Name: 膜片钳记录的成年大鼠完整背根神经节 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 学习成年大鼠完整背根神经节膜片钳记录技术，该方法保留神经元与卫星胶质细胞的微环境，适用于疼痛机制研究中的单细胞电生理记录。

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作者谨此感谢Painless Research Foundation对本工作的支持。本工作还得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金R01 NS080921-01和R21 NS079897-01A1的资助。

伦理声明：所有实验动物的饲养和使用程序均符合加州大学旧金山分校（UCSF）动物研究委员会的规定，并依照美国国立卫生研究院（NIH）关于动物使用与护理的指南（出版物85-23，1996年修订版）进行。本研究中所采用的实验方案已获得加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 仪器、溶液和培养皿的准备
<ol>
	<li>制备人工脑脊液（aCSF）。
	<ol>
		<li>配制500 ml的10倍低阳离子溶液和500 ml的10倍碳酸氢盐溶液（溶液配制方法见表1和表2）。4 oC保存，一个月内使用完毕。</li>
		<li>取60 ml 10倍低阳离子溶液与60 ml碳酸氢盐溶液混合，再加入480 ml去离子水，配制成600 ml新鲜aCSF。使用前用碳氧混合气（95% O2 和 5% CO2）持续通气至少10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从毛细玻璃管拉制记录电极。
	<ol>
		<li>将薄壁毛细玻璃管放入电极拉制仪中制备记录电极。 
		注意：在本实验室中，采用以下拉制参数可获得理想的电极形态：加热温度（510），拉速（32）。用于完整背根神经节（DRG）记录的理想电极应具有逐渐变细的锥形结构且锥角较小，最佳参数需通过反复试验确定。</li>
		<li>电极内填充细胞内液后，其电阻应为3–5 MΩ（细胞内液配制方法见表3）。有关电极电阻测量的详细方法，请参见Axon实验指南18。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将1 mg胶原酶加入400 µl aCSF中，终浓度为13单位/ml。然后每根玻璃电极中加入约20 µl胶原酶溶液。将装有溶液的电极置于-20 oC冰箱中保存，并在三周内使用完毕。</li>
	<li>准备200 ml冷aCSF（约4 oC）。为快速冷却，将aCSF倒入烧杯中，用封口膜密封后置于-20 oC冰箱中约20分钟，直至液体开始结冰。随后将烧杯放入冰浴中，并用碳氧混合气通气10分钟。同时，在室温下对剩余的400 ml aCSF用碳氧混合气通气。</li>
	<li>在aCSF冷却过程中，剪切一次性塑料移液管的末端，将开口扩大至直径约5 mm（用于转移背根神经节）。准备以下手术器械：手术刀（#15）、直型和弯型Mayo剪刀、精细2 mm尖端咬骨钳、Adson有齿镊、虹膜剪、弹簧剪以及两把精细镊子。将充氧后的冷aCSF倒入3个玻璃培养皿中（外径：10 cm）。</li>
</ol>
2. 背根神经节解剖
<ol>
	<li>用戊巴比妥钠（100 mg/kg，腹腔注射）麻醉一只大鼠（200–220 g），并通过检测足底反射和眨眼反射确认麻醉深度是否充分。</li>
	<li>确认大鼠已充分麻醉后，剃除腰部区域的毛发，沿正中线切开皮肤和皮下组织。使用精细骨膜剥离器在L1–S2节段将椎旁肌从棘突上分离。</li>
	<li>使用弯剪从L1至S2剪除棘突。使用直的梅奥剪在暴露的脊柱约L1和S1水平进行横向剪切，将该段脊柱整体（en bloc）取出，并迅速浸入冰冷的aCSF（按步骤1.5配制）中，持续2–3分钟。&#160;在取出腰段背根神经节（DRG）后，仍在深度戊巴比妥&#160;麻醉状态下，通过双侧开胸法实施安乐死。&#160;</li>
	<li>用冰冷的aCSF冲洗去除脊柱段及其附着组织上的血液，并转移至一个盛有冰冷aCSF的培养皿中。使用精细咬骨钳去除椎板。用显微剪沿正中线剪开硬脊膜以暴露脊髓。轻轻抬起脊髓，使用虹膜剪在神经根进入脊髓的部位将其切断，随后取出脊髓。</li>
	<li>将残留有DRG的椎骨转移至第二个盛有冰冷aCSF的培养皿中。根据DRG相对于横突和坐骨神经的位置，确定L4和L5节段的DRG。 
	注意：保持坐骨神经完整有助于识别L4和L5 DRG（坐骨神经起源于L4–6脊神经）。</li>
	<li>使用Dumont镊子和Noyes剪刀将DRG从周围结缔组织中游离出来。保持神经根和脊神经与DRG相连。</li>
	<li>使用移液管将DRG转移至第三个培养皿中，以进行进一步解剖。</li>
	<li>在解剖显微镜下，尽可能彻底地去除包绕DRG的神经外膜。
	<ol>
		<li>使用Noyes弹簧剪在背根和腹根连接DRG处剪开一个小口，并将腹根从DRG上分离。使用尖端钝的Dumont #5镊子夹住神经外膜，再用另一把精细镊子将DRG从神经外膜中轻轻卷出。</li>
		<li>继续使用精细镊子尽可能去除附着在DRG上的神经外膜。 
		注意：良好的DRG解剖是下一步获得有效消化效果的关键。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 背根神经节消化
<ol>
	<li>将背根神经节（DRG）转移至记录室。确保DRG上神经根发出的一侧朝下。 
	注意：这样可使大多数神经元易于接触。</li>
	<li>使用固定锚稳定DRG。通过连接在蠕动泵上的塑料管，以0.5 ml/min的流速向DRG灌注充氧人工脑脊液（aCSF），蠕动泵放置在记录装置旁边的桌面上。</li>
	<li>等待30分钟，使细胞恢复。通过CCD相机在40倍物镜放大倍数下，使用红外微分干涉对比（IR-DIC）光学系统评估DRG的质量。 
	注意：质量良好的DRG表面通常含有大量圆形、轮廓清晰的神经元，周围被卫星胶质细胞包围。</li>
	<li>消化DRG表面的一小部分区域。 
	注意：玻璃膜片电极置于电极夹持器中，电极夹持器为小型连接件，可通过气密密封将管路连接至玻璃电极。
	<ol>
		<li>分别使用两段小直径橡胶管将两个1 ml注射器连接至两个电极夹持器。将一根装有胶原酶的玻璃电极放入其中一个夹持器中，另一根空的玻璃电极放入另一个夹持器中。</li>
		<li>使用显微操作器将电极定位在DRG上方。然后在显微镜放大下，轻轻碰撞两根电极尖端，以扩大电极开口（理想直径为5–10 µm）。</li>
		<li>将装有酶的电极移至DRG表面附近，并通过推动连接夹持器与注射器的管路上的活塞约0.5 ml，对含胶原酶的电极施加短暂的正压。 
		注意：在压力作用下，酶液从电极中流出，会轻微扩大DRG神经元之间的间隙，此现象可作为酶已施加的标志。</li>
		<li>10至15分钟后，当观察到残留的神经外膜碎片时，对空电极施加轻柔的负压，吸除碎片。 
		注意：通过此操作，神经元及其周围的卫星胶质细胞将被清晰暴露，可进行膜片钳记录。</li>
		<li>将两根电极丢弃至锐器容器中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 膜片钳记录
<ol>
	<li>将电极液（见表3）置于冰上以防止降解。用滤膜过滤的细胞内液（注射器滤器，孔径：0.2 µm）填充玻璃膜片电极，并将电极插入放大器的电极夹持器中。在将电极浸入浴液之前，通过5 ml注射器推动活塞约1 ml，对电极施加轻微的正压。 
	注意：此操作可防止电极堵塞。</li>
	<li>旋转放大器上的模式旋钮，选择&#34;V-clamp&#34;模式，然后在软件中打开&#34;Membrane test&#34;界面。在显微镜下将电极移近目标神经元。 
	注意：在完整的背根神经节（DRG）制备中，每个神经元均被一层薄薄的卫星胶质细胞包裹。</li>
	<li>使用电极施加正压，穿过卫星胶质细胞层，直至观察到神经元与周围卫星胶质细胞层之间出现突然扩大的空隙。继续将电极向神经元推进，直到在神经元表面观察到&#34;dimple&#34;（凹陷）为止。 
	注意：与分离神经元的记录相比，此处需要稍大的正压，有助于穿透卫星胶质细胞层，提高成功形成膜片钳的概率。</li>
	<li>减小正压。随后通过轻柔抽吸形成吉欧姆（giga ohm）级密封。 
	注意：采用该方法，记录的成功率至少为70%。</li>
	<li>按照先前所述方法获得全细胞记录构型19。
	<ol>
		<li>简而言之，通过短暂但较强的抽吸穿透神经元细胞膜。或者，在施加抽吸的同时使用放大器上的&#34;zap&#34;功能。</li>
		<li>一旦建立全细胞模式，通过调节放大器上的电容和电阻补偿旋钮，对全细胞电容和串联电阻（Rs）进行补偿。 
		注意：Rs通常为5–20 MΩ。</li>
		<li>若初始Rs大于30 MΩ，或在记录过程中Rs变化超过20%，则放弃该细胞。同时测量静息膜电位；若静息膜电位高于-50 mV，则放弃该细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>关闭&#34;Membrane test&#34;窗口。旋转放大器上的模式旋钮，选择&#34;I-clamp normal&#34;模式。</li>
	<li>在软件中点击&#34;open protocol&#34;，选择并加载用于测量阈值电流（rheobase）的记录程序。点击&#34;record&#34;开始记录。通过逐步注入100 pA递增的去极化电流，测量输入电阻和阈值电流，以评估神经元的兴奋性。
	<ol>
		<li>再次点击&#34;open protocol&#34;，选择用于测量膜阈值的记录程序。向神经元注入持续500 ms、速率为2,000 pA/s的去极化斜坡电流。</li>
		<li>使用数据采集与分析软件（例如 Clampfit），根据制造商说明书分析记录的电流轨迹。基于超极化电流期间的稳态I-V关系，利用软件计算输入电阻（Rin）。移动光标测量阈值电流（rheobase）和膜阈值。 
		注意：诱导动作电位（AP）所需的最小电流强度定义为阈值电流（rheobase），诱导AP所需的最低电压定义为膜阈值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录配体诱导电流。
	<ol>
		<li>用特定激动剂填充电极。 
		注意：在本研究中，我们使用100 µM谷氨酸和100 µM AITC，分别诱导谷氨酸受体和TRPA1受体介导的电流。</li>
		<li>检查电极，确保内部无气泡。将电极放入电极夹持器中，并将夹持器通过管路连接至药物递送系统。</li>
		<li>使用操纵器将电极移至距离神经元50 µm以内。将药物递送系统的压力设为1 psi，持续时间为1秒。切换记录模式至电压钳制模式，并钳制在-70 mV。短暂启动药物递送系统施加压力，记录药物诱导的电流。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们报道了一种用于膜片钳研究的完整背根神经节（DRG）制备方法。制备理想标本有几个关键步骤：首先，必须分离带有背根的DRG；其次，需仔细去除神经外膜，同时避免损伤神经元；最后，为了暴露神经元及其周围的卫星胶质细胞，必须消化残留的结缔组织。采用本方法制备的成年大鼠完整DRG可在6至8小时内保持良好的活性，并在此期间实现稳定的记录。该标本可用于多种DRG相关研究，包括对神经元或卫星胶质细胞进行膜片钳记录，以及背根神经节神经元的诱发电反应研究。
在解剖过程中，应迅速分离背根神经节（DRG）并将其保持在低温（4 oC）环境中，以减缓神经元的代谢速率，从而维持其活性。在分离DRG时，应避免牵拉进入DRG的背根或脊神经。该制备过程中的另一个关键步骤是去除包绕DRG的神经外膜。由于神经外膜难以穿透，任何残留在DRG上的神经外膜都会阻碍膜片钳电极接触到神经元。胶原酶的使用是成功制备的重要步骤。胶原酶可消化残留的神经外膜，同时清洁细胞表面，这两点对成功进行膜片钳记录至关重要。为避免组织过度消化，需考虑三个因素。第一，胶原酶有多种不同形式；参见材料表中的推荐，目前使用的胶原酶效力...

感觉对生物体的生存和健康至关重要。刺激的传递依赖于感觉通路，该通路起始于初级感觉神经元轴突的外周末梢。除三叉神经中脑核外，初级感觉神经元位于三叉神经节和背根神经节（DRGs）中。它们作为感觉信息的守门人发挥作用 1在胞体膜上，与中枢和外周末梢一样，背根神经节（DRG）神经元表达多种受体和离子通道，如谷氨酸受体、TNFα受体、瞬时受体电位阳离子通道香草素亚家族成员1（TRPV1）、钠通道， 等等。 2-7对胞体膜进行膜片钳记录，有助于了解这些受体和通道在神经元中发生的多种功能变化。
膜片钳记录技术是研究通道或受体活性的有力工具，已有大量研究在背根神经节（DRG）神经元上应用该技术开展8-10。在大多数研究中，通过切断靠近神经节的背根细支和脊神经来摘取DRG。组织切碎后，将神经节置于消化酶中，使其神经元解离，随后可立即进行记录，或先培养数天后再进行记录。然而，DRG神经元的解离不可避免地会在胞体附近造成轴突切断（axotomy）。一旦发生解离和轴突切断，DRG神经元会发生表型改变以及膜兴奋性的变化11,12。单个神经元胞体与其正常包围的卫星胶质细胞之间接触的丧失，可能是导致这些变化的重要原因13。神经元与卫星胶质细胞之间的相互作用，不仅在生理条件下至关重要，也在适应病理性状态（如导致顽固性疼痛的状态）中发挥关键作用14,15。因此，使用解离的DRG制备样本研究神经元与卫星胶质细胞之间的相互作用将面临挑战。
另一方面，完整的背根神经节（DRG）更接近于体内环境。在过去几年中，我们实验室以及一些其他研究团队一直采用成年大鼠的完整背根神经节，研究与慢性疼痛相关的不同条件下初级感觉神经元的变化3-5,11,15-17。尽管这些研究中所使用的技术已有一定程度的建立，但尚未发表详细的逐步操作说明。在本论文中，我们描述了一种简便且快速的完整背根神经节制备方法及其在膜片钳记录中的应用。

<table><tbody><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>vortech Pharmaceuticals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td>1 ml, 5 ml。</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>BD</td><td></td><td>规格：15</td></tr><tr><td>直型梅奥剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14010-15</td><td></td></tr><tr><td>弯型梅奥剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14011-15</td><td></td></tr><tr><td>咬骨钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>齿状Adson镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Noyes弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15124-12</td><td></td></tr><tr><td>骨剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>16044-10</td><td>专用于切割骨骼。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>镊子：Dumont，Dumoxel Biologie #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>此类镊子尖端精细，初次购买时无需打磨。</td></tr><tr><td>骨膜剥离器</td><td>Sklar</td><td>97-0530</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>WILD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Fisher brand</td><td>13-711-5AM</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（10 cm）</td><td>Pyrex</td><td></td><td>玻璃培养皿可避免损伤精细镊子的尖端</td></tr><tr><td>胶原酶（Liberase TM）</td><td>Roche</td><td>05-401-119-001</td><td>溶解至浓度为13 U/ml，分装至玻璃移液管中。避免反复冻融。</td></tr><tr><td>滤器</td><td>Thermo scientific</td><td>7232520</td><td>对膜片钳记录所用的内液进行过滤，以防止堵塞。</td></tr><tr><td>玻璃移液管</td><td>Sutter</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>固定锚</td><td>Havard apparatus</td><td>64-0250</td><td>用于稳定背根神经节（DRG），防止漂移。</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>拉管仪</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>放大器</td><td>Molecular devices</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>数模转换器</td><td>Molecular devices</td><td>1440D</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>NIKON</td><td>FN600</td><td></td></tr><tr><td>微操纵器</td><td>Sutter</td><td>MPC200</td><td></td></tr><tr><td>微注射给药系统</td><td>General Valve</td><td>Picrospitzer II</td><td>快速药物施加系统</td></tr><tr><td>碳酰气（95% O₂, 5% CO₂）</td><td>本地医用气体供应商</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

成年大鼠完整背根神经节的膜片钳记录

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

背根神经节（DRG）神经元的膜片钳研究增进了我们对周围神经系统的理解。目前，大多数记录是在分离的DRG神经元上进行的，这是大多数实验室采用的标准制备方法。然而，获取分离神经元过程中所使用的酶消化会导致轴突损伤，从而可能改变神经元的特性。此外，由于分离神经元制备方法不可避免地会失去与包裹初级感觉神经元的卫星胶质细胞的接触，因此无法完全再现DRG的微环境。为了克服传统分离DRG神经元在膜片钳记录中的局限性，本文介绍了一种制备完整DRG并对外置条件下（ex vivo）单个初级感觉神经元进行膜片钳记录的方法。该方法能够快速、简便地制备保持完整的DRG，通过使DRG神经元与其周围的卫星胶质细胞及基底膜保持关联，模拟体内（in vivo）状态。此外，该方法避免了在分离DRG过程中因操作和酶消化所造成的轴突损伤。这种外置（ex vivo）制备方法还可用于研究初级感觉神经元与卫星胶质细胞之间的相互作用。

图1展示了制备完整背根神经节（DRG）用于膜片钳记录的过程。图1A显示了椎板切除术后神经节的暴露位置。图1B显示了在移除脊髓后保留有神经根的L3、L4和L5节段的DRG。随后，小心地解剖并分离L4和L5的DRG，使其脱离椎骨。接着，去除包裹DRG的透明膜状结构——神经外膜（黄色箭头，图1D）。分离神经外膜的最佳位置是背根与腹根在DRG处汇合的部位，如图1D中的黑色箭头所示。去除神经外膜后，将腹根切断并弃去，仅保留背根细支、脊神经及DRG，如图1E所示。通过胶原酶消化可进一步清除残留的神经外膜，从而暴露神经元及其周围包绕的卫星细胞（图1F）。
完成背根神经节（DRG）制备后，通过测量启动电流（rheobase）和膜阈值来...

本文描述了如何制备完整的背根神经节以进行膜片钳记录。该制备方法保留了神经元和卫星胶质细胞的微环境，从而避免了使用离体培养背根神经节神经元时所出现的表型和功能改变。

来自背根神经节（DRG）神经元的膜片钳研究增进了我们对周围神经系统的理解。目前，大多数……

本实验的总体目标是介绍制备完整背根神经节的方法，并利用该制备进行膜片钳记录。该方法可在刺激传入脊神经或传出背根的同时，实现对完整背根神经节中单个细胞的记录。该技术在研究初级感觉神经元对疼痛的贡献时尤为有用。该技术的主要优势在于能够同时保留神经元及其相邻的卫星胶质细胞。因此，该制备方法更接近体内实际情况。在本操作中，待大鼠麻醉后，剃除其腰部区域的毛发。然后，沿正中线切开皮肤和皮下组织。随后，使用精细的骨膜剥离器在L1至S2水平将椎旁肌从棘突上分离。接着，切除L1至S2的棘突。随后，在暴露的脊柱约L1和S1水平处做两个横向切口，并将该节段的脊柱整块切除。然后，迅速将其浸入冷 aCSF 中 2 到 3 分钟。之后，用冷 aCSF 冲去移除的脊柱上的血液，并将脊柱转移至盛有冷 aCSF 的培养皿中，再用精细咬骨钳去除椎板。使用显微剪沿中线剪开硬脊膜以暴露脊髓。接下来，将带有背根神经节（DRG）的剩余椎骨转移至第二个盛有冷人工脑脊液（aCSF）的培养皿中。根据背根神经节相对于横突和坐骨神经的位置来确定L4和L5背根神经节。随后，去除背根神经节周围的结缔组织，保留与背根神经节相连的神经根和脊神经。随后，将DRG转移至第三个培养皿中以进行进一步解剖。在背根和腹根连接DRG的部位剪开一个小口，分离腹根。然后用钝头镊子夹住神经外膜，用另一把精细镊子将DRG从神经外膜上卷下。继续尽可能去除附着在背根神经节（DRG）上的神经外膜。现在，将DRG转移至记录室。确保DRG上神经根发出的一侧朝下。接下来，用锚定装置固定背根神经节（DRG）。然后，通过连接蠕动泵的塑料管路向DRG灌注含氧人工脑脊液（aCSF），并让细胞恢复30分钟。30分钟后，通过CCD相机在40倍放大下使用红外微分干涉光学（IR-DIC）显微镜评估DRG的质量。通过两段小直径橡胶管，将两个1毫升注射器分别连接到移液管架上。然后，将一支装有胶原酶的玻璃移液管放入其中一个移液管架中，另一支空的玻璃移液管放入另一个移液管架中。随后，使用显微操作器将移液管定位在背根神经节（DRG）的正上方。轻轻碰撞两支移液管的尖端，以扩大移液管尖端的开口。随后，将装有胶原酶的移液管移至背根神经节（DRG）表面附近。通过推动连接持针器与注射器的管路，使注射器活塞移动约0.5毫升，短暂地对含有胶原酶的移液管施加正压。10到15分钟后，当观察到残留的神经外膜碎片时，用空移液管施加轻柔的负压，吸除碎片。通过此操作，神经元及其周围的卫星胶质细胞将被清晰暴露，可进行膜片钳记录。在此过程中，应将电极液置于冰上，以防止降解。接下来，用过滤后的细胞内液填充玻璃移液管。然后，将移液管放入头部阶段的移液管固定器中。在将移液管浸入浴液之前，通过五毫升注射器推动活塞约一毫升，对移液管施加轻微的正压。随后，在放大器上选择电压钳模式，并在软件中打开膜测试界面。在显微镜下，

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膜片钳记录的成年大鼠完整背根神经节

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脊髓切片中胶状质神经元的全细胞膜片钳记录

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成年大鼠完整背根神经节的膜片钳记录

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