单细胞分辨率下透明化胚胎及出生后心脏的成像

本实验的总体目标是对完整心脏内部深处的荧光蛋白标记细胞进行体积成像，以在心脏发育过程及出生后心脏中以单细胞分辨率研究基因功能。该方法有助于回答心脏发育过程中的关键问题，例如基因功能的研究，以及在心脏发育过程中以单细胞分辨率进行成像，并帮助识别动物模型中的成像伪影。该方法的主要优势在于其相对简单、成本较低，且具有前瞻性，能够对完整胚胎或心脏中基因与蛋白质功能在单细胞水平上进行特殊的时间序列分析。

尽管我们使用该系统来研究小鼠的心脏发育，但您也可以将其用于研究其他器官系统，例如肌肉、大脑和肺，以及在其他模式生物中进行研究。此处使用经他莫昔芬处理的 R-26 Cre-RET2 confetti 雌鼠产生的表达荧光蛋白的阳性胚胎。开始染色时，将每个经多聚甲醛固定的胚胎浸入48孔板孔中的一毫升0.1% PBST溶液内。

在室温下将样品置于摇床上孵育两小时，以对组织进行通透处理。随后，用1 mL封闭缓冲液替换通透溶液，并在室温下继续振荡孵育两小时，或在4摄氏度下孵育过夜。接下来，针对每个孔，将内皮细胞特异性抗体PECAM用0.3毫升封闭缓冲液按1:100的比例稀释，并将稀释后的抗体溶液加入含有胚胎的孔中。

在4 °C条件下振荡孵育48小时。孵育结束后，用PBST洗涤胚胎5次，每次30分钟，以去除组织中过量的一抗。随后，将胚胎浸入Alexa Fluor 647标记的山羊抗兔二抗溶液中，于4 °C避光、振荡条件下孵育48小时。

48小时后，先用清洗液洗涤胚胎，随后在室温下轻轻摇动，用4% PFA固定胚胎1小时。然后，用PBS洗涤两次，每次5分钟，接着将胚胎与DAPI核染料孵育10分钟。之后再用PBS洗涤两次，每次5分钟，随后进行组织透明化处理。

组织透明化是本实验方案中最关键的步骤，以便对心脏进行单细胞分辨率的成像。此外，选择合适的透明化方法（如 scale 或 CUBIC）对于在完整胚胎心脏中保留荧光信号也极为重要。将洗涤后的染色胚胎转移至包裹铝箔的闪烁瓶中，瓶内含有 1 毫升的 scale A2 溶液。

在4摄氏度下孵育，期间偶尔手动轻轻振荡，持续48小时。A2梯度孵育结束后，将小瓶中的溶液更换为1毫升B4梯度溶液，在4摄氏度下继续孵育，期间同样偶尔轻轻振荡，再持续48小时。随后，将胚胎在4摄氏度下用1毫升70梯度溶液继续孵育48小时，期间仍需偶尔轻轻振荡。

最后，将经过透明化处理的样本浸入1毫升90%甘油中，并在4摄氏度下保存直至成像。成像时，将样本转移至含少量90%甘油的玻璃底培养皿中，使用配备双光子功能的共聚焦显微镜进行成像。对于CUBIC透明化处理，将每个胚胎浸入1毫升CUBIC溶液1中，在37摄氏度下轻轻振荡孵育48小时。

48小时后，将溶液更换为相同体积的新鲜CUBIC试剂一，按照之前的方法继续孵育样本额外48小时。孵育结束后，用PBS多次洗涤经CUBIC试剂一处理的胚胎，手动轻轻振荡以去除残留的CUBIC试剂一溶液。随后，将胚胎浸入CUBIC试剂二溶液中，在37摄氏度下孵育48小时，并间歇性手动轻轻振荡。

如果成像前存在延迟，需将样品依次在1 mL的30%、50%和70%甘油与PBS溶液中孵育，每步30分钟。完成梯度处理后，转移至90%甘油溶液中，并于4摄氏度保存。准备成像时，将样品置于含90%甘油的玻璃底培养皿中，按前述方法进行成像。

该视频展示了经 scale 处理的 E 8.75 天心脏从心表面到管腔的光学切片。黄色标记 PECAM 的表达，所有心肌细胞呈绿色。成像深度为 110.4 微米，共包含 93 个切片。

这是刚刚展示的重建心脏的三维表面图像。其中，黄色标记 PECAM 的表达，绿色标记所有心肌细胞。该视频显示了经药物处理的 E9.5 胚胎心脏流出道区域中单个前体细胞克隆的切片图像。

黄色标记 PECAM 表达，克隆呈绿色。深度为 36 微米，共 10 个切片。该视频展示了经 CUBIC 处理的 P2 心脏从表面到管腔的连续切面。

深度为130微米，每切片3微米。该视频展示了经CUBIC处理的E17.5心脏从表面到管腔的连续切片。深度为630微米，每切片6微米。

这是刚刚展示的心脏的三维表面图像，通过三维重建软件重建而成。在进行此操作时，重要的是要记住胚胎非常脆弱，心脏病理状态很容易受到干扰。在此操作之后，可利用染色方法检测其他蛋白质，以研究基因在胚胎植入后及后期的功能。