结合近红外荧光成像与显微计算机断层扫描直接可视化脑血栓栓塞

该直接血栓成像技术的总体目标是利用金纳米颗粒、计算机断层扫描（CT）和近红外荧光成像，在活体及离体条件下对荧光标记的脑血栓栓塞进行定量可视化观察。该方法有助于解答止血与血栓领域中的关键科学问题，例如脑血栓栓塞对组织型纤溶酶原激活剂或正在研究中的新型溶栓药物的时间依赖性或剂量依赖性反应，以及严重的骨科相关反应。该技术的主要优势在于：静脉注射金纳米颗粒后，高分辨率显微CT可实现对脑血栓栓塞动态演变过程的捕捉，通过在活体内定量显示其位置和负荷量，并进一步通过离体近红外荧光血栓成像加以验证。

该操作将由我实验室的博士后 Jeong-Yeon Kim 演示。通过心脏穿刺采集 300 至 1,000 微升动脉血后，取 70 微升样本加入 30 微升适当的活化凝血因子、13 型介导的纤维蛋白交联活性荧光探针，混匀后将所得混合物装入一支配有 23 号针头的 3 毫升注射器中。接着，将标记后的血液注入一段 20 厘米长的聚乙烯管中，并在室温下静置使血液凝固。

两小时后，将试管转移至 4 摄氏度环境中放置 22 小时，然后将管子切成 1.5 厘米长的片段。使用一支装有 PBS 的 3 毫升注射器，将每个管段中的血栓推出，分别放入含有 PBS 的 6 孔板的各个孔中。用 PBS 将血栓清洗三次，然后将一端连接 30 号针头、并充满生理盐水的 1 毫升注射器插入 15 厘米长 PE10 管的一端，小心地将一个经清洗的血栓吸入管子的另一端。

然后，将装有血栓的PE10管与一根长3厘米、末端渐细（直径200微米）的PE50管连接。通过夹捏脚趾无反应确认麻醉成功后，用聚维酮碘（Betadine）和70%酒精对手术区域进行消毒，并使用手术刀在左耳与左眼之间的区域做一条长1厘米的垂直切口。将激光多普勒血流仪的光纤远端用胶水固定于暴露的左侧颞骨表面，位置在冠状缝左侧1毫米、下方4毫米处，并开始进行多普勒血流监测。

然后，通过血管周围软组织做一条3厘米长的垂直正中切口，暴露左侧颈动脉球区域。使用无菌6-0黑色丝线结扎左侧近端颈总动脉，随后使用无菌7-0黑色丝线结扎左侧颈内动脉和左侧翼腭动脉。使用单极电凝器烧灼左侧甲状腺上动脉，然后使用无菌7-0黑色丝线对左侧近端颈外动脉进行松扎，对血管远端进行紧扎。

使用显微剪刀在颈外动脉结扎位点之间制作一个0.2至0.25微米的孔，同时松开近端颈外动脉的结扎处，将含有血栓的导管插入该孔中。将导管向前推进至颈总动脉，以固定导管位置，并重新收紧近端颈外动脉的结扎线。用电灼法切断颈外动脉的远端，顺时针旋转颈外动脉游离的近端，使血管与颈内动脉对齐，同时撤出导管。

然后，松开颈内动脉结扎线，并立即向前推进导管约九毫米，到达大脑中动脉与大脑前动脉分叉处。此时，在导管周围重新收紧颈内动脉缝线，并轻柔按压注射器，将血栓注入分叉区域。若多普勒监测显示血流较基线水平降低30%或以上，应立即拔出导管，并迅速结扎颈外动脉的近端。

在适当的实验时间点，通过微型计算机断层扫描对血栓进行成像时，将纤维蛋白靶向金纳米颗粒稀释至10毫克/毫升，并溶于10毫摩尔磷酸盐缓冲液中，随后对血栓成像剂进行30分钟超声处理，以确保纳米颗粒均匀悬浮。然后，将300微升纤维蛋白靶向颗粒注射至实验动物的阴茎静脉中。将动物转移至微型CT成像仪的载物床上，并使用连接于钉子上的细绳轻轻牵拉其上颌前牙，以拉直颈部。

在注射金纳米颗粒5分钟后开始成像。为通过离体近红外成像观察血栓，将切除的脑组织置于成像仪中，基底部朝上。获取 Willis 动脉环内荧光标记的血栓栓子的图像。

然后将组织顶点朝上放置，对皮层血栓栓塞进行成像。用几滴生理盐水润湿组织，随后根据制造商说明书使用脑切片模具，迅速获取六片厚度为2毫米的冠状脑切片。保持切片被生理盐水润湿，对各切片的前、后表面分别进行额外的近红外成像。

为了在微计算机断层扫描（micro-CT）成像后定量血栓面积，打开图像序列文件，依次选择“图像”（Image），然后“类型”（Type），再选择“8位”（8-bit），将图像转换为8位灰度图像。当CT图像文件中的一个像素对应0.053毫米时，使用“分析”（Analyze）菜单中的“设定比例尺”（Set Scale）功能，在“像素距离”（Distance in pixels）、“已知距离”（Known distance）和“长度单位”（Unit of length）中分别输入1、0.053和毫米。随后，在“编辑”（Edit）菜单下，选择“选区”（Selection），然后选择“指定”（Specify），在脑实质无血栓或无骨相关高密度区域的部位放置一个感兴趣区域（ROI）。

由于指定的兴趣区域适用于整个图像序列中的每一张切片，请确认该区域在任何切片中均不与高密度区域重叠。然后，在“插件”菜单下选择“兴趣区域”中的“兴趣区域与背景扣除”，并将“均值的标准差倍数”设置为2。寻找与血栓栓塞相关的高密度病灶，并放大至病灶区域。

现在，选择“图像”（Image），然后依次选择“调整”（Adjust）和“阈值”（Threshold），输入下限阈值为 22，上限阈值为 255。选择“超出/低于”（Over/Under）以将低于下限阈值的像素显示为蓝色，将处于阈值范围内的像素显示为灰度，将高于上限阈值的像素显示为绿色。然后，使用自由手选择工具（Freehand selection tool）绘制围绕血栓栓塞相关高密度病灶的感兴趣区域，避免包含任何骨性区域。

使用“分析”中的“设置测量”功能，选择面积、平均灰度值以及面积乘以平均灰度的积分密度。勾选以下选项：限制为阈值范围和显示标签。使用“分析-测量”获取定量数据，然后保存结果。

这些基线微计算机断层扫描（micro-CT）图像是在小鼠发生栓塞性卒中后1小时注射纤维蛋白靶向金纳米颗粒，并于5分钟后在体内获得的。大脑中动脉与前 cerebral 动脉分叉处的颈内动脉远端区域中的脑血栓可被清晰显示。后续 micro-CT 图像显示，接受生理盐水治疗的动物其 Willis 环血栓无变化，而接受组织型纤溶酶原激活物治疗的动物，其 Willis 环血栓随时间逐渐溶解，如蓝色箭头所示。

体内CT密度与体外24小时残余血栓栓子的近红外成像之间存在强相关性。例如，在这些图像中，通过纤维蛋白靶向金颗粒显示的高密度显微CT区域，与在预先形成的血凝块成熟过程中，由凝血因子13A介导的、对纤维蛋白交联活性敏感的荧光探针所识别的近红外信号区域直接对应。此外，如这些图像所示，可通过TTC染色评估溶栓治疗对缺血性脑损伤的影响，比较对照组生理盐水处理与组织型纤溶酶原激活物处理动物的效果。

一旦掌握，若操作得当且成像探针可用，这种体内微计算机断层扫描（micro-CT）成像与离体近红外荧光血栓成像技术可在约一小时内完成。在实施该操作过程中，需特别注意使用非聚集性且靶向纤维蛋白的金纳米颗粒，以实现基于micro-CT的直接脑血栓成像。在完成该操作后，还可进一步采用其他方法，如电子显微镜或电感耦合等离子体质谱法（ICPMS），以回答有关金纳米颗粒在组织中的分布及其血液动力学等额外科学问题。

该技术问世后，为卒中或心血管研究领域的研究人员探索冠状动脉血栓形成或栓塞性脑梗死动物模型中的血栓栓塞现象铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备用于小鼠血栓栓塞性卒中的荧光标记血凝块，并进行体内连续成像及脑部血栓栓塞的定量分析，随后进行离体检测，从而实现对血栓演变过程的监测。