测量 体外 用于酶学表征的ATP酶活性

本实验的总体目标是对纯化的蛋白质进行体外ATP酶活性定量，以实现功能表征。该方法可用于鉴定新的假定ATP酶、评估有效的潜在激活剂或抑制剂，以及确定特定结构域或残基对ATP酶活性的贡献。该技术的主要优势在于其操作简便、灵敏度高，是一种测量体外ATP酶活性的简单而敏感的方法，且易于优化。

按照文本方案中的说明，准备所有与纯化蛋白孵育所需的试剂储备液。在开始ATP水解反应前，立即将100毫摩尔/升氯化镁与100毫摩尔/升ATP按1:1比例预混。准备并标记若干1.5毫升离心管，用于在反应过程中定期收集样品。

准备收集时间为零以及15、30、45和60分钟的样品管。向每根管中加入245 µL的1× HNG缓冲液，将从ATP水解反应中收集的样品按1:50的比例稀释。接下来，准备干冰和乙醇的混合浴，用于快速冷冻样品以终止反应。

在橡胶冰桶或其他安全容器中，加入几块干冰，并小心倒入足量的70%至100%乙醇，直至完全覆盖干冰。将纯化的蛋白质用1X HNG缓冲液稀释后，置于冰上保存。在预先准备好的0.5毫升离心管中，加入经预先计算体积的水，使最终反应体系体积达到30微升，以建立ATP水解反应体系。

随后加入6微升5X HNG或其他缓冲液，3微升100毫摩尔氯化镁与ATP的混合液，以及0.25至5微摩尔的蛋白质。设置一个仅含缓冲液的阴性对照组，不添加蛋白质。接下来，在反应时间为零时，从反应体系中取出5微升样品。

然后将等分试样在预先准备的1.5毫升离心管中按1:50比例稀释，管中含245微升HNG缓冲液。立即用干冰乙醇浴冷冻样品。在37摄氏度孵育反应体系，使ATP水解反应进行1小时。

每个时间点从反应体系中取出 5 µL 等分试样，加入预先标记并含有 HNG 缓冲液的样品管中，操作同前。ATP 水解反应结束后，将稀释后的样品转移至 -80 °C 超低温冰箱中保存。为确保所有样品完全冻结，需至少等待 10 分钟后再进行后续操作。

将含有各个时间点ATP水解反应等分试样的稀释样品在室温下解冻。接着，准备一个96孔板，其中包含样品和磷酸盐标准品。在0.5毫升离心管中，通过将5.5微升磷酸盐标准品加入104.5微升HNG缓冲液，将磷酸盐标准品从800微摩尔稀释至40微摩尔。

充分混匀后，取100微升该40微摩尔磷酸盐标准品加入96孔板的A1孔中。向B1至H1孔各加入50微升HNG缓冲液，用于磷酸盐标准品的1:1系列稀释。从A1孔中移取50微升40微摩尔磷酸盐溶液，加入含有50微升检测缓冲液的B1孔中，并混匀。

然后从B1孔中移除50微升，加入C1孔，依次进行稀释至G1孔。混匀后从G1孔中弃去50微升，以确保每孔体积相同。H1孔中仅加入缓冲液，用于制备40至0微摩尔的磷酸盐标准品。接下来，将每个样品各取50微升，重复加入两孔。

将同一时间点的样品按列垂直添加，不同时间点的样品按行水平添加。这样每块板最多可处理八个样品和五个时间点。使用无菌移液器吸取足量的孔雀石绿-钼酸盐-磷酸盐检测试剂，向每个含有样品和标准品的孔中加入 100 µL。

将检测试剂加入培养皿中，以便使用多通道移液器进行加样。切勿将检测试剂直接倒入培养皿中，以免发生磷酸盐污染。使用多通道移液器，向每个孔中加入 100 µL 磷酸盐检测试剂，并通过上下吹打相同次数的方式小心混匀，避免产生气泡，操作顺序应从最后一个时间点开始，依次向前至第一个时间点。

将酶标板置于室温下 25 分钟，或根据制造商的说明进行操作。为定量分析结果，使用吸光度酶标仪在 650 纳米波长下读取样品的吸光度。图中展示了动力学和终点法 ATP 酶实验的代表性结果，其中检测了Ⅱ型分泌 ATP 酶/EPSE 的野生型与突变型在有或无刺激剂心磷脂存在条件下的活性。

此处展示的是心磷脂刺激的EPSE激酶动力学实验结果，显示了野生型EPSE和双赖氨酸突变体随时间推移的无机磷酸盐线性释放情况，以牛血清白蛋白作为阴性对照。这些数据可通过将每分钟释放的磷酸盐量除以蛋白浓度进行归一化处理，从而定量并比较各蛋白的ATP酶活性。结果表明，两个赖氨酸残基K417和K419参与了EPSE心磷脂刺激型ATP酶活性的调控。

比较相同蛋白质在无心磷脂刺激条件下的ATP酶活性表明，这两个赖氨酸残基并不影响EPSE的低基础活性，而是与蛋白质被心磷脂激活的能力相关。观看本视频后，您应能够充分理解如何快速而准确地定量纯化蛋白质的ATP酶活性。在进行该实验操作时，需特别注意磷酸根检测试剂的灵敏度。

为避免磷酸盐污染，我们建议使用一次性塑料器皿和超纯水，并在蛋白质纯化后进行尺寸排阻层析或离子交换层析。