Name: 测量体外的酶学性质ATP酶活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学习体外定量测定纯化蛋白ATP酶活性的方法，用于功能表征和评估潜在激活剂或抑制剂。该技术简单灵敏，可轻松优化以适应不同实验需求。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢美国国立卫生研究院资助项目RO1AI049294（资助对象：M. S.）提供的经费支持。

1. 使用纯化蛋白进行ATP水解反应
<ol>
	<li>准备孵育纯化蛋白所需的所有试剂储备液。
	<ol>
		<li>配制5倍浓度的HEPES/NaCl/甘油（HNG）缓冲液，包含100 mM HEPES（pH 8.5）、65 mM NaCl和5%甘油（或根据实验需要选择其他缓冲液）。</li>
		<li>将100 mM MgCl2（或其他金属离子，若ATP酶依赖金属离子）溶于水中。</li>
		<li>使用高纯度ATP，将其溶于200 mM Tris碱液中，新鲜配制100 mM ATP溶液（不再调节pH）。分装后于-20 °C保存，保存时间不超过数周，因ATP会随时间降解，避免反复冻融ATP储备液。</li>
		<li>在开始ATP水解反应前，立即将MgCl2与ATP按1:1比例预混。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备并标记若干1.5 ml离心管，用于在反应过程中定期取样。准备在0、15、30、45和60分钟时间点收集样品的离心管。 
	注意：也可仅在0分钟和反应终点取样。
	<ol>
		<li>向每管中加入245 µl 1倍浓度HNG缓冲液，以便将ATP水解反应中采集的样品稀释50倍。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备干冰与乙醇混合浴，用于快速冷冻样品以终止反应。在橡胶冰桶或其他安全（非塑料）容器中加入数块干冰，并小心倒入足量70–100%乙醇，直至完全覆盖干冰。</li>
	<li>根据需要（通常为5–10 µM），用1倍浓度HNG缓冲液稀释纯化蛋白，并置于冰上保存。</li>
	<li>设置ATP水解反应体系。
	<ol>
		<li>在每个样品对应的0.5 ml离心管中，依次加入以下试剂：H2O（补至终体积30 µl）、6 µl 5倍浓度HNG缓冲液（或其他缓冲液）、3 µl 100 mM MgCl2-ATP混合液，以及0.25–5 µM蛋白。</li>
		<li>设置仅含缓冲液的阴性对照组，不添加蛋白。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在反应开始时（0分钟）取出5 µl反应液，加入预先准备的含245 µl HNG缓冲液的1.5 ml离心管中，使样品稀释50倍，立即放入干冰/乙醇浴中速冻。</li>
	<li>将反应体系在37 °C孵育1小时，以进行ATP水解。在每个时间点（15、30、45和60分钟），从反应体系中取出5 µl等分试样，加入已标记并含有HNG缓冲液的样品管中（同步骤1.6）。</li>
	<li>ATP水解反应结束后，将稀释后的样品转移至-80 °C超低温冰箱中保存。为确保所有样品完全冻结，至少等待10分钟后继续后续操作。</li>
</ol>
2. 将含有游离 Pi 的样品与检测试剂孵育
<ol>
	<li>在室温下解冻含有各时间点ATP水解反应等分试样的稀释样品（来自步骤1.6和1.7）。</li>
	<li>设置一个96孔板，其中包含样品和磷酸盐标准品。
	<ol>
		<li>在0.5 ml离心管中，通过将5.5 µl的800 µM磷酸盐标准品（随Pi检测试剂提供）加入104.5 µl HNG缓冲液中，将其稀释至40 µM。充分混匀后，取100 µl该40 µM Pi标准品加入96孔板的A1孔中。</li>
		<li>向B1至H1孔各加入50 µl HNG缓冲液，用于Pi标准品的1:1系列稀释。</li>
		<li>从A1孔中移取50 µl 40 µM Pi加入B1孔的50 µl检测缓冲液中，混匀；再从B1孔移取50 µl至C1孔，继续依次稀释至G1孔。混匀后从G1孔弃去50 µl，以确保每孔体积一致。H1孔仅含缓冲液，从而建立从40 µM到0 µM的Pi标准曲线。 
		注意：如果样品中添加了其他因素（如抑制剂），应制备含有该因素的标准曲线，以校正在此条件下磷酸盐释放或吸光度的变化。</li>
		<li>将每个样品取50 µl重复加样至孔板中。同一时间点的样品按列垂直排列（例如：样品1，时间0 = A2、A3；样品2，时间0 = B2、B3），不同时间点则按行水平排列。此布局每块板最多可容纳8个样品和5个时间点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用无菌移液器吸取足量的孔雀绿/钼酸盐Pi检测试剂，按每孔100 µl加入含样品和标准品的各孔（所需试剂体积（ml）= 0.1 × 样品与标准品总数），并将试剂加入一个培养皿中，以便使用多通道移液器操作。切勿直接将检测试剂倾倒至培养皿中，以防发生Pi污染。</li>
	<li>使用多通道移液器向每孔加入100 µl Pi检测试剂，并通过上下吹打相同次数的方式小心混匀，避免产生气泡，建议按照从最后时间点到最初时间点的顺序进行操作。</li>
	<li>将板在室温下孵育25分钟，或根据试剂生产商的说明进行操作。</li>
</ol>
3. 使用微孔板读数仪定量结果
<ol>
	<li>使用吸光度酶标仪在 650 nm 处测定各样品的吸光度。</li>
	<li>绘制磷酸盐（Pi）标准曲线。利用绘图软件，将 Pi 标准样品的吸光度值对其浓度作图，以获得用于计算各样品中磷酸盐含量的方程。</li>
	<li>通过磷酸盐标准品校准，计算每个样品的 ATP 酶活性。释放的磷酸盐量 = (OD650 - Y 轴截距) / 斜率。
	<ol>
		<li>取每个样品两个重复测定的总 Pi 值的平均值，从中减去仅含缓冲液对照组的吸光度值，再乘以稀释倍数（本例中为 50）。</li>
		<li>计算每微摩尔蛋白释放的 Pi 纳摩尔数（nmol Pi/µmol 蛋白）。在动力学测定中，将各时间点的这些数值作图应得到线性拟合，相关系数至少达到 R = 0.99（图 1）；若未达到，可调整蛋白用量或孵育时间长短以优化实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结果可表示为 nmol Pi/µmol 蛋白/分钟（图 2、图 3），或根据需要表示为 nmol Pi/µg 蛋白/分钟。</li>
</ol>

<ol><li>Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA%2B+proteins%3A+have+engine%2C+will+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">AAA+ proteins: have engine, will work.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).</li>
<li>Baker, T. A., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClpXP%2C+an+ATP-powered+unfolding+and+protein-degradation+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).</li>
<li>Maxson, M. E., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vacuolar-type+H%2B-ATPase+at+a+glance+-+more+than+a+proton+pump%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump.</a> J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).</li>
<li>Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+of+genes+for+secretion+NTPases%3A+Identification+of+the+widespread+tadA+subfamily+and+development+of+a+diagnostic+key+for+gene+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).</li>
<li>Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+the+Extracellular+Protein+Secretion+NTPase+EpsE+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae.</a> J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).</li>
<li>Camberg, J. L., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+Vibrio+cholerae+type+II+secretion+ATPase+EpsE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE.</a> J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).</li>
<li>Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+secretion+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Type II secretion and pathogenesis.</a> Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct%2C+Real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).</li>
<li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green%3A+An+improvement+and+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation.</a> J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li>
<li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microassay+for+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A microassay for ATPase.</a> Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).</li>
<li>Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+kinetic+analysis+of+the+intracellular+domain+of+human+protein+tyrosine+phosphatase+%CE%B2+%28HPTP+%CE%B2%29+using+synthetic+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides.</a> Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).</li>
<li>Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+stimulation+of+EpsE+ATP+hydrolysis+by+EpsL+and+acidic+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids.</a> EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).</li>
<li>McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+the+weak+ATPase+activity+of+human+Hsp90+by+a+client+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein.</a> J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).</li>
<li>Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XpsE+oligomerization+triggered+by+ATP+binding%2C+not+hydrolysis%2C+leads+to+its+association+with+XpsL%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL.</a> EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).</li>
<li>Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaeal+flagellar+ATPase+motor+shows+ATP-dependent+hexameric+assembly+and+activity+stimulation+by+specific+lipid+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding.</a> Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).</li>
<li>Savvides, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VirB11+ATPases+are+dynamic+hexameric+assemblies%3A+new+insights+into+bacterial+type+IV+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion.</a> EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).</li>
<li>Sanghera, J., Li, R., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+luminescent+ADP-Glo+assay+to+a+standard+radiometric+assay+for+measurement+of+protein+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Techn%22%5BJournal%5D)">Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity.</a> Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).</li>
<li>Sherman, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+catalytic+activity+from+biological+function+of+the+ATPase+that+powers+lipopolysaccharide+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cofactor+regulation+with+disease-associated+p97%2FVCP+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).</li>
<li>Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

这是一种用于测量的通用方案 体外 纯化蛋白的ATP酶活性测定用于生化表征。该方法易于优化，例如通过调整蛋白用量、缓冲液和盐的组成、反应温度，以及改变检测时长和时间间隔（包括增加总间隔数），可提高活性定量的准确性。市面上可购得的基于孔雀绿的试剂具有高灵敏度，可检测微量游离磷酸盐（在100 µl体系中约50 pmol）。由于该检测方法灵敏度高，必须使用一次性塑料器皿、超纯水以及不含磷酸盐污染的缓冲液和试剂。蛋白纯化后，建议采用尺寸排阻或离子交换色谱进一步提高蛋白纯度并去除污染物。
对于表现出弱信号的蛋白质 体外 ATP酶活性，可向反应体系中添加刺激物以增强酶活性。许多能够刺激ATP酶活性的因素已被明确。例如心磷脂及其他膜脂类、分子伴侣（如Hsp90）的客户蛋白，以及其他参与维持ATP酶发挥功能所需特定构象或环境的蛋白质13-15我们实验室首次通过纯化单体对 EpsE 进行了表征，其 ATP 酶活性较同源 ATP 酶较弱6. 我们随后发现，当EpsE与T2S系统中的跨膜蛋白EpsL的胞质结构域共纯化时，向反应...

ATP酶是生命所有界别中多种生理过程的关键酶类。ATP酶作为分子马达，利用ATP水解产生的能量驱动多种反应，包括蛋白质的转运、去折叠和组装；复制与转录；细胞代谢；肌肉收缩；细胞运动以及离子泵送1-3。部分ATP酶为跨膜蛋白，参与溶质跨膜运输；另一些则位于细胞质中，可能与质膜或细胞器膜等生物膜相关联。
AAA+ ATP酶（与多种细胞活动相关的ATP酶）是一大类具有部分序列和结构保守性的ATP酶。这些蛋白质含有保守的核苷酸结合基序，如Walker-A和Walker-B盒，并在其活性状态下形成寡聚体（通常为六聚体）。1AAA+ 蛋白家族中不同成员在结合核苷酸后会发生显著的构象变化。EpsE 是一种 AAA+ ATP 酶，属于细菌 II/IV 型分泌系统的 NTP 酶亚家族4-6EpsE 为 II 型分泌（T2S）提供动力 霍乱弧菌，霍乱的致病因子。T2S系统负责分泌多种蛋白质，例如毒力因子霍乱毒素，该毒素可引发严重的水样腹泻 V. cholerae 定植于人体小肠7. 
定量技术 体外 ATP酶活性的测定方法多样，但通常使用比色法、荧光法或放射性标记底物来检测磷酸盐的释放8-11. 我们描述了一种用于确定的基本方法 体外 使用基于市售含孔雀绿钼酸盐底物的比色法检测纯化蛋白的ATP酶活性，该方法通过测定释放的无机磷酸盐（Pi）含量来反映酶活性。在低pH条件下，孔雀绿钼酸盐与Pi形成复合物，其生成量可在650 nm处测定。该方法操作简便且灵敏度高，可用于新ATP酶的功能表征，评估潜在激活剂或抑制剂的作用，确定功能结构域或特定氨基酸残基的重要性，或分析特定处理对酶活性的影响。

<table><tbody><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>三磷酸腺苷（ATP）</td><td>Fisher</td><td>BP41325</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板（透明，平底）</td><td>VWR</td><td>82050-760</td><td></td></tr><tr><td>BIOMOL Green</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-AK111</td><td>推荐的磷酸盐检测试剂。注意：有刺激性。</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td></td><td></td><td>BioTek Synergy 或同类设备</td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

测量 体外 用于酶学表征的atp酶活性

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

三磷酸腺苷水解酶（ATPases）在多种细胞功能中发挥关键作用。这些动态蛋白能够为机械功提供能量，例如蛋白质转运与降解、溶质运输以及细胞运动。本文所述方案是一种用于测定ATP酶活性的基本检测方法。 体外 用于功能表征的纯化ATP酶活性检测。蛋白质在反应中水解ATP并释放无机磷酸盐，随后通过比色法测定所释放磷酸盐的量。该实验方案具有高度可调性，可调整用于动力学或终点法测定ATP酶活性。本文提供了一个代表性实验方案，基于EpsE的活性与需求，EpsE是参与细菌II型分泌系统的AAA+ ATP酶 霍乱弧菌纯化蛋白的用量、测定活性所需的反应时间、取样间隔的时间点及次数、缓冲液和盐的组成、温度、辅因子、刺激物（如有） 等等。 可能与本文所述情况存在差异，因此可能需要进行一些优化。本方案为ATP酶的表征提供了基本框架，可快速实施，并可根据需要轻松调整。

的 体外 T2S ATP酶EpsE的活性可通过与EpsL的胞质结构域（EpsE-cytoEpsL）共纯化并添加酸性磷脂心磷脂而得到增强12还可以通过该检测方法比较野生型（WT）与蛋白质变体形式的活性，来确定特定EpsE残基在ATP水解中的作用。此处通过比较纯化的野生型EpsE-cytoEpsL与EpsE K417AK419A-cytoEpsL变体的ATP酶活性，测定EpsE锌结合结构域中两个赖氨酸残基替换所产生的影响。在 图1在1小时的动力学测定过程中，磷酸盐的释放呈线性进行，这是准确量化动力学ATP酶活性的必要条件。 图2 显示来自相同纯化蛋白质样品的数据，如 图1 经重复三次双样本测定，并以磷酸盐释放的平均速率进行定量。这些数据表明，K417 和 K419 对 EpsE ATPase 活性似乎具有重要作用。然而，未刺激条件下（无心磷脂）ATPase 活性速率的比较（图3) 表明 K417 和 K...

我们描述了一种用于定量的基本实验方案 体外 ATP酶活性。本方案可根据特定纯化ATP酶的活性水平和实验需求进行优化。

测量 体外 用于酶学表征的ATP酶活性

三磷酸腺苷水解酶（ATPases）在多种细胞功能中发挥着关键作用。这些动态蛋白质能够生成……

本实验的总体目标是对纯化的蛋白质进行体外ATP酶活性定量，以实现功能表征。该方法可用于鉴定新的假定ATP酶、评估有效的潜在激活剂或抑制剂，并确定特定结构域或残基对ATP酶活性的贡献。该技术的主要优势在于其操作简便、灵敏度高，是一种用于测定体外ATP酶活性的简单而敏感的方法，且易于优化。按照文本方案中的说明，准备所有与纯化蛋白孵育所需的试剂储备液。在开始ATP水解反应前，将100毫摩尔氯化镁与100毫摩尔ATP按1:1比例预先混合。准备并标记若干1.5毫升离心管，用于在反应过程中定期收集样品。准备收集时间为零以及15、30、45和60分钟的样品管。向每根管中加入245 µL的1× HNG缓冲液，将来自ATP水解反应的样品按1:50的比例稀释。接下来，准备干冰和乙醇混合浴，用于快速冷冻样品以终止反应。在橡胶冰桶或其他安全容器中，加入数块干冰，并小心倒入足量 70% 至 100% 乙醇，直至完全覆盖干冰。将纯化的蛋白质用 1X HNG 缓冲液稀释后，置于冰上保存。在预先准备好的 0.5 毫升离心管中，加入经预先计算的水量，使最终反应体积达到 30 微升，以建立 ATP 水解反应体系。随后加入6 µL 5X HNG或其他缓冲液，3 µL 100 mM氯化镁ATP混合液，以及0.25至5 µmol的蛋白质。设置一个不加蛋白质的缓冲液对照组（阴性对照）并进行孵育。接下来，在反应时间为零时，取出5 µL反应液。然后将等分试样在预先准备的1.5毫升离心管中稀释50倍，管中含245微升HNG缓冲液。立即用干冰乙醇浴冷冻样品。在37摄氏度孵育反应体系，使ATP水解反应进行一小时。在每个时间点，从反应体系中取出5微升等分试样，加入预先标记并含有HNG缓冲液的样品管中，操作同前。ATP水解反应结束后，将稀释后的样品转移至-80摄氏度冰箱中保存。为确保所有样品完全冻结，需至少等待10分钟后方可进行后续操作。将含有各个时间点ATP水解反应等分试样的稀释样品在室温下解冻。接着，准备一个96孔板，其中包含样品和磷酸盐标准品。在0.5毫升离心管中，通过将5.5微升磷酸盐标准品加入104.5微升HNG缓冲液，将磷酸盐标准品从800微摩尔稀释至40微摩尔。充分混匀后，取100微升该40微摩尔磷酸盐标准品加入96孔板的A1孔中。向B1至H1孔各加入50微升HNG缓冲液，用于磷酸盐标准品的1:1系列稀释。从A1孔中移取50微升40微摩尔磷酸盐溶液，加入B1孔的50微升检测缓冲液中，并充分混匀。然后从B1孔中移除50微升液体并加入C1孔，依次进行稀释至G1孔。混匀后从G1孔中弃去50微升，以确保每孔体积相同。H1孔应仅含有缓冲液，用于制备40至0微摩尔的磷酸盐标准曲线。接下来，将每个样品各50微升重复加入两孔。将同一时间点的样品按列垂直添加，不同时间点的样品按行水平添加。这样每块板最多可处理八个样品和五个时间点。使用无菌移液器吸取足量的孔雀石绿-钼酸盐磷酸盐检测试剂，向每个含有样品和标准品的孔中加入 100 µL。将检测试剂加入培养皿中，以便使用多通道移液器进行加样。切勿将检测试剂直接倒入培养皿中，以免发生磷酸盐污染。使用多通道移液器，向每个孔中加入 100 µL 磷酸盐检测试剂，并通过上下吹打相同次数的方式小心混匀，避免产生气泡，操作顺序应从最后一个时间点开始，依次向前至第一个时间点。将酶标板置于室温下孵育25分钟，或根据制造商说明书操作。为定量检测结果，使用吸光度酶标仪在650纳米波长下测定各样品的吸光度。图中展示了动力学和终点法ATP酶实验的代表性结果，其中检测了野生型与突变型II型分泌ATP酶/EPSE在有或无刺激剂心磷脂存在条件下的活性。此处展示的是心磷脂刺激的ATP酶动力学实验结果，显示了野生型EPSE和双赖氨酸突变体随时间推移的线性磷酸盐释放情况，以牛血清白蛋白作为阴性对照。这些数据可通过将每分钟释放的磷酸盐量除以蛋白浓度进行表示，以定量并比较每种蛋白的ATP酶活性。结果表明，两个赖氨酸残基K417和K419参与了EPSE心磷脂刺激的ATP酶活性。比较相同蛋白质在无心磷脂刺激条件下的ATP酶活性表明，这两个赖氨酸残基并不影响EPSE的低基础活性，而是与蛋白质被心磷脂激活的能力相关。观看本视频后，您应能够充分掌握如何快速、准确地定量纯化蛋白质的ATP酶活性。在进行该实验操作时，需特别注意磷酸根检测试剂的灵敏度。为避免磷酸盐污染，我们建议使用一次性塑料器皿和超纯水，并在蛋白质纯化后进行尺寸排阻层析或离子交换层析。

measuring-in-vitro-atpase-activity-for-enzymatic-characterization

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

测量<em&gt;体外</em&gt;的酶学性质ATP酶活性

本文描述了一种测定乙酸激酶活性的方法。该检测方法利用直接反应来测定乙酸激酶在生成乙酸方向上的酶活性及动力学，适用于不同的磷酸基受体。此外，该方法还可用于检测其他利用乙酰磷酸或乙酰辅酶A的酶。...

直接检测酶乙酸激酶的乙酸生成活性

本文描述了蛋白激酶C（PKC）同工酶激活对与呼吸和氧化磷酸化相关的线粒体功能以及细胞活力的影响。该方法采用腺病毒技术在原代细胞培养中选择性地过表达PKC同工酶，并结合多种检测手段以评估线粒体功能和细胞的能量状态。...

过表达蛋白激酶C同工酶的肾细胞中线粒体功能与细胞活力的评估

本视频演示了一种基于薄层色谱的酶活性测定方法，通过使用放射性标记的核苷酸来检测焦磷酸激酶活性。该方法可深入了解核苷酸合成及磷酸转移反应。...

基于薄层色谱的酶活性检测法：利用薄层色谱测定体外焦磷酸激酶活性的技术

体外测定α-半乳糖苷酶A和酸性α-葡萄糖苷酶活性

我们描述了一种通过在Xenopus卵母细胞中异源表达K+逆向转运P型ATP酶，并利用原子吸收分光光度法测定单个细胞对Rb+或Li+的摄取，从而定量该酶活性的方法。该方法是一种灵敏且安全的替代方案，可用于替代放射性同位素通量实验，有助于开展复杂的动力学研究。...

测量 Na,K-ATPase 和 H,K-ATPase 介导的阳离子转运 非洲爪蟾 通过原子吸收分光光度法检测卵母细胞：放射性同位素测定的替代方法

本文描述了可用于表征ATP依赖性染色质重塑酶的生化检测方法，这些方法可评估其以下能力：1）催化ATP依赖性的核小体滑动；2）与核小体底物结合；以及3）以核小体或DNA依赖的方式水解ATP。...

用于分析ATP依赖型染色质重塑酶活性的生化检测方法

本报告描述了一种 体外 使用酶法测定磷脂酰乙醇胺甲基转移酶活性 利什曼原虫 细胞提取物。该实验基于放射性甲基从 S-[甲基-3H]腺苷-L-甲硫氨酸转移至内源性磷脂酰乙醇胺。...

体外测定磷脂酰乙醇胺甲基转移酶活性的实验方法

蛋白激酶是一类高度进化的信号传导酶和支架蛋白，在细胞间和细胞内信号转导中起关键作用。本文介绍一种利用放射性标记的三磷酸腺苷（[γ-32P]...

使用放射性标记的ATP检测蛋白激酶活性

目前需要使一类新型“孤儿药”——药理学伴侣药物的临床前检测具有可重复性、快速且高效。我们开发了一种简单、高度标准化且用途广泛的基于细胞培养的检测方法，可用于筛选合适的患者以及新的药理学伴侣药物。...

体外酶活性检测用于评估法布里病和庞贝病对药物伴侣治疗的反应性

本文介绍了一种纯化组氨酸标签焦磷酸激酶酶的方法，并利用放射性标记底物及产物的薄层色谱分析来检测其酶活性。...

一种纯化与 体外 一种(p)ppGpp合成酶的活性检测 艰难梭菌

已将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）偶联的ATP酶检测法改进用于小分子肌球蛋白抑制剂的半高通量筛选。该动力学检测采用384孔微孔板格式进行，每孔总反应体积仅为20...

一种用于筛选小分子抑制剂的NADH偶联ATP酶检测半高通量改良方法

学习体外定量测定纯化蛋白ATP酶活性的方法，用于功能表征和评估潜在激活剂或抑制剂。该技术简单灵敏，可轻松优化以适应不同实验需求。

测量体外用于酶学表征的ATP酶活性

探索更多视频

测量 体外 用于酶学表征的ATP酶活性

探索更多视频

测量体外用于酶学表征的ATP酶活性