微孔中聚集体尺寸优化用于人多能干细胞的悬浮法心肌分化
2016年9月25日
传统方法在启动基于悬浮聚集体的人多能干细胞（hPSCs）心肌分化时，常因聚集体的大小和形状不均一而导致培养结果存在异质性。本文介绍一种利用微孔阵列生成尺寸可控的hPSC聚集体，并在促进心肌分化的条件下进行培养的可靠心肌分化方法。
首先，将单细胞人多能干细胞（hPSC）悬液在200 × g条件下离心5分钟。离心后，吸除洗涤培养基，并将细胞重悬于聚集培养基中，密度为1.2 × 10⁶ 个细胞/毫升。接着，将1毫升细胞悬液接种至预先准备好的微孔板的每个孔中，并均匀分布细胞。
为接种大量孔板，需定期涡旋细胞悬液以防止细胞沉降。接种后，将板在200 × g下离心5分钟。离心结束后，在显微镜下观察板，确认细胞已沉降至每个微孔的底部。
然后，将培养板置于含5%二氧化碳、5%氧气的低氧培养箱中，在37摄氏度下孵育24小时。聚集体形成后一天，在显微镜下观察聚集体。与离心后立即观察到的聚集体相比，此时的聚集体应保持完整，边缘光滑。
将微孔板水平放置，用P-1000微量移液器的吸头接触培养基液面并紧靠孔壁，小心吸除上清液，注意不要扰动微孔底部的细胞聚集体。当培养基液面降低至距离微孔板纹理表面约1至2毫米时，缓慢倾斜微孔板，再缓慢吸除孔内剩余的培养基。
用移液枪吸取1毫升新鲜配制并预热的一阶段诱导培养基，将枪头抵住孔板内壁边缘，沿孔内壁极其缓慢地加入培养基。将孔板放回培养箱中，在低氧条件下继续培养三天。第四天时，使用5毫升血清移液管收集微孔板中每个孔内的细胞聚集体。
在15毫升锥形管中收集最多10孔的细胞聚集体悬液。将细胞聚集体置于低氧培养箱中静置沉降15分钟。待细胞聚集体沉降后，小心吸除上清液，并将细胞聚集体重悬于10毫升预热的洗涤培养基中，以去除残留的诱导性细胞因子。
将聚集体在50 × g条件下离心2分钟。离心后，吸除上清液，并将沉淀的聚集体重悬于预热的第二阶段诱导培养基中。将聚集体悬液转移至24孔超低吸附培养板中，每孔1毫升。
在显微镜下观察聚集体，应为均匀致密的细胞簇。在低氧条件下培养至第6天。第6天时，将最多10毫升的聚集体按之前方法收集至15毫升锥形管中。
待聚集体沉降后，吸除上清液，并将聚集体重悬于预热的第三阶段诱导培养基中。使用5毫升血清学移液管，将聚集体重新分配至24孔超低吸附培养板中，每孔1毫升。在培养第10天进行完全换液。
在第12天，将细胞转移至常氧培养条件（20%氧气和5%二氧化碳）下继续培养至培养期结束。经过12天的分化（相当于在心脏诱导第三阶段培养基中培养6天），可观察到细胞聚集体范围内强烈的收缩现象。在第17天，通过流式细胞术检测显示，74.8%的细胞心肌肌钙蛋白T呈阳性，如直方图中填充部分所示。
图中还显示了仅用二抗染色的细胞，对应于直方图中的空心部分。在进行该操作时，重要的是在第4天充分洗涤细胞聚集体，以去除痕量的细胞因子，特别是激活素A（activin-A），该因子会促进内胚层分化，从而抑制心脏诱导。在此操作之后，还可采用其他方法，例如在聚集体内对具有诱导作用的细胞类型进行低温培养，以探究其他科学问题，例如邻近胚胎组织的旁分泌信号如何影响人多能干细胞向心脏谱系的分化。
概述
本文介绍了一种利用微孔生成尺寸可控聚集体以实现人多能干细胞（hPSCs）心脏分化的稳健方法。该方法解决了传统技术中与培养异质性相关的问题。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 心脏分化
- 组织工程
背景
- 人类多能干细胞（hPSCs）可分化为多种细胞类型，包括心肌细胞。
- 传统方法常产生大小和形状不一的细胞聚集体，影响分化效果。
- 微孔技术为生成均一的细胞聚集体提供了解决方案。
- 促进心肌分化的培养条件对于实现高效分化至关重要。
研究目的
- 建立一种生成尺寸可控的人多能干细胞（hPSC）聚集体的方法。
- 提高心脏分化结果的一致性。
- 促进心脏组织工程领域的进一步研究。
使用的方法
- 离心 hPSC 悬液以形成细胞聚集体。
- 使用微孔板控制聚集体大小。
- 在低氧条件下孵育以促进心肌分化。
- 依次更换培养基以诱导不同分化阶段。
主要结果
- 在整个分化过程中形成了均匀的细胞聚集体并保持稳定。
- 在分化后的细胞中观察到心肌肌钙蛋白T的显著表达。
- 通过更有效地去除诱导性细胞因子，增强了向心肌细胞系的定向分化。
- 分化12天后观察到细胞聚集体范围内的收缩现象。
结论
- 微孔法为hPSCs的心脏分化提供了可靠的方案。
- 尺寸可控的细胞聚集体可实现更一致的分化结果。
- 该技术可用于进一步研究心脏发育及疾病建模。
常见问题
行业应用价值
在基于悬浮培养的心肌细胞分化过程中控制细胞聚集体的大小，可解决由人多能干细胞（hPSC）衍生心肌细胞生产中的一个关键瓶颈问题：培养异质性导致产量不稳定。通过采用微孔阵列技术实现均一的细胞聚集体形成，该方法可提高对分化结果的预测可靠性，支持可扩展且可重复的临床前模型构建。这使得该技术成为在早期发现和转化研究流程中降低心肌谱系定向风险的重要策略工具。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够探究心脏诱导过程中依赖于细胞聚集体大小的信号通路，阐明谱系特化的机制性驱动因素。
- 操作价值：减少聚集体形成的变异性，提高不同实验及不同研究团队间的可重复性。
- 预测价值：通过将聚集体几何形态标准化为可控变量，支持形态发生素暴露的剂量-反应建模。
筛选与检测方法开发
- 检测适用性：可生成均一的微组织，适用于高内涵成像和基于流式细胞术的心肌细胞定量分析。
- 可扩展性：微孔板格式支持对多种条件或不同遗传背景进行并行处理，适用于比较筛选。
- 定量输出：能够稳定地检测心肌肌钙蛋白T阳性细胞比例，作为化合物处理或基因扰动研究中的功能性读出指标。
转化与临床前研究
- 疾病相关系统：可规模化生成均一的心脏类器官，用于模拟遗传性心肌病或药物诱导的心脏毒性。
- 转化连续性：通过提供批次间一致的细胞材料，连接发现阶段的分化与临床前验证。
- 机制性风险降低：减少类器官大小异质性带来的混杂因素，提高表型与基因型关联的可靠性。
流程与工作流整合
该方法通过实现标准化的人多能干细胞（hPSC）分化，契合从发现到临床前研究的连续过程，并可进一步应用于疾病建模、安全性药理学以及再生医学候选药物的评价等下游应用。
- 发现生物学：通过精确控制聚集体的大小和形状，支持在心肌谱系定向过程中对生物物理信号的假设验证。
- 筛选：提供可重复的微组织阵列，用于化合物文库筛选，显著降低因聚集差异带来的背景噪声。
- 分析检测：由于细胞群体的均一性提高，可实现更优信噪比的定量流式细胞术和成像检测（例如，心肌肌钙蛋白T）。
- 转化研究：提供可扩展的心肌细胞来源，用于临床前功能检测，包括收缩力和电生理学分析。
- 企业级复用：微孔板可在不同项目和细胞系间重复使用，支持干细胞分化工作流程的平台级标准化。
运营与企业影响
- 科学价值：通过减少类器官大小差异带来的生物学噪声，提高对分化结果的预测可信度。
- 操作价值：通过标准化、可扩增的类器官形成，提升实验的可重复性和通量。
- 战略价值：通过降低因分化效率低下导致的假阴性结果，增强早期心脏项目“推进/终止”决策的信心。
- 项目组合影响：基于可靠的心肌细胞产量指标，实现基于风险调整的资源分配。
实施注意事项
- 需要具备人多能干细胞（hPSC）培养、细胞聚集体操作以及低氧培养系统方面的专业知识。
- 依赖于具有确定孔径尺寸和低吸附表面的微孔板的可及性。
- 需要标准化的换液流程，以避免在洗涤步骤中破坏细胞聚集体。
- 需在不同hPSC细胞系中进行验证，以确保聚集体大小与分化效率之间的关系具有一致性。
- 受限于对专用设备（低氧培养箱、低吸附培养板）的需求，以及优化的细胞因子洗涤步骤，以防止非靶向分化。
