Name: 结合近红外荧光成像和微计算机断层扫描直接可视化脑血栓 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: 学习结合近红外荧光成像与微计算机断层扫描技术，利用金纳米颗粒在活体及离体条件下直接可视化脑血栓并定量分析血栓负荷。该方法有助于研究血栓动态演变及溶栓治疗效果。

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本工作由韩国医疗技术研究与发展项目（Korea Healthcare Technology R&amp;#38;D 项目，日本厚生劳动省（HI12C1847，HI12C0066），生物 &amp;韩国国家研究基金会（由韩国政府资助）的医疗技术开发项目（2010-0019862）和全球研究实验室（GRL）项目（NRF-2015K1A1A2028228）。

本方案中涉及的所有动物实验操作均已通过东国大学一山医院动物护理与使用委员会的审查和批准，并依照《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》中规定的原则和程序进行。
1. 荧光标记的外源性血栓制备（图1）
<ol>
	<li>使用3%异氟烷与30%氧气（1.5 L/min纯氧）在诱导室中麻醉小鼠。通过观察肌肉张力并确认脚趾夹捏反射消失，以确保麻醉深度足够。</li>
	<li>将动物俯卧置于无菌手术巾上，通过吸入式面罩持续给予2%异氟烷与30%氧气以维持麻醉状态。所有操作均需采用无菌技术，并穿戴无菌手术衣、口罩、手套及使用无菌器械。在操作前后，使用70%酒精清洁和消毒实验区域，以维持无菌环境。</li>
	<li>经心脏穿刺采集约300 ~ 1,000 µl动脉血6。取70 µl全血与30 µl C15探针5（浓度为20 µmol/L）混合，该Cy5.5荧光探针可特异性响应活化凝血因子XIII（FXIIIa）的纤维蛋白交联活性，从而对血凝块进行荧光标记（图1A）。使用3 ml注射器（23号针头）将混合血液注入一段20 cm长的聚乙烯管（PE-50，内径0.58 mm）中。&#160;聚乙烯管必须经过灭菌处理（或由制造商提供灭菌认证），且血凝块的制备必须在组织培养罩内无菌操作完成。</li>
	<li>通过观察呼吸和心跳完全停止，确认动物死亡。</li>
	<li>将装有血液的管置于室温下静置2小时，随后在4 °C下保存22小时，并按先前报道的方法进行后续操作7。</li>
	<li>将含有血栓的管切成1.5 cm长的小段。使用装有磷酸盐缓冲液（PBS）的3 ml注射器，将每段管中的血栓轻轻推入含PBS的6孔板中。用PBS清洗血栓三次（图1B）。</li>
	<li>取一段15 cm长的PE-10管（内径0.28 mm），在其远端装入一段1.5 cm长的血栓。操作时，将已清洗的血栓通过装有生理盐水的1 ml注射器（30号针头）从管的近端缓慢吸入，注意避免产生气泡。</li>
	<li>将装载血栓的PE-10管连接至一段3 cm长、末端经拉细处理的PE-50管（内径0.58 mm，末端内径200 µm），该装置将用于小鼠栓塞性脑卒中模型中，放置于颈内动脉（ICA）的中脑动脉（MCA）–前脑动脉（ACA）分叉区域（图1C）。</li>
</ol>
2. 建立血栓栓塞性卒中小鼠模型（图2）
<ol>
	<li>将另一只小鼠置于诱导室中，使用含30%氧气（1.5 L/min）的3%异氟烷进行麻醉，方法如先前报道7。皮下注射美洛昔康（5 mg/kg）以缓解术后疼痛。通过观察肌肉张力并确认足趾夹捏反射消失，确保麻醉深度足够。</li>
	<li>在每只眼睛上涂抹少量兽用眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。使用无菌技术及无菌手术衣、口罩、手套和器械进行以下手术操作。在手术前、手术中和手术后，用70%酒精清洁和消毒手术区域，以维持无菌环境。</li>
	<li>将小鼠转移至手术台，俯卧位放置于无菌铺巾上，并通过吸入式面罩持续给予2%异氟烷以维持麻醉状态。随后，使用带有直肠温度计反馈的恒温毯将体温维持在36.5 °C。</li>
	<li>用聚维酮碘和70%酒精进行手术区域准备后，使用手术刀在左侧耳眼之间的头皮处做一条长约1 cm的垂直切口。将激光多普勒血流仪的光纤远端粘附于暴露的左侧颞骨表面（位于前囟下方4 mm、左侧1 mm处）。随后，开始多普勒血流监测（图2A）。</li>
	<li>将动物仰卧放置，用连接于固定针上的细线牵拉上门齿以伸直颈部，并剃除颈部区域毛发。随后，在颈部正中做一条长约3 cm的垂直切口，切开并分离组织，解剖分离血管周围软组织以暴露左侧颈动脉球区域。操作时注意避免损伤迷走神经。</li>
	<li>使用无菌6-0黑色丝线结扎左侧近端颈总动脉（CCA），并使用无菌7-0黑色丝线分别结扎左侧颈内动脉（ICA）和左侧翼腭动脉（PPA）。</li>
	<li>使用单极电凝器烧灼左侧甲状腺上动脉（左侧颈外动脉的分支），并使用无菌7-0黑色丝线对左侧近端颈外动脉（ECA）进行松结扎，对更远端部位进行紧结扎。</li>
	<li>使用显微剪刀在ECA结扎部位之间打一个小孔（直径约0.2 ~ 0.25 µm）。</li>
	<li>在松开ECA近端结扎线的同时，将含有血栓的导管插入ECA的小孔中。当导管推进至CCA后，再次收紧ECA近端结扎线，以固定导管位置。</li>
	<li>电凝切断ECA远端部分（位于远端结扎点以远），并在从CCA撤出导管的同时，顺时针旋转游离的ECA近端，使其与ICA方向对齐。随后，在松开ICA结扎线后立即将导管向前推进约9 mm，进入远端ICA的MCA−ACA分叉区域，然后重新收紧ICA结扎线。</li>
	<li>轻压1 ml注射器，缓慢推注血栓，将其送入分叉区域。观察多普勒脑血流（CBF）是否下降；若血栓成功阻塞血管，CBF应较基线水平降低30%或以上（图2B）。</li>
	<li>撤出导管后，立即紧密结扎ECA近端部位。同时，解除CCA和PPA的结扎。</li>
	<li>使用6-0丝线缝合切口。在持续进行多普勒血流监测一段时间（本实验中为注射血栓后30分钟）后停止麻醉。将小鼠放入空笼中，并用加热灯保温。在小鼠恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得离开无人看护状态。</li>
</ol>
3. 体内 脑血栓的显微CT成像（图3）
<ol>
	<li>使用2%异氟烷在脑动脉血栓形成导致栓塞性卒中发作后预先设定的时间点（此处为1小时）对小鼠进行再次麻醉，操作方法同步骤2.1。通过确认足趾夹捏反射消失来确保麻醉深度充分。在每只眼睛上涂抹少量兽用眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。</li>
	<li>重悬纤维蛋白靶向金纳米颗粒（fib-GC-AuNP）4在10 mM PBS中以10 mg Au/ml的浓度制备，超声处理血栓成像剂30分钟，以确保纳米颗粒的充分溶解与分散。向阴茎静脉注射300 µl fib-GC-AuNP（10 mg/ml）。</li>
	<li>将动物置于微型CT设备的床面上，用系在针上的细线牵拉上门齿以拉直颈部，从而减少运动伪影。</li>
	<li>注射 fib-GC-AuNP 后 5 分钟开始获取脑部的 microCT 图像。本实验采用以下成像参数：65 kVp，60 µA，26.7 x 26.7 x 27.9 mm3 视野，0.053 x 0.053 x 0.054 mm3 体素大小，每帧100毫秒，平均1次，360个投影，重建矩阵512 × 512，600层，扫描时间64秒。</li>
	<li>将小鼠放回空笼中，并使用加热灯保持其温暖。在小鼠恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。</li>
	<li>使用“将原始图像数据转换为医学数字成像和通信（DICOM）格式开始“的”命令重建微型CT扫描仪上安装的软件包中的面板。</li>
	<li>对于图像的定量分析（步骤6），根据制造商的说明，使用商用软件包将DICOM数据转换为TIFF格式。</li>
	<li>为进行定性分析以及更简单、更快速的定量分析，可使用软件包及原始的0.054 mm层厚DICOM格式图像，生成一组新的轴向和冠状图像，层厚设为1或2 mm（此处为2 mm），具体步骤如下。
	<ol>
		<li>选择DICOM文件夹在“数据来源树中，单击鼠标右键，将文件夹导入到“MasterDB或PrivateDB'.</li>
		<li>点击“MasterDB或PrivateDB“数据源”树中，选择导入的文件夹。单击左侧面板上的“3D”选项卡后，当“加载选项”窗口弹出时，按下“好的将文件夹中的图像序列作为堆栈导入。</li>
		<li>将图像表示形式更改为最大强度投影（MIP）格式，方法是点击“MRP在轴向和冠状图像窗口中选择“MIP弹出菜单中，然后点击“将图像厚度更改为2 mm”TH ： 0 [mm]在相同的窗口中。</li>
		<li>使用宽度为 2 mm 的 3D 导航条，该导航条可实现对图像堆栈的浏览，并在合适的角度和位置进行切片，制备一幅完全覆盖 Willis 环（COW）的 2 mm 厚轴向截面图像，Willis 环内含有血栓。点击“捕获”按钮（相机图标）输出保存图像为TIFF格式。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>然后，制备五张2 mm厚的冠状切面图像，连续覆盖从额叶到小脑的区域。
	<ol>
		<li>首先，通过在轴向图像上仔细调整导航条的位置，使冠状位图像能够最清晰地显示大脑中动脉（MCA）−大脑前动脉（ACA）血栓，从而制备第二切片。</li>
		<li>接下来，以连续的方式准备其余四个切片。点击“捕获”按钮（相机图标）输出面板。将图像保存为TIFF格式。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 溶栓治疗与 体内 脑血栓的显微CT成像（图3）
<ol>
	<li>准备一根长度为 100 cm 的 PE-10 管，一端连接 30 号针头，另一端连接 1 ml 注射器。在避免产生气泡的情况下，用生理盐水（600 µl）或 tPA（此处为 24 mg/kg，600 µl）充满管道。</li>
	<li>按照步骤 2.1 所述方法重新麻醉小鼠。将针头插入动物的阴茎静脉。小心地将动物放置于 microCT 仪器的床面上。然后用胶带将静脉注射导管系统的注入部分固定在床面上，以实现固定和稳定。</li>
	<li>进行随访成像，作为治疗前的基线数据。随后通过推动注射器活塞，向导管系统内注射 60 µl 正常生理盐水或 tPA。在团注给药后，开始在一定时间内（此处为 30 分钟）输注剩余溶液（540 µl）。</li>
	<li>在预设的时间点（此处为团注后 3 小时和 24 小时），使用与步骤 3.4 相同的参数获取 microCT 图像。为进行后续脑部血栓的离体近红外荧光（ex vivo NIRF）成像，需在麻醉状态下通过颈椎脱位处死动物。</li>
</ol>
5. 离体 近红外荧光血栓成像与脑组织三苯基四氮唑氯化物（TTC）染色（图4）
<ol>
	<li>处死动物后，去除头皮，并从枕骨大孔沿矢状缝方向用剪刀剪开颅骨。使用剪刀小心抬起切开的颅骨边缘，避免损伤下方脑组织，从而暴露大脑半球。</li>
	<li>尽可能靠近脑表面切除脑基底部的视神经，因为视神经可能与需在近红外荧光（NIRF）成像中显示的Willis环动脉重叠。随后，为清晰显示用于NIRF血栓成像的“大脑中动脉/前动脉/远端颈内动脉”Y形结构，在轻压小脑基底部以暴露切割位置后，尽可能贴近脑表面切除远端颈内动脉（图4A）。</li>
	<li>将取出的脑组织基底朝上进行近红外荧光成像（激发/发射波长：675 / 690 nm，曝光时间1秒）（图4B, C），以显示Willis环动脉中荧光标记的血栓栓子（图4D）。随后将脑组织顶点朝上进行额外成像，以显示皮层血栓栓子。成像过程中应滴加数滴生理盐水，防止脑组织干燥。</li>
	<li>根据制造商说明使用脑切片模具，快速制备2 mm厚的冠状脑切片：共6片（分别位于前囟前后2.3、0.3、-1.7、-3.7、-5.7 mm处）。切片过程中应使用生理盐水滴加以防止干燥，并对每片切片的前后表面均进行近红外荧光成像。</li>
	<li>将脑切片置于2%氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液中染色20分钟，避免光照。随后将切片转移至4 °C的4%甲醛溶液中固定，同样避免光照。</li>
</ol>
6. 使用MicroCT图像和ImageJ（1.49d）软件定量分析血栓面积（图5）
<ol>
	<li>开放图像（图5A).
	<ol>
		<li>打开图像序列文件，通过选择“创建堆栈文件”来生成堆栈文件文件 &#62; 导入 &#62; 图像序列或文件 &#62; 开放将图像转换为8位灰度图，方法是使用“图像 &#62; 类型 &#62; 8位'.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将单位从英寸转换为毫米图5A).
	<ol>
		<li>当CT图像文件的一个像素对应0.053 mm时，使用 分析 &#62; 设定比例尺 输入“1”、“0.053”和“mm”作为“像素距离', '已知距离，和“长度单位，分别。</li>
		<li>当仅有比例尺可用时，使用“直线”工具绘制一条长度与比例尺相等的线段。然后，使用“分析 &#62; 设定比例尺输入比例尺的长度（单位：毫米）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>背景扣除（图5B)
	<ol>
		<li>通过使用“编辑&#62; 选择&#62; 指定 在脑实质区域（避开血栓或与骨骼相关的高密度区域）放置一个圆形或矩形的兴趣区（ROI）。由于所设定的ROI会应用于整个图像序列的每一层，需逐一检查各层，确保该ROI未与任何高密度区域重叠。</li>
		<li>选择 插件 &#62; 感兴趣区域 &#62; 从 ROI 中减去背景信号 并输入 2.0 作为“与均值相差的标准差数”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血栓栓塞相关高密度病灶的分割（图5C)
	<ol>
		<li>选择“图像 &#62; 调节 &#62; 阈值，分别输入“下限阈值”和“上限阈值”的值为 22 和 255。选择 过/不足 将低于下限阈值的像素显示为蓝色，阈值内的像素显示为灰度，高于上限阈值的像素显示为绿色。</li>
		<li>使用“自由选择工具”绘制围绕血栓栓塞相关高密度病灶的感兴趣区域（ROI），注意避免包含骨性区域。绘制过程中，持续按住 [shift] 键可添加区域，按住 [alt] 键可删除区域。 
		注意：如果高密度血栓栓塞性病变远离骨性结构，可安全使用“魔棒工具”（Wand Tool）代替“手绘选择工具”（Freehand Selection Tool），且无需调整其“容差”（Tolerance）水平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分割病灶的定量分析（图 5D)
	<ol>
		<li>使用 分析 &#62; 设置测量参数 选择“面积”、“平均灰度值”和“积分密度（面积 × 平均值）”。勾选以下选项：“限定于阈值范围”和“显示标签”。使用 分析 &#62; 测量 以获取定量数据。然后，将结果保存为 &#34;.xls&#34; 文件。</li>
		<li>将堆栈文件保存为 TIFF 格式。此外，使用“分析 &#62; 工具 &#62; ROI 管理器 保存感兴趣区域。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

D-E.K.、J-Y.K.、C-H.A. 和 K.K. 是靶向纤维蛋白的金纳米颗粒专利持有人（10-1474063-0000，韩国知识产权局）。其余作者无任何利益冲突需要披露。

我们展示了两种互补的分子成像技术在栓塞性卒中实验模型中用于直接血栓成像的应用：一种靶向纤维蛋白的金纳米颗粒（fib-GC-AuNP）用于 体内 基于microCT的成像，以及FXIIIa靶向光学成像探针 离体 荧光成像
静脉注射 fib-GC-AuNPs 后，由于颗粒表面的纤维蛋白靶向肽作用，颗粒经浓度梯度依赖性扩散进入血栓多孔结构并被截留，使血栓在CT下呈现为致密的可见结构。 即， 血栓。这一过程似乎仅单向发生，迅速使血液中相对较低浓度的纳米颗粒在血栓中富集，并显著改变其CT密度，从而实现检测。最终 体内 24小时时的microCT成像与死后NIRF成像结果具有良好的相关性 离体 脑组织，显示初始血栓在被置入脑动脉前已通过识别FXIIIa纤维蛋白交联活性的光学探针进行荧光标记，经tPA治疗后仍残留。通过这种方式，两种分子成像探针利用不同的作用机制和成像方式，相互报告并交叉验证彼此的结果。
血栓的演变过程可采用相同方法进行监测；具体而言，...

每6人中就有1人会在一生中的某个阶段发生中风。缺血性中风是最常见的中风类型，约占所有中风病例的80%。由于大多数缺血性中风由血栓栓塞引起，因此人们对血栓的直接成像技术日益关注。
据估计，在大脑中动脉闭塞的每分钟内约有200万个脑细胞死亡1，从而提出了这一口号 &#34;时间就是大脑&#34;计算机断层扫描（CT）检查可快速完成且广泛可用；因此，CT 仍是超急性期缺血性卒中初始诊断和治疗的首选影像学方法。CT 在指导关键的早期决策方面尤为有价值，包括是否给予组织型纤溶酶原激活剂（tPA）进行溶栓治疗，以及是否将患者分诊至血管内取栓治疗。2然而，目前基于CT的血栓成像技术尚无法对脑部血栓栓塞进行连续追踪 体内，因为它采用间接方法来显示血栓：通过碘化对比剂使血池显影后，血栓表现为血管内的充盈缺损。反复使用碘化对比剂存在剂量限制和相关风险，因此不宜采用此种方法进行多次血栓成像。
因此，迫切需要一种针对卒中患者脑血栓的直接成像方法，以实现更快速、更准确的治疗决策。我们建议通过使用一种靶向血栓的纳米颗粒分子成像剂，提升目前临床用于卒中一线成像的CT技术的价值，从而实现这一目标。
我们已通过微计算机断层扫描（microCT）展示了该显像剂的使用，microCT 是一种高分辨率的 CT 成像技术，可用于离体（ex vivo）或活体（in vivo，小动物）成像，能够实现快速数据采集3,4。即使在小动物 microCT 中软组织对比度相对较低（远低于人体尺寸扫描仪所能达到的水平）的情况下，该显像剂仍能通过使血栓在 CT 上呈现高密度，实现对血栓的靶向与标记，产生由分子成像增强的“血管致密征”。
作为CT技术的补充，我们课题组先前开发了一种利用Cy5.5近红外荧光（NIRF）探针进行脑血栓负荷光学直接成像的技术5。该技术用于死后脑组织的ex vivo检测，具有高度敏感性，在研究环境中可用于验证in vivo实验数据。
同时采用基于CT和近红外荧光（NIRF）的血栓靶向成像技术，可对这些技术进行比较和对照，从而获得关于血栓及其成像在缺血性卒中发生过程中作用的高信息量数据。
此处，我们介绍一种联合技术的详细实验方案 体内 microCT 和 离体 近红外荧光成像技术用于直接可视化栓塞性卒中动物模型中小鼠体内的血栓栓子。这些简单且可靠的方法有助于通过实现精确的血栓检测，推动我们对血栓性疾病机制的理解 体内 血栓负荷/分布的评估及动态血栓演变的快速定量表征 体内 治疗期间，随后 离体 作为确认的对照和参考标准的数据 体内 影像学发现

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microCT</td><td>NanoFocusRay, 全州, 韩国</td><td>NFR Polaris-G90</td><td></td></tr><tr><td>NIRF 成像系统</td><td>Roper-scientific, 图森, 亚利桑那州, 美国</td><td>coolsnap-Ez</td><td></td></tr><tr><td>激光多普勒血流仪</td><td>Perimed, 斯德哥尔摩, 瑞典</td><td>PeriFlux System 5000</td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>Leica Microsystems, 首尔, 韩国</td><td>EZ4HD</td><td></td></tr><tr><td>吸入麻醉机</td><td>PerkinElmer, 马萨诸塞州, 美国</td><td>XGI-8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NFR 控制软件</td><td>NanoFocusRay, 全州, 韩国</td><td>NFR Polaris-G90</td><td>microCT 控制软件</td></tr><tr><td>Lucion</td><td>Infinitt, 首尔, 韩国</td><td>Lucion</td><td>三维重建成像软件</td></tr><tr><td>Lab chart 7</td><td>ADInstruments, 科罗拉多州, 美国</td><td>Lab chart 7</td><td>rCBF</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>Wanye Rasband, NIH, 美国</td><td>1.49d</td><td>图像分析</td></tr><tr><td>设备/仪器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>输液泵</td><td>Harvard, 马萨诸塞州, 美国</td><td>pump 22(55-2226)</td><td></td></tr><tr><td>恒温毯</td><td>Panlab, 巴塞罗那, 西班牙</td><td>HB101</td><td></td></tr><tr><td>便携式电凝器</td><td>Daejong, 首尔, 韩国</td><td>DJE-39</td><td></td></tr><tr><td>脑切片模具</td><td>Ted pella, 加利福尼亚州, 美国</td><td>15003</td><td>冠状切面</td></tr><tr><td>PE-50 管</td><td>Natsume, 东京, 日本</td><td>SP-45(PE-50)</td><td>内径 0.58 mm，外径 0.96 mm</td></tr><tr><td>PE-10 管</td><td>Natsume, 东京, 日本</td><td>SP-10(PE-10)</td><td>内径 0.28 mm，外径 0.61 mm</td></tr><tr><td>30 号针头</td><td>sungshim-medical, 首尔, 韩国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>CPL-medical, 安山, 韩国</td><td></td><td>1 &amp; 3 cc</td></tr><tr><td>纱布</td><td>Panamedic, 天安, 韩国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶带</td><td>Scotch, 首尔, 韩国</td><td>3M-810</td><td></td></tr><tr><td>显微镊子</td><td>Fine Science Tools, 温哥华, 加拿大</td><td>&amp;nbsp;11253-27</td><td>Dumont #L5</td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td>Fine Science Tools, 温哥华, 加拿大</td><td>15000-03</td><td>Vannas 弹簧剪</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools, 温哥华, 加拿大</td><td>14084-08</td><td>8.5 cm</td></tr><tr><td>黑色丝线缝合线</td><td>Ailee, 釜山, 韩国</td><td>SK6071, SK728</td><td>6-0 和 7-0</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>美洛昔康</td><td>Yuhan, 首尔, 韩国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>兽用软膏</td><td>Novartis, 巴塞尔, 瑞士</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 聚维酮碘（贝塔碘）</td><td>Firson, 天安, 韩国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma, 密苏里州, 美国</td><td>157740-5G</td><td></td></tr><tr><td>TTC</td><td>Amresco, 俄亥俄州, 美国</td><td>0765-100g</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Hana-Pham, 京畿道, 韩国</td><td>Ifran</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Welgene, 大邱, 韩国</td><td>LB001-02</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>金纳米颗粒</td><td></td><td></td><td>合成</td></tr><tr><td>C15 光学造影剂</td><td></td><td></td><td>合成</td></tr><tr><td>组织型纤溶酶原激活剂</td><td>Boehringer Ingelheim, 比伯拉赫, 德国</td><td>rtPA(actilyse)</td><td>20 mg</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Daihan Pham, 首尔, 韩国</td><td>48N3AF3</td><td>20 ml</td></tr></tbody></table>

结合近红外荧光成像与显微计算机断层扫描直接可视化脑血栓栓塞

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

直接血栓成像可直观显示血栓栓塞性梗死的根本原因。相较于依赖间接测量方法，直接成像血栓能够更深入地研究卒中机制，并将成为一种强大而可靠的血管研究工具。我们采用一种光学成像方法，利用分子影像血栓标志物对血栓进行标记—— 一种Cy5.5近红外荧光（NIRF）探针，该探针在血栓成熟过程中，通过活化凝血因子XIIIa对纤维蛋白的交联酶促作用，共价结合于血栓中的纤维蛋白链上。一种基于显微计算机断层扫描（microCT）的方法则利用靶向血栓主要成分——纤维蛋白的金纳米颗粒（AuNPs），该纳米颗粒经功能化修饰以特异性识别血栓。本文描述了一种联合使用的详细实验方案 体内 microCT 和 离体 小鼠栓塞性卒中模型中血栓栓塞的近红外荧光成像。我们表明 体内 microCT 和靶向纤维蛋白的甘油基壳聚糖金纳米颗粒（fib-GC-AuNPs）可用于同时可视化 原位 血栓和脑栓塞性血栓。我们还描述了以下用途 体内 基于microCT的直接血栓成像用于连续监测组织型纤溶酶原激活剂介导溶栓治疗的疗效。在最后一次成像后，我们通过 离体 近红外荧光成像技术用于检测脑内残留血栓栓塞的范围与分布。最后，我们描述了对显微CT和近红外荧光成像数据进行的定量图像分析。这种直接血栓成像的联合技术可实现两种独立的血栓可视化方法之间的比较：基于血栓相关荧光信号区域的 离体 近红外荧光成像与高密度微计算机断层扫描血栓体积的比较 体内.

基线 microCT 图像，获取于 体内 在给予 fib-GC-AuNP（10 mg/ml， 300 &#181;l)在栓塞性卒中发生后1小时，清晰地观察到大脑中动脉–大脑前动脉分叉区域的颈内动脉远端存在脑血栓图6）。随访的微CT成像显示，经生理盐水处理后，颈外动脉分叉处（COW）血栓无变化。然而，tPA处理显示出COW血栓逐渐溶解（蓝色箭头所示） 图6）。该发现表明，微计算机断层扫描（microCT）血栓成像可用于溶栓治疗的监测。血栓体积的影像学测量结果与组织学分析之间具有良好的一致性。 体内 CT密度与 离体 24小时时残余血栓的近红外荧光成像。请注意，由于纤维蛋白靶向金纳米颗粒对内源性血栓的标记作用，在微CT中呈现高密度区域，这些区域与近红外荧光信号区域高度共定位；后者是通过在栓塞性卒中发生前使用对凝血因子XIIIa介导的纤维蛋白交联活性敏感的Cy5.5荧光探针对外源性血栓进行标记而实现的，该过程反映了预形成血栓的成熟过程图6</...

本方案描述了联合近红外荧光（NIRF）成像与微型计算机断层扫描（microCT）技术用于可视化脑血栓栓塞的应用。该技术可实现对血栓负荷及其演变过程的定量分析。NIRF成像技术可用于观察离体脑组织中荧光标记的血栓，而microCT技术则利用金纳米颗粒在活体动物体内实现血栓的可视化。

直接血栓成像可显示血栓栓塞性梗死的根本原因。能够直接对血栓进行成像，有助于更深入地研究……

该直接血栓成像技术的总体目标是利用金纳米颗粒、计算机断层扫描（CT）和近红外荧光成像，在活体及离体条件下对荧光标记的脑血栓栓塞进行定量可视化观察。该方法有助于解答止血与血栓领域中的关键科学问题，例如脑血栓栓塞对组织型纤溶酶原激活剂或正在研究中的新型溶栓药物的时间依赖性或剂量依赖性反应，以及严重的骨科相关反应。该技术的主要优势在于：静脉注射金纳米颗粒后，高分辨率显微CT可实现对脑血栓栓塞动态演变过程的捕捉，通过在活体内定量显示其位置和负荷量，并进一步通过离体近红外荧光血栓成像加以验证。该操作将由我实验室的博士后 Jeong-Yeon Kim 演示。通过心脏穿刺采集 300 至 1,000 微升动脉血后，取 70 微升样本加入 30 微升适当的活化凝血因子、13 型介导的纤维蛋白交联活性荧光探针，混匀后将所得混合物装入一支配有 23 号针头的 3 毫升注射器中。接着，将标记后的血液注入一段 20 厘米长的聚乙烯管中，并在室温下静置使血液凝固。两小时后，将试管转移至 4 摄氏度环境中放置 22 小时，然后将管子切成 1.5 厘米长的片段。使用一支装有 PBS 的 3 毫升注射器，将每个管段中的血栓推出，分别放入含有 PBS 的 6 孔板的各个孔中。用 PBS 将血栓清洗三次，然后将一端连接 30 号针头、并充满生理盐水的 1 毫升注射器插入 15 厘米长 PE10 管的一端，小心地将一个经清洗的血栓吸入管子的另一端。然后，将装有血栓的PE10管与一根长3厘米、末端渐细（直径200微米）的PE50管连接。通过夹捏脚趾无反应确认麻醉成功后，用聚维酮碘（Betadine）和70%酒精对手术区域进行消毒，并使用手术刀在左耳与左眼之间的区域做一条长1厘米的垂直切口。将激光多普勒血流仪的光纤远端用胶水固定于暴露的左侧颞骨表面，位置在冠状缝左侧1毫米、下方4毫米处，并开始进行多普勒血流监测。然后，通过血管周围软组织做一条3厘米长的垂直正中切口，暴露左侧颈动脉球区域。使用无菌6-0黑色丝线结扎左侧近端颈总动脉，随后使用无菌7-0黑色丝线结扎左侧颈内动脉和左侧翼腭动脉。使用单极电凝器烧灼左侧甲状腺上动脉，然后使用无菌7-0黑色丝线对左侧近端颈外动脉进行松扎，对血管远端进行紧扎。使用显微剪刀在颈外动脉结扎位点之间制作一个0.2至0.25微米的孔，同时松开近端颈外动脉的结扎处，将含有血栓的导管插入该孔中。将导管向前推进至颈总动脉，以固定导管位置，并重新收紧近端颈外动脉的结扎线。用电灼法切断颈外动脉的远端，顺时针旋转颈外动脉游离的近端，使血管与颈内动脉对齐，同时撤出导管。然后，松开颈内动脉结扎线，并立即向前推进导管约九毫米，到达大脑中动脉与大脑前动脉分叉处。此时，在导管周围重新收紧颈内动脉缝线，并轻柔按压注射器，将血栓注入分叉区域。若多普勒监测显示血流较基线水平降低30%或以上，应立即拔

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来源： Kim, D., et. al. 结合近红外荧光成像与微型计算机断层扫描直接可视化脑血栓栓塞。 J. Vis. Exp.

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来源：Kim, D. E., et al. 联合近红外荧光成像与显微计算机断层扫描直接可视化脑血栓栓塞。 J. Vis. Exp.

利用近红外荧光成像技术观察小鼠脑血栓

本文旨在介绍一种方法，该方法可在小鼠微计算机断层扫描后实现脑血管树的三维重建，并测定整个血管节段的体积，可用于量化蛛网膜下腔出血小鼠模型中的脑血管痉挛。...

一种用于量化蛛网膜下腔出血小鼠模型中脑血管痉挛的容积法

传统的光化学血栓性卒中（PTS）模型主要诱导形成对组织型纤溶酶原激活物（tPA）溶栓治疗具有高度抵抗性的致密血小板聚集体。本文介绍了一种通过共注射凝血酶和光敏染料进行光激活的改良小鼠PTS模型。该凝血酶增强型PTS模型可形成血小板与纤维蛋白混合的血栓，且对tPA溶栓治疗高度敏感。...

一种富含纤维蛋白且对tPA敏感的光化学血栓性卒中模型

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用于微血管栓塞的小鼠模型 体内 使用荧光聚苯乙烯微球的双光子显微镜技术

学习结合近红外荧光成像与微计算机断层扫描技术，利用金纳米颗粒在活体及离体条件下直接可视化脑血栓并定量分析血栓负荷。该方法有助于研究血栓动态演变及溶栓治疗效果。

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