nm波长范围内的吸收光谱，采用分光光度法对反应产物进行定量（图4B）。通常仅通过肉眼观察即可初步判断酶是否作用于单一或多种底物，但也可利用简单的线性回归方法8对来自不同染料的吸收光谱进行解析，从而更准确地评估混合物中每种底物的降解程度。
使用CPH底物混合物显著提高了检测通量，可在一次实验（一个孔）中同时针对多达4种不同底物进行筛选。图示示例中使用了四种不同的底物：蓝色CPH-β-葡聚糖（大麦）、黄色CPH-木聚糖（山毛榉木）、绿色CPH-直链淀粉和红色CPH-果胶半乳聚糖（羽扇豆）。底物板的布局如图所示 图4C 以及检测板的图片 图 4D在100 mM乙酸钠缓冲液（pH 4.5）中反应30分钟 25 °C 以及150 rpm。首先测试了单个酶在酶浓度递增条件下与相应CPH底物的反应（图4E）且按预期在产物板中接收到有色上清液（图4F，第1A-12D行。E行包含两种不同的CPH底物：黄色CPH-木聚糖和蓝色CPH-β-葡聚糖，它们被相应的酶以不同的比例降解 内皮-木聚糖酶和 内皮-葡聚糖酶。反应结束后，结果可在产物板中观察到：反应产物颜色越深绿偏蓝，表明 内皮-葡聚糖酶存在（图4F，4E-6E）并变为较浅的黄绿色，当 内皮-木聚糖酶浓度增加（图 4F，10-12E）。在F行中也可观察到相同现象，其中两种底物红色CPH-果胶半乳聚糖和黄色CPH-木聚糖被降解 内皮-半乳糖苷酶和 内-木聚糖酶。四种不同颜色的CPH底物均存在（图4F，1G-12F）中的单个酶可降解相应的CPH底物，通过添加额外的酶可获得多种有色反应产物的组合。
<img alt="酶底物显色反应检测：吸收光谱图、比色实验、微孔板结果。" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. 两种不同的CPH底物组合，即红色CPH-纤维素和黄色CPH-木聚糖，经不同酶处理。A） 两种底物经处理后的反应上清液 内皮-纤维素酶（细胞）或 内皮-木聚糖酶（木糖）或两种酶。 B) 反应上清液的吸光度光谱。四种不同CPH底物经不同酶处理的组合。 C) 底物板示意图，包含以下CPH底物：蓝色为CPH-β-葡聚糖（大麦）、黄色为CPH-木聚糖（山毛榉木）、绿色为CPH-直链淀粉、红色为CPH-果胶半乳聚糖（羽扇豆）。 D) 含有不同CPH底物的检测板示意图。 E) 产品板示意图，显示所添加酶的比例（标称浓度（NC）： 谷氨酸 = 1 U/ml 内皮-葡聚糖酶， 木糖 = 1 U/ml 内皮-木聚糖酶, amy = 5 U/ml 内皮-淀粉酶和 半乳糖 0.5 U/ml 内-半乳聚糖酶) F) 30 分钟孵育后的产物板图像 25 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54286/54286fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>底物</td>
			<td>源 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH-2-羟乙基纤维素</td>
			<td rowspan="2">N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(CPH-2-HE-纤维素)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH-支链淀粉</td>
			<td>马铃薯</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH-直链淀粉</td>
			<td>马铃薯</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH-阿拉伯聚糖</td>
			<td>甜菜</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH-阿拉伯木聚糖</td>
			<td>小麦</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH-酪蛋白</td>
			<td>牛乳</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH-壳聚糖</td>
			<td>动物来源</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH-酵母葡聚糖</td>
			<td>Alcaligenes faecalis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH-葡聚糖</td>
			<td>明串珠菌属 spp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH-半乳甘露聚糖</td>
			<td>角豆</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH- laminarin</td>
			<td>掌状海带</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH-地衣聚糖</td>
			<td>冰岛苔藓</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH-甲基纤维素</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH-重楼多糖</td>
			<td>茯苓</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH-果胶半乳糖醛酸聚糖</td>
			<td>马铃薯</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH-普鲁兰多糖</td>
			<td>Aureobasidium pullulans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH-鼠李糖半乳糖醛酸聚糖 I (RG I)</td>
			<td>马铃薯</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH-鼠李半乳糖醛酸聚糖 I (-Gal)*</td>
			<td>马铃薯</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH-鼠李半乳糖醛酸聚糖</td>
			<td>大豆</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH-木聚糖</td>
			<td>山毛榉木</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPH-木葡聚糖</td>
			<td>酸豆</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>来自大麦的CPH-β-葡聚糖</td>
			<td>大麦</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>燕麦来源的CPH-β-葡聚糖</td>
			<td>燕麦</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酵母来源的 CPH-β-葡聚糖</td>
			<td>酵母</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICB-拟南芥</td>
			<td>莲座叶来自 拟南芥 Col-0（成年植株）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICB-拟南芥种子</td>
			<td>拟南芥</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICB-蔗渣</td>
			<td>Saccharum officinarum （干燥的成年植株，茎与叶）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICB-结晶纤维素（滤纸）</td>
			<td>商用 Whatman 3MM Chr 层析纸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICB-胡芦巴种子</td>
			<td>胡芦巴属 spp. 种子</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICB-大麻</td>
			<td>大麻属植物 （干燥的成年植株，茎与叶）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICB-羽扇豆种子</td>
			<td>Lupinus angustifolius 种子</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICB-花粉 P. pratense</td>
			<td>Phleum pratense 花粉</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICB-云杉</td>
			<td>云杉属 spp. （研磨的树干）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICB-烟草</td>
			<td>来自 Nicotiana benthamiana （幼苗）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICB-小麦秸秆</td>
			<td>小麦属 spp. （干燥的成年植株，茎和叶）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICB-柳树</td>
			<td>Salix spp. （干燥的成年植株，研磨后的树干）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICB-高粱</td>
			<td>高粱属 spp. （成年植株的叶片）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">（β-1,4-D-半乳聚糖侧链已用 内皮-β-1,4-D-半乳聚糖酶</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 可获得的显色性聚合物水凝胶（CPH）和不溶性显色性生物质（ICB）底物列表。

一种用于酶筛选的高通量检测方法被描述。该多重即用型检测试剂盒包含预先选定的 C显色 P聚合物 H水凝胶（CPH）基质与复杂 我不溶性 C显色 B生物质（ICB）底物。靶向酶为多糖降解酶 内-酶和蛋白酶。

碳水化合物活性酶（CAZymes）在体内具有多种功能，并广泛应用于生物燃料、纺织、洗涤剂、造纸等工业加工过程。

该显色检测方法的总体目标是以高通量形式，针对多种不同的显色底物筛选各种酶。该方法有助于回答酶发现领域中的关键问题，例如寻找能够降解生物质的新酶活性。该技术的主要优势在于，显色底物具有四种不同的颜色，使该技术具备高通量、极高可靠性和成本效益的特点。首先，通过向每个孔中加入 200 微升活化溶液来活化 96 孔滤膜分析试剂盒板。在室温下静置孵育 10 分钟。使用离心机和任何标准的 96 孔板进行收集。为了离心去除现有的活化溶液，向显色聚合物水凝胶（CPH）底物中加入100微升无菌水，并通过抽真空或离心去除稳定剂。重复洗涤两次。为准备酶反应，向检测试剂盒板的每个孔中加入150微升100 mM醋酸钠缓冲液（pH 4.5）以及5微升三种不同浓度的内切纤维素酶溶液。将产品板置于检测试剂盒板下方，以收集振荡过程中反应板可能产生的泄漏液体。随后将检测试剂盒板置于水平摇床中，在室温下以100 rpm振荡孵育30分钟。为获得可靠数据，孵育期间必须对反应混合物进行振荡。将检测试剂盒板置于产品板上方，放入离心机中，在 2,700 × g 条件下离心 10 分钟，以将反应产物转移至产品板的各孔中。离心结束后，目视检查产品板，确认每孔中的液体体积是否大致相同。使用酶标仪，在630 nm波长下测定不同绿色CPH底物收集板的吸光度。根据正文方案分析并绘制数据。若要使用红色不溶性显色生物质或ICB-小麦秸秆进行显色测定，首先向测定板的每个孔中加入200微升活化溶液。然后，将酶标板在室温下静置孵育10分钟。使用100微升无菌水洗涤孔三次，以去除稳定剂。随后，每孔加入150微升100 mM、pH 4.5的醋酸钠缓冲液和5微升浓度为每毫升10单位的不同内切木聚糖酶溶液。将产物板置于底物板下方，以收集震荡过程中底物板可能产生的泄漏液体。在室温下以100 rpm孵育反应2小时。孵育结束后，将含有下方产物板的检测试剂盒板放入离心机中，于2,700 × g离心10分钟，使反应产物转移至产物板的孔中。检查每个孔中的液体体积是否大致相同。然后使用酶标仪在517 nm处测定红色ICB小麦秸秆收集板的吸光度。根据正文实验方案进行数据分析。此处展示的是不同酶浓度下CPH-阿拉伯木聚糖对木聚糖酶的剂量反应示例，其中酶浓度的降低可通过视觉观察。采用更详细的分光光度法定量方法，以吸光度对酶浓度作图。信号强度对应于酶活性。在此用于酶筛选的实验示例中，一种内切纤维素酶在三种不同浓度下针对多种CPH底物进行了测试。如图所示，该酶对CPH-葡聚糖、CPH-木聚糖和CPH-木葡聚糖表现出除纤维素酶活性外的额外活性，而对CPH-半乳甘露聚糖仅表现出较低活性。在相同条件下，使用市售的酶作为阳性对照对相同的CPH底物进行了消化处理。本实验结果显示，所有底物的降解程度均随酶浓度的增加而升高。在本实验中，共包含5种ICB底物和19种CPH底物，用于分析彩绒革菌（Phanerochaete chrysosporium）在三种不同pH条件下分泌的酶。P. chrysosporium的酶可降解多种葡聚糖、淀粉和木聚糖。半纤维素阿拉伯聚糖和果胶半乳聚糖以及RGI的信号较弱。所产酶在酸性条件下的活性高于中性或弱碱性条件。若操作得当，掌握该技术后可在一小时内完成。在进行该实验操作时，重要的是要记住在孵育过程中混匀反应体系。该技术在开发完成后，将为高通量筛选领域的研究人员探索生物技术中新的酶活性提供有力支持。观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用该筛选试剂盒。

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