机器人平台的高通量原生质体分离和转型
2016年9月27日
高通量，自动化，烟草原生质体的生产和改造的方法进行描述。该机器人系统可以在模型BY-2系统应该是翻译到非模式作物大规模并行基因表达和发现。
该方案的总体目标是开发一种快速、自动化、高通量筛选植物原生质体的方法，特别是解决当前早期筛选大量基因组编辑和基因沉默靶标的瓶颈。这种方法可以帮助回答植物生物技术领域的关键问题。该技术的主要优点是它能够实现高通量自动化原生质体生产和转化，以快速平行筛选基因表达中的启动子功能。
该程序将使用广泛使用的烟草亮黄色二 （BY-2） 悬浮培养物进行演示。首先在 Erlenmeyer 培养瓶中培养 BY-2 培养物，如方案文本中所述。在原生质体分离当天，充分混合培养物，因为细胞会迅速沉降，并将 6 毫升培养物转移到 15 毫升锥形底离心管中。
让细胞静置至少 10 分钟。通过去除适当体积的上清液，将填充细胞体积调节至总体积的 50%。倒置试管摇晃试管，然后使用宽口径移液器将 500 微升细胞悬液移液到六孔板的每个孔中进行消化。
此过程的第一步是打开机器人系统的所有组件，即微孔板移动器、液体处理器、多功能读板器、多功能分液器、板加热器或冷却器以及计算机。接下来，打开微孔板移动机械师任务调度软件，该软件将微孔板移动机械臂与其他设备集成在一起，以实现每台设备之间的板转移。在板移动器软件中，定义方案中使用的实验室器皿的技术规格。
单击主工具栏中的 Setup，然后选择 Manage Container Types 命令。从现有 Container Types 列表中选择适当的 Container Type。定义印版移动机械臂将遇到的所有实验室器皿的技术规格。
下一步是定义每个容器的 Start 和 End 位置。单击特定协议中的 Start/End 选项卡。选择每个容器的 Start 位置，并在 Start 和 End 位置选中 Lidded， Unlidded 框。
定义每个实验室器皿的开始和结束位置后，手动将所有板加载到整个工作流程的起始位置。将 96 孔荧光筛选板加载到酒店 2 中，将带有 BY-2 细胞的 6 孔板加载到酒店 3 中，将用于转化到板加热器或冷却器的巢 2 上的 96 深孔板，以及将含有酶溶液的 50 毫升锥形管加载到多功能分配器上。为了在方案中进行转化，在 96 深孔板的每个孔中预装 10 微升含有橙色荧光蛋白报告基因构建体的血浆 DNA，并在板加热器或冷却器上以 4 摄氏度孵育。
将所有耗材和板加载到指定位置的自动液体处理平台上。在第 1 列中，每孔预装了 200 μL 40% 聚乙二醇溶液的 96 孔板上样。在巢 8 中装入一盒移液器吸头。
要在自动化液体处理平台软件中定义每个项目的位置，请从菜单中选择 Tools（工具），然后单击 Labware Editor（实验室器皿编辑器）。从下拉菜单中选择实验室器皿的类型。选择"主方案"选项卡，然后单击"配置实验室器皿"以定义每个实验室器皿的位置。
单击 Run 以初始化将在协议中使用的所有设备。最后，在 Work Explorer 窗口中，单击 Add Work Unit（添加工作单元）以验证系统中的所有实验室器皿并开始自动化方案。该程序最敏感的部分是原生质体转化。
由于转换是由机器人系统执行的，因此正确设置自动化协议至关重要。在本视频中，将仅显示自动化方案中的选定步骤。在转化方案期间，自动液体处理平台从 6 孔板中吸出 70 μL 原生质体溶液，并将其分配到 nest six 的 96 深孔板中。
然后，使用新的移液器吸头从预装的深孔板中缓慢吸出 70 μL 高粘度聚乙二醇溶液，并将溶液完全分配到深孔板的适用孔中。接下来，自动液体处理平台将深孔板从下一个 6 个巢移动到嵌套 9，在那里板移动器拾取板并将其移动到板振荡器站，并以 1500 RPM 的速度摇动 30 秒。在不摇晃的情况下孵育 20 分钟以平衡原生质体后，板移动器将 96 深孔板移至多功能分液器并触发洗涤方案。
当自动原生质体分离和转化方案完成后，从机器人系统之一的酒店中取出带有转化原生质体的板。打开倒置显微镜、相机和荧光灯。选择 10X 物镜以初始聚焦原生质体。
打开卤素灯并关闭荧光灯的快门。将板加载到显微镜系统上，并使用明场聚焦原生质体。接下来，关闭卤素灯泡并打开荧光灯的快门。
选择 Cy 3 / TRITC 滤光片组，用于观察转基因原生质体表达的橙色荧光蛋白。扫描每个孔以确定表达荧光标记物的原生质体的数量。在本方案规定的条件下对原生质体进行酶消化，导致每个六孔板产生 2， 820， 000 个原生质体。
评估方案中每个转移步骤后原生质体浓度的损失。消化方案后，将 11， 500 个原生质体转移到 96 深孔板的每个孔中。转化方案完成后，将 1， 230 个原生质体转移到 96 孔荧光筛选板中。
为确保多个移液阶段不会损坏原生质体，通过碘化丙啶染色测定其活力。结果显示，消化后、转移到 96 孔荧光筛选板后和转化方案后，活力无显著差异。转化方案成功生成了表达橙色荧光蛋白的转基因细胞，尽管转化效率较低，只有 2% 左右这是由于使用了大的二元质体，并且该方案没有专门针对 BY-2 原生质体进行优化。
为协议的时间进程获得的指标表明，主要的时间投入是在消化阶段花费的。原生质体分离和转化的完整持续时间为 3 小时 50 分 53 秒，无需作员进行外部输入。一旦设置正确，机器人可以在不到四个小时的时间内完成这项技术。
该技术开发后，为植物生物技术领域的研究人员进行高通量作物基因组程序铺平了道路，例如基因组编辑和启动子筛选。
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概述
本文描述了一种高通量、自动化的烟草原生质体生产和转化方法。该机器人系统在BY-2模型系统中促进了大规模并行基因表达和发现，具有在非模型作物中应用的潜力。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物生物技术
- 基因组学
- 基因表达
背景
- 基因组编辑和基因沉默目标筛选的当前瓶颈。
- 原生质体在植物研究中的重要性。
- 生物技术中对快速筛选方法的需求。
- BY-2悬浮培养作为广泛使用的模型系统。
研究目的
- 开发一种快速、自动化的植物原生质体高通量筛选方法。
- 提高基因表达研究的效率。
- 解决基因目标早期筛选的挑战。
使用的方法
- 在Erlenmeyer烧瓶中培养BY-2。
- 在原生质体分离之前彻底混合培养物。
- 将培养物转移到离心管以进行原生质体分离。
- 用于高通量分析的自动化转化过程。
主要结果
- 成功开发了一种高通量原生质体生产方法。
- 展示了快速并行筛选能力。
- 在非模型作物中应用的潜力。
- 在基因表达中理解启动子功能的进展。
结论
- 自动化方法显著提高了原生质体生产效率。
- 这种方法可以促进大规模基因表达研究。
- 它在植物生物技术中具有广泛应用的前景。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput protoplast isolation and transformation addresses a critical bottleneck in early-stage plant biotechnology screening, enabling rapid parallel evaluation of genome editing and gene silencing targets. The robotic platform reduces operator dependence and accelerates discovery timelines for promoter function analysis and trait validation. This capability supports predictive confidence in target selection and portfolio prioritization for crop improvement programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulatory networks and promoter function in a high-throughput format.
- Operational Value: Automates protoplast isolation and transformation, reducing manual variability and increasing reproducibility.
- Predictive Value: Supports rapid screening of genetic constructs to de-risk target hypotheses before downstream investment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts via OFP reporter expression for promoter activity assessment.
- Operational Value: Standardizes protoplast production and transformation across 96-well formats for scalable screening.
- Assay Readiness: Enables preparation of validated protoplast systems for compound or genetic library evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase promoter screening with preclinical trait validation in crop systems.
- Disease-Relevant System: Applicable to any plant suspension culture, supporting broad crop genomics relevance.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions based on reproducible transformation efficiency and reporter expression.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow from target hypothesis testing through lead identification, enabling rapid protoplast-based screening prior to stable line generation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of promoter function and gene expression dynamics in a controlled, high-throughput system.
- Screening: Delivers assay-ready protoplasts with standardized isolation and transformation for library-scale evaluation.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence measurements and viability metrics via propidium iodide staining for data-driven comparisons.
- Translational Research: Enables continuity from BY-2 model screening to non-model crop applications through translatable protocols.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable robotic platform for repeated protoplast-based assays across projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through reproducible, high-resolution promoter activity readouts.
- Operational Value: Achieves full automation from isolation to transformation in under 4 hours, minimizing hands-on time and batch effects.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid screening of numerous targets with minimal reagent waste via low-cost food-grade enzymes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets based on scalable, quantitative expression data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in robotic platform programming, liquid handling, and fluorescence microscopy.
- Dependent on integrated instrumentation including microplate movers, dispensers, plate readers, and environmental controllers.
- Necessitates cross-team standardization of labware definitions, start/end positions, and protocol scheduling.
- Adaptation across model systems may require optimization of enzyme concentrations and transformation conditions.
- Transformation efficiency is influenced by plasmid size and protoplast susceptibility, necessitating empirical tuning for new systems.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Establishment of Suspension Cell Cultures
1:40
Set up of Automated Protocols for Protoplast Isolation and Transformation
5:16
Automated Protocols
6:37
Microscopic Analysis of Transformation
7:42
Results: Rapid, Automated, High-throughput Screening of Plant Protoplasts
9:40
Conclusion
