测量体外的酶学性质ATP酶活性

我们描述了一种定量体外 ATP 酶活性的基本方案。该方案可以根据给定纯化 ATP 酶的活性水平和要求进行优化。

该程序的总体目标是定量纯化蛋白质的体外 ATP 酶活性以进行功能表征。该方法可用于表征新的推定 ATP 酶，评估有效的潜在激活剂或抑制剂，并确定特定结构域或残基对 ATP 酶活性的贡献。该技术的主要优点是它是一种简单、灵敏的体外 ATP 酶活性测量方法，并且可以轻松优化。

按照文本方案中的说明准备与纯化蛋白孵育所需的所有试剂储备液。在设置 ATP 水解反应之前，以 1：1 的比例预混合 100 毫摩尔氯化镁和 100 毫摩尔 ATP。准备并标记 1.5 mL 试管，以便在整个反应过程中定期收集样品。

准备试管，以便在零次以及 15、30、45 和 60 分钟收集样品。向每个试管中加入 245 微升 1x HNG 缓冲液，以稀释度为 1 至 50 稀释从 ATP 水解反应中收集的样品。接下来，准备一个干冰和乙醇浴，以便快速冷冻样品以终止反应。

在橡胶冰桶或其他安全容器中，加入几块干冰，并小心地倒入足够的 70% 至 100% 乙醇以覆盖干冰。在 1X HNG 缓冲液中稀释纯化的蛋白质，并将其置于冰上。通过添加预先计算的水，在制备的 0.5 毫升试管中设置 ATP 水解反应，以达到 30 微升的最终反应体积。

然后加入 6 μL 5X HNG 或其他缓冲液、3 μL 100 毫摩尔氯化镁 ATP 混合物和 0.25 至 5 μmol 蛋白。孵育仅缓冲液阴性对照条件，其中不添加蛋白质。接下来，从反应中去除 5 μL 的 0 倍。

然后在准备好的含有 245 微升 HNG 缓冲液的 1.5 毫升试管中将等分试样稀释 1 至 50。立即将样品在干冰乙醇浴中冷冻。在 37 摄氏度下孵育反应，让 ATP 水解发生 1 小时。

在每个间隔，从反应中取出 5 微升等分试样，并像以前一样加入含有 HNG 缓冲液的标记样品管中。在 ATP 水解反应结束时，将稀释的样品移至 80 摄氏度的冰箱中进行储存。为确保所有样品均已完全冷冻，请至少等待 10 分钟后再继续。

在室温下解冻来自每个时间点的含有 ATP 水解反应等分试样的稀释样品。接下来，准备一个包含样品和磷酸盐标准品的 96 孔板。在 0.5 mL 试管中，通过将 5.5 μL 标准品添加到 104.5 μL HNG 缓冲液中，将磷酸盐标准品从 800 μmol 稀释到 40 μmol 之间。

充分混合，并将 100 微升这种 40 微摩尔磷酸盐标准品添加到 96 孔板的 A1 孔中。向 B1 至 H1 孔中加入 50 μL HNG 缓冲液，对磷酸盐标准品进行一对一的连续稀释。从 A1 孔中取出 50 微升 40 微摩尔磷酸盐，将其添加到 B1 孔中的 50 微升测定缓冲液中并混合。

然后从 B1 孔中取出 50 μL 并加入 C1 孔中，继续稀释至 G1 孔。混合后从 G1 孔中丢弃 50 微升，以确保每个孔具有相同的体积。H1 孔应仅包含缓冲液，以产生从 40 微摩尔到 0 微摩尔的磷酸盐标准品。接下来，将每个样品一式两份加入 50 微升到板中。

垂直添加来自同一时间点的样本，垂直添加来自不同时间点的样本。这允许每个板最多 8 个样品和 5 个时间点。使用无菌移液器除去足够的孔雀石绿磷酸酯检测试剂，向包含样品和标准品的每个孔中加入 100 μL。

将检测试剂添加到培养皿中，以便使用多通道移液器轻松移液。请勿将检测试剂直接倒入培养皿中，否则可能会发生磷酸盐污染。使用多通道移液器，向每个孔中加入 100 微升磷酸盐检测试剂，并通过上下吹打一致次数小心混合，不引入气泡，从最后一个时间点到第一个时间点按顺序工作。

将板在室温下放置 25 分钟或按照制造商的说明放置。为了定量结果，使用吸光度微孔板读数器读取样品在 650 纳米处的吸光度。显示了动力学和终点 ATP 酶的代表性结果，其中在存在和不存在兴奋剂心磷脂的情况下测定 2 型分泌 ATP 酶/EPSE 的野生型和突变形式的活性。

这里显示的是动力学心磷脂刺激的 ATP 酶的结果，证明了野生型 EPSE 和双赖氨酸突变体随时间线性磷酸盐释放，牛血清白蛋白作为阴性对照。这些数据可以表示为每分钟释放的磷酸盐量除以蛋白质浓度，以便定量和比较每种蛋白质的 ATP 酶活性。数据表明，两个赖氨酸残基 K417 和 K419 有助于心磷脂刺激的 EPSE ATP 酶活性。

在没有心磷脂刺激的情况下，相同蛋白质的 ATP 酶活性的比较表明，这两个赖氨酸残基不会导致 EPSE 的低基础活性，而是导致蛋白质受心磷脂刺激的能力。观看此视频后，您应该对如何快速准确地定量纯化蛋白的 ATP 酶活性有很好的了解。在尝试此过程时，重要的是要考虑磷酸盐检测试剂的灵敏度。

为避免磷酸盐污染，我们建议使用一次性塑料器皿和超纯水，并在蛋白质纯化后进行体积排阻或离子交换色谱。