Name: 对大脑中动脉闭塞再灌注损伤诱发中风小鼠的手术方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学习Longa法建立小鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型，用于研究缺血性中风病理机制及治疗靶点。该方法可提高存活率并稳定诱导脑缺血损伤，适用于神经科学研究。

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本工作由美国国立卫生研究院、国家心肺血液研究所（NIH 和 NHLBI；HL125572-01A1）以及 LSUHSC-S 为 F.N.E. Gavins 提供的启动资金资助。

本方案及视频中报告的实验均已获得LSUHSC-S机构动物照护与使用委员会的批准，并符合美国国立卫生研究院（NIH）的指导方针。
注意：本研究使用体重为 25 - 29 g 的雄性 C57BL/6 小鼠。小鼠饲养在独立通风笼具中，采用标准颗粒饲料喂养，并可自由饮水，光照/黑暗周期为 12 小时交替。所有操作均在无菌条件下进行，并采用无菌技术（例如，使用无菌手套、无菌器械）。
1. 术前准备
<ol>
	<li>通过腹腔注射（i.p.）给予氯胺酮（150 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）的组合以诱导麻醉。最初每3-5分钟通过足部夹捏监测一次麻醉深度，达到麻醉状态后每10分钟监测一次。动物处于麻醉状态时，使用无菌眼膏以防止角膜干燥。&#160;氯胺酮/赛拉嗪的初始剂量通常可持续约30-40分钟。&#160;若需要，可根据动物对足部夹捏的反应追加给药。</li>
	<li>将小鼠仰卧置于温度可控的加热垫上，并使用直肠探针确认其体温维持在36.5 ± 0.1 °C。</li>
	<li>剃除颈部毛发，并用70%乙醇对皮肤进行消毒。&#160;</li>
</ol>
2. 大脑中动脉闭塞（图1）
<ol>
	<li>使用直头虹膜剪在颈部正中做切口，并用牵开器牵开软组织以暴露血管。</li>
	<li>使用杜蒙镊子仔细分离颈总动脉（CCA）和颈外动脉（ECA）周围的组织，避免损伤迷走神经。</li>
	<li>用6-0丝线在颈总动脉上打一个松结，作为临时结扎线。</li>
	<li>在颈外动脉及其发出的细小分支血管上（位于颈总动脉分叉远端）进行牢固结扎，形成永久性结扎。</li>
	<li>在颈总动脉分叉近端的颈外动脉上再打一个结扎线。</li>
	<li>在颈内动脉（ICA）和翼腭动脉（PPA）上放置微血管夹。</li>
	<li>使用显微解剖弹簧剪在颈外动脉上做一个小切口，插入直径为180 μm的硅胶头单丝线。切口应尽量靠近永久结扎线，以便于导丝操作。</li>
	<li>在插入导丝后收紧颈外动脉上的临时结扎线，并移除微血管夹。</li>
	<li>使用显微解剖弹簧剪在永久性远端结扎线与导丝进入点之间的位置剪断颈外动脉。</li>
	<li>将导丝沿颈内动脉向前推进，直至感到阻力（约在颈总动脉分叉处远端9–10 μm处到达大脑中动脉）。 
	注意：如果导丝大部分仍可见时即遇到较大阻力，可能提示导丝已进入翼腭动脉（PPA）。此时应将导丝回撤至分叉处，用杜蒙镊子轻柔地将其推入颈内动脉（ICA），然后继续推进导丝，直至可在颈内动脉内观察到导丝。</li>
</ol>
3. 再灌注
<ol>
	<li>在30分钟的闭塞期后，使用Dumont镊子轻轻向后拉出栓线，并将缝线固定在ECA的开放端。</li>
	<li>使用Dumont镊子小心松开围绕CCA的临时缝线，解除结扎，恢复CCA的血流。</li>
	<li>使用连续外科缝合关闭切口。&#160;皮肤闭合可采用连续或间断缝合方式。&#160;皮肤缝合钉也是一种可接受的方法。&#160;</li>
	<li>对小鼠皮下注射1 ml生理盐水以补充液体容量，并注射镇痛药卡洛芬（5 mg/kg，皮下注射），以缓解手术引起的疼痛和不适。需要额外镇痛的迹象包括弓背、毛发凌乱、活动减少、姿势异常以及食欲下降。</li>
	<li>在麻醉恢复期间，将小鼠置于由温度控制器调节的30 °C加热笼内，并使用加热灯保温；将软化饲料置于培养皿中并放置在笼底，以促进进食。在再灌注期间，每只笼子单独饲养一只小鼠。</li>
</ol>
4. 假手术
<ol>
	<li>对小鼠进行相同的操作，但不插入单丝纤维。</li>
</ol>
5. 术后神经功能评分（表1；图2）
<ol>
	<li>在适当的再灌注期后，使用18分评分系统对小鼠进行神经学评估，评估内容包括一般状况、运动功能、感觉功能和本体感觉。神经学评分越高，表示神经功能越差。 
	注意：对于判定为无反应且无法行走的小鼠，将实施安乐死。其他人道安乐死标准还包括体重减轻超过20%、呼吸困难以及手术区域周围出现感染。安乐死将使用CO2麻醉舱实施，并通过颈椎脱位或开胸术作为物理方法确认死亡。</li>
</ol>
6. 脑梗死体积的测量（图3）
<ol>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮（150 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）的组合诱导麻醉。最初每3-5分钟通过足部夹捏监测麻醉深度，达到麻醉状态后每10分钟监测一次。</li>
	<li>将小鼠置于仰卧位，使用直头虹膜剪从腹部至颈部剪开皮肤，随后剪开腹膜。</li>
	<li>使用Dumont镊子抬起胸骨，并剪断肋骨以暴露心脏。</li>
	<li>使用两把止血钳打开胸腔左右两侧，充分暴露心脏。</li>
	<li>将连接5 mL注射器的26 G针头插入左心室，同时剪开右心房。用室温生理盐水或磷酸盐缓冲液（PBS）灌注，直至流出液变澄清（通常需3-5分钟）。</li>
	<li>使用直头虹膜剪和Dumont镊子小心地将颅骨从脑组织上分离移除。</li>
	<li>使用刀片切除嗅球和小脑，以便脑组织能够适配于切片模具中。使用该模具将脑组织切成厚度均匀的切片。使用前将模具预冷，以保持组织低温。将脑组织放入模具后置于冰上。</li>
	<li>使用两片刀片将脑组织切成2 mm厚的冠状切片。从顶部下方2 mm处开始进行第一次切割，并将该刀片保留在原位；在第一刀后方再进行一次2 mm的切割。取下带有组织的第一片刀片。重复此过程，直至所有组织均被切片。 
	注意：完成时应得到4-5个脑片。</li>
	<li>将脑片放入含有2% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）的24孔板中，随后将该板置于37 °C的浅水浴中孵育20分钟。将每个脑片分别放入独立孔中，有助于保持其切割顺序。确保TTC溶液完全覆盖所有脑片组织。孵育10分钟后，将所有切片翻面。</li>
	<li>在新的24孔板各孔中加入少量10%福尔马林溶液，并按原始切割顺序将脑片转移至该板中。</li>
	<li>将脑片扫描进入计算机，并使用ImageJ分析软件（NIH 1.57图像软件）6分析梗死面积占整个脑切片的百分比6。
	<ol>
		<li>勾画出梗死区域以获得面积测量值。随后测量对侧半球的总面积。将梗死面积除以对侧半球面积，再乘以100，计算出梗死体积。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2014+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2014 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).</li>
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<li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema%2C+I%3A+a+new+experimnetal+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimnetal model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jpn J Stroke. (8), 1-8 (1986).</li>
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<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atorvastain+induction+of+VEGF+and+BDNF+promotes+brain+plasticity+after+stroke+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Atorvastain induction of VEGF and BDNF promotes brain plasticity after stroke in mice.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 281-290 (2005).</li>
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<li>Wiessner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-nogo-a+antibody+infusion+24+hours+after+experimental+stroke+imporved+behavioral+outcome+and+corticospinal+plasticity+in+normotensive+and+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Anti-nogo-a antibody infusion 24 hours after experimental stroke imporved behavioral outcome and corticospinal plasticity in normotensive and spontaneously hypertensive rats.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 23, 154-165 (2003).</li>
<li>Schaar, K. L., Brenneman, M. M., Savitz, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessments+in+the+rodent+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Transl+Stroke+Med%22%5BJournal%5D)">Functional assessments in the rodent stroke model.</a> Exp Transl Stroke Med. 2 (13), (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

自20年前首次提出以来，通过插入缝合丝线建立的MCAo模型已被广泛应用于大量人类中风研究中。这主要归因于该模型能够模拟临床上最常见的中风类型所发生的病理过程即， 缺血性卒中）。纹状体对缺血的敏感性高于大脑皮层，因此缺血时间的长短将决定是纹状体和背外侧皮层均受累，还是仅纹状体受损。缺血和再灌注时间均可根据需要进行调整，从而使研究者能够研究与短暂性脑缺血发作（TIAs）到更大范围脑梗死相关的病理效应。
多年来，对MCAo线栓法的改进和问题排查表明，该操作必须在无菌条件下进行，以避免感染风险9。实验结果可能因啮齿类动物的物种、品系（已有报道显示存在解剖学差异）10,11、体重以及所使用的麻醉剂不同而有所差异，但本文所呈现结果的趋势在其他开展MCAo实验的实验室中也可能出现。其他需要考虑的关键步骤包括体温、血压和血气。已有充分证据表明，体温会影响神经损伤程度，低温通常与较小的梗死病灶相关12，而高体温则会导致更严重的神经功能缺损13。因此，应测量并控制体温，例如使用动物体温控制器配合加...

脑卒中是全球第五大死因，每4分钟就有一人死于该疾病。每年有超过80万美国人发生脑卒中，这不仅对患者本人造成严重打击，也给其家庭带来巨大负担。脑卒中是成人致残的首要原因，尽管目前可用的治疗手段极为有限，但其年度支出估计高达365亿美元1。
组织型纤溶酶原激活剂（tPA）是目前唯一经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于缺血性脑卒中的药物。然而，该药物仅在卒中发作后3至6小时内给予患者才有效，且在此时间窗内仅有4%的患者获益2。因此，必须采用可重复且具有临床相关性的脑卒中动物模型，以促进该疾病潜在治疗策略和疗法的开发。需要强调的是，尽管体外（in vitro）模型在模拟脑功能障碍的某些方面具有一定价值，但无法重现卒中后脑内及外周复杂的生理相互作用。因此，体内（in vivo）模型至关重要。
最常见的卒中类型是缺血性卒中，占所有卒中病例的87%。其他类型的卒中包括脑内出血（9%）和蛛网膜下腔出血（4%），最常见原因是大脑中动脉（MCA）发生栓塞。这归因于MCA起始部明显的弯曲结构，导致进入脑部的层流血流受到干扰。大脑中动脉起源于颈内动脉（ICA），沿外侧裂走行，分支后投射至基底节以及额叶、顶叶和颞叶的外侧面，包括初级运动皮层和感觉皮层。威尔氏环（Circle of Willis）由大脑后动脉与大脑动脉及后交通动脉相连接而形成。
大脑中动脉阻塞（MCAo）的管腔内丝线或缝线模型是脑卒中研究中最广泛使用的方法之一。然而，该模型存在几种不同的变体，主要区别在于微丝是插入颈外动脉（ECA，称为Longa法）3，还是直接插入颈内动脉（ICA，称为Koizumi法）4。在Koizumi法中，当移除丝线时，为防止颈总动脉（CCA）切口处出血，手术侧的颈总动脉必须永久结扎；而在Longa法中，则需永久结扎颈外动脉5。本文将采用Longa法，因为我们认为该方法在缺血性脑卒中的手术建模中具有明显优势，且更贴近临床实际。此外，使用硅胶头单丝线（尤其结合Longa法）可实现高度可重复的MCAo，相比之下，火焰烧钝的单丝线常导致不完全阻塞和/或蛛网膜下腔出血6。
血管内线栓法可用于建立永久性或短暂性阻塞的模型4,6。为建立短暂性模型，可在缺血一段时间（例如，30 分钟、60 分钟或 2 小时）后撤出线栓，使血流再灌注得以发生。该模型在一定程度上模拟了人类在自发性或治疗性干预（例如，给予 tPA）后血流恢复的情况，以溶解血栓栓塞。对于永久性模型，则只需将线栓留置一段时间（例如，24 小时），不进行再灌注。血管内线栓法的另一优势在于无需进行开颅手术，可保持颅骨完整，避免颅内压和温度的改变。
在本视频中，我们演示如何采用Longa线栓法诱导大脑中动脉阻塞（MCAo）及再灌注。我们还展示了如何执行18分制神经功能缺损评分，并通过2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法测定脑梗死体积。

<table><tbody><tr><td>雄性 C57BL/6 小鼠</td><td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td><td>#000664</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>Morris &amp;amp; Dickson, Shreveport, LA</td><td>67457-108-10</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Akorn, Inc, Lake Forest, IL</td><td>NADA# 139-236</td><td></td></tr><tr><td>直流温度控制系统</td><td>FHC, Bowdoin, ME</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>微型直肠热敏电阻探头</td><td>FHC, Bowdoin, ME</td><td>40-80-5D-02</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>FHC, Bowdoin, ME</td><td>40-90-2-06</td><td></td></tr><tr><td>毛发剪</td><td>Amazon, Bellevue, WA</td><td>#64800</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Worldwide Medical Products, Bristol, PA</td><td>#51011023</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Olympus, Center Valley, PA</td><td>SZ40</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪（直头）</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 镊子（45&amp;deg; 弯头）</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA</td><td>11297-00</td><td></td></tr><tr><td>微血管夹</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA</td><td>18055-05</td><td></td></tr><tr><td>微型解剖弹簧剪（直头）</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>牵开器（钝头）</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA</td><td>18200-11 (Helen 使用 17022-13)</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>纱布海绵</td><td>Covidien, Mansfield, MA</td><td>#9023</td><td></td></tr><tr><td>7-0 编织丝线外科缝合线</td><td>Braintree Scientific, Braintree, MA</td><td>SUT-S103</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠</td><td>Morris &amp;amp; Dickson, Lake Forest, IL</td><td>0409-4888-20</td><td></td></tr><tr><td>6-0 中号 MCAO 缝合线（硅橡胶涂层单丝）</td><td>Doccol Corporation, Sharon, MA</td><td>6023PKRe</td><td></td></tr><tr><td>Sofsilk 6-0 硅胶涂层编织丝线</td><td>Covidien, Mansfield, MA</td><td>SUT-14-1</td><td></td></tr><tr><td>卡洛芬</td><td>Pfizer, New York, NY</td><td>NADA# 141-199</td><td></td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Dechra, Norwich, UK</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Physitemp 温度控制器</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td><td>TCAT-2AC</td><td></td></tr><tr><td>加热灯</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td><td>HL-1</td><td></td></tr><tr><td>激光多普勒探头</td><td>AD Instruments, Colorado Springs, CO</td><td>MSP100XP</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>#353226</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>单刃剃须刀片</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T8877-50G</td><td></td></tr><tr><td>小鼠脑组织切片模具</td><td>Braintree Scientific, Braintree, MA</td><td>BS-A 5000C</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>#182</td><td></td></tr><tr><td>10% 甲醛</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 分析软件</td><td>NIH, Bethesda, MD</td><td>免费下载</td><td></td></tr><tr><td>牵开器</td><td>Medical Device Purchase, Newcastle, CA</td><td>MP-740</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠大脑中动脉闭塞与再灌注诱导脑卒中的手术方法

Surgical Approach for Middle Cerebral Artery Occlusion and Reperfusion Induced Stroke in Mice

脑卒中是全球主要的致死原因之一，同时也是导致成人长期残疾的主要病因之一。约87%的脑卒中为缺血性卒中，且多发生在大脑中动脉（MCA）供血区域。目前，美国食品药品监督管理局（FDA）唯一批准用于治疗这种毁灭性疾病药物是组织型纤溶酶原激活剂（tPA）。然而，tPA的治疗时间窗较窄（3–6小时），且仅在实际接受该治疗的患者中有4%显示出疗效。当前的研究重点在于深入理解脑卒中的病理生理机制，以寻找潜在的治疗靶点。因此，可靠的动物模型至关重要，其中大脑中动脉闭塞（MCAo）模型（也称为血管内线栓或缝线模型）被认为是最具临床相关性的缺血性脑卒中外科模型，且具有相对无创、易于重复的优点。通常，MCAo模型应用于啮齿类动物，尤其是小鼠，因为该物种具有丰富的遗传变异资源。本文中，我们描述了（并在视频中展示了）如何在小鼠中成功实施MCAo模型（包含再灌注），以获得可靠且可重复的实验数据。

小鼠接受30分钟MCAo诱导的脑缺血（图1），随后进行再灌注（本文展示的是24小时和1周的再灌注时间，但再灌注时长可根据需要调整）。MCAo手术期间的死亡率极低（约2%）。缺血后（最初24小时内）的死亡率约为26%。
采用激光多普勒血流仪在大脑中动脉闭塞/再灌注前后确认大脑中动脉供血区域的血流灌注情况。图4 清楚显示，当短暂结扎的颈总动脉在缺血30分钟后松开，以取出线栓并实现再灌注时，灌注量出现急剧上升，在再灌注5分钟时达到基线灌注水平（i.e.，术前）的&lt; 100%。
卒中发病后24小时（在测量梗死体积之前），评估与一般状态、感觉、运动及本体感觉功能缺损相关的神经学评分（表1）。该评分系统旨在为评估提供客观...

为了理解脑卒中的病理生理学机制，使用可靠的模型至关重要。本文将介绍小鼠中最常用的脑卒中模型之一，即大脑中动脉闭塞（MCAo）模型（也称为血管内丝线或缝线模型），并包含再灌注过程。

中风是全球主要的致死原因之一，也是导致成人长期残疾的主要病因之一。约87%的中风属于...

Longa 方法的总体目标是复制大脑中动脉（MCA）根部的缺血，因为人类缺血性卒中最常见的是由 MCA 闭塞引起的。该方法有助于我们回答卒中领域的一些关键问题，例如如何为该疾病的治疗寻找合适的治疗靶点。与替代技术相比，Longa 方法的主要优势在于其较高的存活率。该技术还会导致白细胞-内皮细胞相互作用增加以及梗死体积增大。本实验操作将由本实验室负责人 Shantel Vital 进行演示。按照文本方案对一只雄性 C57 black six 小鼠实施麻醉后，通过足部夹捏法监测麻醉深度，并涂抹无菌眼膏以防止角膜干燥。然后，剃除动物颈部的毛发。将小鼠仰卧位放置在温度可控的垫子上，并插入直肠探针以监测并维持体温在36.5 ± 0.1摄氏度。随后，使用70%乙醇对皮肤进行消毒。接下来，使用虹膜直剪刀做正中切口，并牵开软组织以暴露血管。用杜蒙特镊子分离颈总动脉（CCA）和颈外动脉（ECA），注意不要损伤迷走神经。用7-0丝线在CCA周围打一个松结，作为临时缝合线。然后，紧扎颈外动脉（ECA）及其发出的小血管，进行永久性结扎。接着，在颈总动脉分叉近端处对颈外动脉进行结扎。随后，在颈内动脉（ICA）和翼腭动脉（PPA）周围放置微血管夹。使用显微弹簧剪在颈外动脉上靠近永久缝线处做一小切口，尽可能靠近永久缝线，并插入直径180微米的硅胶头单丝线。插入丝线后，收紧颈外动脉上的临时缝线，并移除微血管夹。使用显微弹簧剪在永久远端缝线与丝线进入点之间的位置剪断颈外动脉。将尼龙丝经颈内动脉（ICA）引导至大脑中动脉（MCA），直至感到阻力。更多细节请参见文本方案。缺血30分钟后，用Dumont镊子轻轻将尼龙丝抽出，并将结扎线固定于颈外动脉（ECA）开口端。通过小心松开颈总动脉（CCA）周围的临时缝线，恢复CCA的血流。移除牵开器，然后使用连续外科缝合关闭切口。皮下注射1毫升生理盐水以补充体液容量，并注射镇痛剂卡洛芬以缓解手术引起的疼痛和不适。在整个麻醉恢复期间，将小鼠置于加热至30摄氏度的专用笼子中进行观察，并在笼底放置培养皿，内盛研碎的饲料以促进进食。在适当的再灌注期后，采用18分制神经功能评分系统对小鼠进行神经学评估，包括一般状态、运动、感觉和本体感觉评分。神经功能评分越高，表示神经功能越差。为测量脑梗死体积，在诱导麻醉并根据文本方案监测麻醉深度后，将小鼠置于仰卧位，使用虹膜直剪从腹部向颈部剪开皮肤，随后剪开腹膜。使用杜蒙特镊子抬起胸骨并剪断肋骨。然后使用两把止血钳打开胸腔左右两侧，暴露心脏。将连接在5毫米注射器上的26号针头插入左心室，并剪开右心房。随后用室温的生理盐水或PBS灌注心脏，直至流出液变澄清。使用直头虹膜剪和镊子切除动物头部，并小心地从颅骨中取出脑组织。然后使用刀片切下嗅球和小脑，以便使脑组织能够放入切片模具中。将模具冷却后，把脑组织放入其中，并置于冰上。接着用刀片从脑组织顶部向下2毫米处进行第一次切割，并将刀片保持在原位。用第二把剃须刀片在第一处切口后方再切一个两毫米的切口。然后，取下附着组织的第一把剃须刀片。重复此过程，直至所有组织被切完。将每个脑段按照切割顺序放入一个含有2%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）的24孔板孔中，然后将24孔板置于37摄氏度的浅水浴中孵育20分钟。孵育10分钟后，翻转脑片。随后，在一个新的24孔板的各孔中加入少量10%福尔马林，再将脑段按切割顺序转移至含福尔马林的孔中。将脑片扫描至计算机后，使用 ImageJ 分析软件，通过勾画梗死区域以获得面积测量值，将梗死体积分析为占整个脑片的百分比。接着，测量对侧半球的总面积以确定参考面积。最后，将梗死面积除以对侧半球的面积，再乘以 100，以计算梗死体积。如图所示，采用激光多普勒血流仪检测大脑中动脉（MCA）供血区域在MCA再灌注前后血流灌注情况。当短暂结扎的颈总动脉（CCA）在缺血30分钟后松开，以移除线栓并实现再灌注时，血流灌注出现显著升高，在再灌注开始5分钟后达到接近基线水平100%的灌注量。下表列出了与一般状态、感觉、运动及本体感觉功能缺损评估相关的神经功能评分。该图显示，27只小鼠在术后24小时的神经功能评分为12.56 ± 0.7，一周后仍维持较高水平，为11.50 ± 1.5。神经功能评分越高，代表神经功能越差。脑梗死体积在24小时时的表现与神经功能评分相似。如图所示，在MCAo术后24小时，小鼠已出现较大梗死体积，且在卒中一周后梗死体积进一步增大。一旦掌握该技术，若操作得当，可在15分钟内完成。在进行此操作时，维持体温在36.5摄氏度至关重要。完成此操作后，还可进行其他方法，例如盲肠结扎穿刺术。这使我们能够回答更多问题，例如卒中前后脓毒症的影响。观看本视频后，您应充分了解如何通过将单丝线插入大脑中动脉并随后撤出以实现再灌注，从而诱导缺血。请注意，使用虹膜剪刀和镊子等器械操作可能存在危险，务必始终采取预防措施。

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对大脑中动脉闭塞再灌注损伤诱发中风小鼠的手术方法

大脑中动脉线栓法阻塞是研究小鼠缺血性脑卒中的常用模型。...

小鼠卒中模型——线栓法大脑中动脉阻塞

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采用大脑中动脉阻塞技术诱导小鼠缺血性卒中与缺血-再灌注及梗死区域的可视化

大脑中动脉内栓线阻塞是啮齿类动物实验性脑卒中最常用的体内模型。本文采用一种可实现颈总动脉修复的替代性外科手术方法，能够恢复颈总动脉的血流，并实现大脑中动脉供血区域的完全再灌注。...

小鼠经颈总动脉修复实现再灌注的中脑动脉闭塞模型

建立小鼠脑缺血-再灌注模型以研究中风的病理生理学机制。我们结扎右侧大脑中动脉远端和右侧颈总动脉，并在缺血10或40分钟后恢复血流。...

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小鼠大脑中动脉闭塞诱导卒中后脑肌吻合术治疗模型

本方案展示了一种具有中等大小梗死灶且存活率极佳的独特小鼠卒中模型。该模型可使临床前卒中研究者延长缺血时间、使用老龄小鼠，并评估长期功能学结果。...

一种改良的经颅大脑中动脉阻塞模型用于研究老年小鼠的中风结局

本方案描述了通过大脑中动脉腔内阻塞建立小鼠短暂性局灶性脑缺血模型的方法。此外，还展示了使用磁共振成像和行为学测试进行结果评估的示例。...

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采用远端中动脉阻塞技术诱导小鼠急性缺血性脑卒中

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一种改良的中动脉闭塞再灌注模型制备方法

学习Longa法建立小鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型，用于研究缺血性中风病理机制及治疗靶点。该方法可提高存活率并稳定诱导脑缺血损伤，适用于神经科学研究。

小鼠大脑中动脉闭塞与再灌注诱导脑卒中的手术方法

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