Name: 在微孔聚集尺寸优化人类多能干细胞的基于悬浮心脏分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 学习利用微孔板技术控制人类多能干细胞聚集体尺寸，实现高效心脏分化。该方法通过离心形成均匀聚集体，在低氧条件下诱导心肌细胞特异性标志物表达，为心脏组织工程和疾病建模提供可靠技术平台。

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我们感谢 Peter Zandstra 博士，本方案即在其实验室中开发完成；同时感谢 Mark Gagliardi 博士和 Gordon Keller 博士，他们在建立本流程所依据的初始方法过程中提供了帮助。本方案的开发得到了授予 C.B. 的安大略省科技研究生奖学金以及安大略省心脏与中风基金会向 Peter Zandstra 提供的资助支持。

1. 培养基组分的制备
<ol>
	<li>配制洗涤培养基。每 100 ml DMEM/F12 中加入 1 ml 100 倍浓度的青霉素/链霉素（Pen/Strep）、1 ml 100 倍浓度的 L-谷氨酰胺和 5 ml 血清替代物。</li>
	<li>根据制造商说明书配制化学成分明确的基底心肌诱导培养基。</li>
	<li>为本实验方案中将使用的培养基配制以下储备试剂。
	<ol>
		<li>L-抗坏血酸：在锥形管中，用 4 °C 的无菌超纯蒸馏水配制浓度为 5 mg/ml 的储备液。
		<ol>
			<li>将该溶液置于冰上，并定期涡旋振荡管子，直至溶质完全溶解。使用 0.22 μm 注射器滤器对L-抗坏血酸溶液进行过滤除菌。</li>
			<li>将抗坏血酸溶液分装为每份 1 ml 的等分试样，于 -20 °C 保存。每次配制培养基时使用新鲜解冻的等分试样。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在配制培养基当天，将 13 μl 单硫代甘油（MTG）稀释于 1 ml 基底心肌诱导培养基中。未使用完的稀释后 MTG 应丢弃。</li>
		<li>将转铁蛋白（30 mg/ml）分装为每份 1 ml 的等分试样，于 -20 °C 保存。已解冻的等分试样可在 4 °C 保存最多 3 个月。</li>
		<li>配制含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的 4 mM 盐酸（HCl）。在通风橱中，将 30 μl 6.0 N HCl 溶液加入 50 ml 超纯蒸馏水中。使用 0.22 μm 注射器滤器对该溶液进行过滤除菌。向 50 ml HCl 溶液中加入 2 ml 25% BSA 溶液。</li>
		<li>配制含 0.1% BSA 的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。每毫升 PBS 中加入 20 μl 25% BSA 溶液。</li>
		<li>配制人骨形态发生蛋白 4（BMP-4）储备液（10 ng/µl）。将 10 µg 冻干 BMP-4 溶解于 1 ml 含 0.1% BSA 的 4 mM HCl 缓冲液中。分装为每份 50 µl 的等分试样，于 -20 °C 保存。</li>
		<li>配制人成纤维细胞生长因子 2（bFGF）储备液（10 ng/µl）。将 10 µg 冻干 bFGF 溶解于 1 ml 含 0.1% BSA 的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。分装为每份 50 µl 的等分试样，于 -20 °C 保存。</li>
		<li>配制人血管内皮生长因子（VEGF）储备液（5 ng/µl）。将 5 µg 冻干 VEGF 溶解于 1 ml 含 0.1% BSA 的 PBS 中。分装为每份 50 µl 的等分试样，于 -20 °C 保存。</li>
		<li>配制 Activin A 储备液（10 ng/µl）。将 10 µg 冻干 Activin A 溶解于 1 ml 含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 中。分装为每份 50 µl 的等分试样，于 -20 °C 保存。</li>
		<li>配制 Wnt 生成抑制剂-2（IWP-2）储备液（10 mM）。将 2 mg IWP-2 溶解于 429 µl 二甲基亚砜（DMSO）中。分装为每份 10 µl 的等分试样，于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制完全心肌诱导培养基。向 100 ml 基底心肌诱导培养基中加入 1 ml 100 倍浓度的 Pen/Strep、1 ml 100 倍浓度的 L-谷氨酰胺、500 µl 转铁蛋白、1 ml 新鲜解冻的抗坏血酸和 300 µl MTG。未使用完的培养基应丢弃。</li>
</ol>
2. 微孔板的制备
注意：所有步骤均应在生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>向将要使用的每个孔中加入 0.5 ml 洗涤液（试剂盒组分）。为确保溶液接触每个微孔内的全部表面，以 840 × g 离心 2 分钟。</li>
	<li>在室温下孵育 30 至 60 分钟。</li>
	<li>吸去各孔中的洗涤液。按以下步骤洗涤每个孔 两次：向每个孔中加入 1 ml PBS，以 840 × g 离心 2 分钟，然后吸去 PBS。</li>
</ol>
3. 微孔板中人多能干细胞聚集体的形成
注意：所有步骤均应在生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>将洗涤培养基置于 37 °C 水浴中。 
	注意：所需体积 = 1 ml × 待消化 hPSC 的孔数。</li>
	<li>将 hPSC 消化为单细胞 
	注意：以下步骤描述的是在 6 孔板上培养的细胞的消化过程——试剂体积可根据不同的培养规格按比例调整。
	<ol>
		<li>吸除每孔 hPSC 培养物中的培养基。每孔用 1 ml 消化酶冲洗一次，随后立即吸除各孔中的消化酶。 
		注意：残留的消化酶应足以完成细胞消化。</li>
		<li>将培养板在 37 °C 下孵育 3 分钟。</li>
		<li>向每孔加入 1 ml 洗涤培养基，使用 P1000 移液器在组织培养表面反复吹打洗涤培养基，以机械方式将细胞从培养表面解离。若消化不完全，仍有细胞团块存在，此时应将细胞悬液通过滤网过滤。</li>
		<li>将细胞悬液转移至 15 ml 锥形管中，并在下一步进行细胞计数期间将管子置于培养箱中保存。</li>
		<li>进行细胞计数：
		<ol>
			<li>取上一步收集的细胞悬液 10 µl，加入 30 µl 台盼蓝染液，用移液器充分混匀。</li>
			<li>取 10 µl 经台盼蓝染色的细胞悬液加入血细胞计数板的每个计数室中，在倒置显微镜下使用 10X 物镜观察并计数细胞。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据细胞计数结果，计算可在微孔板中以每孔 1.2 × 106 个细胞的密度接种的孔数。按每孔 1 ml 计算所需的聚集培养基体积。</li>
		<li>配制聚集培养基。每 10 ml 完全心脏诱导培养基中加入 0.5 µl BMP4 储存液（终浓度 = 0.5 ng/ml）和 Y-27632 ROCK 抑制剂（终浓度 = 10 µM）。</li>
		<li>从培养箱中取出含有 hPSC 的锥形管，以 200 × g 离心 5 分钟。吸除洗涤培养基，将细胞重悬于聚集培养基中，细胞密度为每毫升 1.2 × 106 个细胞。</li>
		<li>吸除微孔板每孔中的 PBS 洗涤液。使用 P1000 移液器将 1 ml 细胞悬液均匀分配并接种至微孔板的每一孔中。若需接种大量孔，应定期涡旋混匀细胞悬液以防止细胞沉降。</li>
		<li>将微孔板以 200 × g 离心 5 分钟。在显微镜下观察，确认细胞已沉降至各微孔底部。</li>
		<li>将微孔板置于 37 °C、5% CO2、5% O2（低氧）培养箱中孵育 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 心脏诱导阶段1
<ol>
	<li>聚集后一天（第1天），准备所需体积的第1阶段诱导培养基（对于24孔板，体积 = 1 ml × 孔数）。每1 ml完全心脏诱导培养基中，加入1 µl BMP4储备液（终浓度 = 10 ng/ml）、0.5 µl bFGF储备液（终浓度 = 5 ng/ml）和0.6 µl Activin A（终浓度 = 6 ng/ml）。将培养基置于37 °C水浴中至少15分钟。</li>
	<li>从培养箱中取出微孔板，在显微镜下观察聚集体。与离心后立即形成的聚集体相比，此时的聚集体应保持完整，边缘光滑（比前一天更圆润，方形特征减少）。</li>
	<li>在不扰动微孔内聚集体的前提下，移除上清液：
	<ol>
		<li>将微孔板保持水平（i.e.，不要倾斜）。对微孔板上的每一孔，将P1000移液器吸头置于培养基表面，并紧贴孔壁边缘。</li>
		<li>缓慢吸出培养基，注意不要扰动微孔底部的聚集体。当培养基液面降至距离微孔表面约1至2 mm时，缓慢倾斜微孔板，使液体聚集于孔的一侧（当液体体积足够少时，流动显著减少，可更易避免聚集体被带出微孔）。随后缓慢吸出孔内剩余的培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>添加新鲜的第1阶段诱导培养基时，为确保聚集体保留在各自的微孔中：使用P1000移液器吸取1 ml第1阶段诱导培养基。将吸头紧贴孔内壁，极其缓慢地将培养基沿孔内壁释放。对剩余各孔重复此操作。</li>
	<li>将微孔板放回培养箱，在低氧条件下继续培养3天。</li>
</ol>
5. 心脏诱导阶段 2
<ol>
	<li>第4天，将洗涤液（体积 = 孔数 × 2 ml）置于37 °C水浴中，至少15分钟。</li>
	<li>配制所需体积的第二阶段诱导培养基（体积 = 孔数 × 1 ml）：每毫升完全心脏诱导培养基中加入 2 µl VEGF 储存液（终浓度 = 10 ng/ml）和 0.5 µl IWP-2 储存液（终浓度 = 5 µM）。将配制好的第二阶段诱导培养基置于 37 °C 水浴中至少 15 分钟。</li>
	<li>使用5 ml血清移液管，从微孔板的每个孔中收集聚集体，并将聚集体悬液收集至15 ml锥形管中（每支15 ml管最多收集10个孔）。</li>
	<li>在低氧培养箱中静置聚集物15分钟。 
	注意：此步骤对于将单细胞和细胞碎片与完整的细胞聚集体分离开至关重要。</li>
	<li>小心吸去上清液，并将聚集体重悬于 10 ml 预热的洗涤培养基中，以去除残留的诱导性细胞因子（例如，即使在极低浓度下，Activin A 也是一种强效的信号分子。</li>
	<li>以 50 × g 离心 2 分钟。吸除上清液。将沉淀的聚集体重悬于预热的诱导 2 培养基中。</li>
	<li>将聚集物悬液转移至超低吸附（ULA）24孔板中，每孔1 ml。在显微镜下观察，聚集物应为均匀、致密的细胞团簇。孵育于 缺氧的 条件直至第6天。</li>
</ol>
6. 心脏诱导阶段 3
<ol>
	<li>第6天，准备所需体积的第3阶段诱导培养基（体积 = 孔数 × 1 ml）。每1 ml完全心脏诱导培养基中加入2 µl VEGF储备液（终浓度 = 10 ng/ml）和0.5 µl bFGF储备液（终浓度 = 5 ng/ml）。将配制好的第3阶段诱导培养基置于37 °C水浴中预热至少15分钟。</li>
	<li>使用5 ml血清移液管将细胞聚集体转移至15 ml锥形管中，每管最多汇集10 ml细胞聚集体。</li>
	<li>静置10分钟使细胞聚集体沉降。吸除上清液，并将细胞聚集体重悬于预热的第3阶段诱导培养基中。使用5 ml血清移液管将细胞聚集体重新分配至24孔超低吸附（ULA）板中，每孔1 ml。</li>
	<li>第10天，按照步骤6.1的方法配制所需体积的第3阶段诱导培养基（体积 = 孔数 × 1 ml）。</li>
	<li>使用5 ml血清移液管将细胞聚集体转移至15 ml锥形管中，每管最多汇集10 ml细胞聚集体。</li>
	<li>静置10分钟使细胞聚集体沉降。吸除上清液，并将细胞聚集体重悬于第3阶段诱导培养基中。使用5 ml血清移液管将细胞聚集体重新分配至24孔ULA板中，每孔1 ml。</li>
	<li>在低氧条件下培养两天。第12天起，将细胞转移至常氧氧浓度条件下继续培养至培养结束（37 °C，20% O2，5% CO2）。 
	注意：此后细胞不再在低氧条件下培养。</li>
	<li>从第14天开始，每隔4天重复一次完全换液（步骤6.2和6.3），直至细胞收获（通常在分化第14天后可观察到心肌细胞浓度达到峰值）。</li>
</ol>
7. 微孔培养产物中心肌肌钙蛋白T（cTnT）表达频率的流式细胞术分析
<ol>
	<li>按以下步骤解离细胞团块：
	<ol>
		<li>使用 5 ml 血清移液管将 1 孔细胞团块转移至 15 ml 圆锥形离心管中。以 50 × g 离心 2 分钟，小心吸除上清液。</li>
		<li>向细胞团块中加入 1 ml 新鲜配制的 1 mg/ml II 型胶原酶溶液。将细胞团块悬液转移至 1.5 ml 微量离心管中。在室温下孵育过夜。</li>
		<li>次日，使用 P1000 移液器轻轻吹打，将细胞团块解离为均一的单细胞悬液。若细胞团块不易解离，可先静置沉降，吸除上清液，再加入 700 μl 解离酶，在室温下孵育 1 至 2 分钟。随后用 P1000 移液器轻柔吹打 1 至 2 次以促进解离。</li>
		<li>稀释解离酶：加入含 14 μl 1 mg/ml DNA 酶储备液的 700 μl 洗涤液。取 10 μl 样品进行细胞计数，并将剩余悬液在台式微量离心机中以 300 × g 离心 2 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行细胞计数：将 10 μl 计数样品与等体积台盼蓝染色液混合，使用血细胞计数板进行计数。</li>
	<li>从微量离心机中取出含有剩余细胞的 1.5 ml 微量离心管。吸除上清液，将细胞重悬于含 2% 胎牛血清的 Hank's 平衡盐溶液（HF）中，浓度为每 100 μl 含 200,000 至 500,000 个细胞。</li>
	<li>针对每种实验条件，将 100 μl 细胞悬液分别加入 96 孔板的两个孔中（一孔用于 cTnT 抗体染色，另一孔作为二抗对照）。</li>
	<li>以 300 × g 离心 2 分钟。使用多通道移液器移除上清液。</li>
	<li>固定细胞：每孔加入 200 μl 固定液（试剂盒组分），在室温下孵育 15 分钟。</li>
	<li>以 300 × g 离心 2 分钟。使用多通道移液器小心从各孔中吸除上清液。将上清液弃入含多聚甲醛的废液容器中。</li>
	<li>洗涤固定后的细胞两次：每孔加入 200 μl HF。以 300 × g 离心 2 分钟。吸除上清液后重复洗涤一次。固定后的细胞可在 4 °C 的 HF 中保存最多一周。</li>
	<li>透化细胞：
	<ol>
		<li>以 300 × g 离心 2 分钟。</li>
		<li>每孔加入 100 μl 透化液（试剂盒组分），在室温下孵育 5 分钟。</li>
		<li>以 300 × g 离心 2 分钟，吸除上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 HF 中配制抗 cTnT 抗体主混合液，浓度根据当前批次号优化确定（最佳稀释倍数需通过滴定确定，通常为 1:500 至 1:2,000）。</li>
	<li>针对每种实验条件（每种条件两个孔），向其中一孔加入 100 μl 主混合液（染色样本），向另一孔加入 100 μl 纯 HF（二抗对照）。在 4 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>以 300 × g 离心 2 分钟。吸除上清液，每孔加入 200 μl HF。重复洗涤一次。</li>
	<li>配制二抗主混合液。根据待处理的孔数（包括二抗对照孔和抗 cTnT 染色孔），准备相应体积的 HF，每孔对应 100 μl HF。每 200 μl HF 中加入 1 μl 山羊抗小鼠 APC 标记二抗（1:200 稀释）。</li>
	<li>染色样本：每孔加入 100 μl 染色液（包括二抗对照孔和抗 cTnT 染色孔）。避光、在 4 °C 下孵育 30 分钟（加入荧光二抗后应将板覆盖或置于暗处，以防荧光淬灭）。</li>
	<li>以 300 × g 离心 2 分钟。吸除上清液，每孔加入 200 μl HF。重复洗涤一次。</li>
	<li>将样本转移至 5 ml 圆底流式细胞仪分析管中，按照仪器标准操作流程，对 APC 通道信号进行流式细胞术检测19。</li>
</ol>

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M.U. 对相关微孔技术拥有经济利益。

已观察到，多能干细胞向心肌细胞的高效分化是一个高度可变的过程。尽管不同细胞系在向特定细胞类型分化的能力上存在差异并不令人意外，但使用同一细胞系进行的重复实验之间，心肌分化效率仍表现出显著波动。6该方案通过直接控制每个聚集体的输入细胞数量，解决了上述变异性的一个主要来源。为进一步减少实验间的差异，建议使用适用于单细胞传代的hPSC细胞系，因为这种hPSC扩增和维持方式在多能性标志物的表达频率方面可获得更为均一的多能性细胞群体。例如，Oct4，Nanog，Tra-1-60， 等等.).
本方案中所述的聚集体大小为1,000个细胞，适用于HES-2胚胎干细胞系的心脏诱导分化，效果最佳。若将本方案应用于其他细胞系，必须首先进行初始聚集体大小的筛选，以确定该细胞系的最佳聚集体大小。尽管这并不直接影响本方案中所述的操作步骤，我们仍提醒读者，聚集体大小和总体细胞密度的变化可能影响氧气输送，这在后续应用中可能成为需要考虑的因素。此外，在将人多能干细胞（hPSCs）解离为单细胞的过程中，细胞凋亡是一个值得关注的问题。因此，在微孔中强制细胞聚集时，必须确保存在ROCK抑制剂。最后，在分化第4天，必须充分洗涤聚集体，以在重悬于诱导2培养基之前彻底去除诱导1培养基中残留的Activin A。在分化第4天之后，Activin A会促进内胚层分化，从而抑制中胚层的诱导20。
该技术的主要应用是筛选能够促进高效心脏分化的细胞聚集体大小。然而，当前技术的一个局限性在于，使用微孔板难以将心脏细胞的生产规模扩大到具有临床意义的水平。心脏分化的放大通常在搅拌式悬浮生物反应器中的大体积培养条件下进行21。因此，在利用微孔系统确定适用于高效心脏诱导的细胞聚集体尺寸范围后，下一步的放大策略是确定生物反应器搅拌桨转速，以生成所需大小的细胞聚集体。
该技术与其他基于聚集体的心肌分化方法的一个显著区别在于，它能够直接研究内源性信号在聚集体中的调控作用，以及在聚集体中将诱导性/抑制性组织类型与人多能干细胞（hPSCs）进行共培养13。这类研究可为大规模心肌细胞生产的过程开发提供重要信息。

体外 细胞培养可在多种模式下进行，但通常采用二维贴壁培养条件或三维悬浮培养条件，后者能更充分地模拟 体内 系统。因此，许多研究领域正日益倾向于开发用于生成三维组织构建物的稳健方法。在细胞类型和生物学过程需要支持性细胞外基质（ECM）表面及黏附信号的情况下，可通过支架式构建物实现三维培养，即细胞在外部添加的支持性基质上或内部进行培养1不需要黏附于支撑基质的细胞和过程，可作为主要或完全由细胞组成的无支架悬浮系统进行培养（这些细胞随后可自行产生内源性基质）2,3在此，我们介绍一种在大小可控、均一且无支架的聚集体中实现人类多能干细胞（hPSCs——具有分化为体内任何细胞类型能力的干细胞，无论来源于胚胎或其他来源）向心肌细胞分化的实验方案。
将人多能干细胞（hPSCs）以悬浮聚集体形式进行分化时，常受到聚集体尺寸在单次实验内及不同实验批次间存在较大差异的困扰。这种变异性源于通常用于生成这些聚集体的方法，即通过机械解离细胞克隆来实现。为了减少这种变异性，已有多种方法被用于控制每个聚集体中的细胞数量以及聚集体的直径和均一性。例如，在微量离心管中形成聚集体4，或采用悬滴法5；通过微图案化技术构建定义明确的二维hPSC克隆6，随后转移至悬浮培养；或通过离心将细胞沉降至U型或V型底多孔板中7,8,9。然而，所有这些方法均受限于聚集体生成通量较低的问题。基于微孔的系统采用与V型底板类似的方法，但由于微孔尺寸更小（在本方案中每个微孔宽度为400 µm），可在单个培养板孔（标准直径约15.5 mm，包含约1,200个微孔）中生成比整块V型底板更多的均一聚集体10。基于微孔的聚集体形成已被应用于多种研究场景，包括将hPSCs向外胚层11、内胚层12、中胚层13和胚外组织14分化；间充质干细胞的软骨形成15；为毒理学筛选提供均一的实验基质16；以及力学生物学相关研究17。
开发用于生产人多能干细胞来源心肌细胞的稳健制造方案面临的主要挑战之一，是不同批次间心脏分化效率缺乏可重复性。我们先前已证明，这种变异性可归因于起始人多能干细胞（hPSC）群体的异质性，该群体包含自我更新的hPSC以及表达与内胚层和神经分化相关基因的正在分化细胞6,18。这些分化中的细胞所分泌的信号分子会影响心脏诱导过程。具体而言，胚外内胚层促进心脏诱导，而神经前体细胞则抑制心脏诱导。当hPSC聚集成团时，团块内部的细胞会进一步分化并发生组织重构，使未分化的hPSC被一层在聚集体表面发育形成的胚外内胚层细胞所包围13。通过控制聚集体的大小，我们可以调节具有心脏诱导能力的内胚层细胞与未分化hPSC之间的比例（即表面积与体积之比），并优化该比例以实现最大程度的心脏诱导13。

<table><tbody><tr><td>生物安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器辅助器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清移液管（5 至 25 ml）&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>吸液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>吸液器或巴斯德吸管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 和 50 ml 离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>通风橱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，5% O₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;sub&gt;,&lt;/sub&gt; 湿度控制的细胞培养箱&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>低氧（低氧）培养箱</td></tr><tr><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，20% O₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;sub&gt;,&lt;/sub&gt; 并置于温湿度控制的细胞培养孵育箱中&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>配有带板架的摆动桶式转子的低速离心机&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2、P20、P200 和 P1000 微量移液器及配套吸头&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备4X、10X和20X相差物镜的倒置显微镜&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超低吸附（ULA）24孔板&amp;nbsp;</td><td>康宁/科斯特</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式微量离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>无菌超纯蒸馏水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>涡旋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &amp;deg;C 冷冻室</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>巯基甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td>有毒；强烈建议将MTG分装，以尽量减少因反复开启导致的氧化。分装后可于4℃避光保存 &amp;deg;-20℃下可保存长达3个月 &amp;deg;建议将 C 用于长期保存。</td></tr><tr><td>StemPro-34 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10639-011</td><td>基础心肌诱导培养基；该添加剂储存于 -20 &amp;deg;C 和基础培养基在 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>转铁蛋白</td><td>罗氏</td><td>10652202001</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R&amp;amp;D Technologies</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;amp;D Technologies</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R&amp;amp;D Technologies</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R&amp;amp;D Technologies</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>试剂直接</td><td>57-G89</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15561</td><td></td></tr><tr><td>盐酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>腐蚀性</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12660</td><td></td></tr><tr><td>100倍青霉素/链霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>100x L-谷氨酰胺</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Knockout血清替代物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12563</td><td>解离酶</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400 培养板</td><td>StemCell Technologies</td><td>27845</td><td>微孔板</td></tr><tr><td>Aggrewell 清洗液</td><td>StemCell Technologies</td><td>7010</td><td>微孔板冲洗液</td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK抑制剂</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>II型胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12483</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板（用于 FACS 染色）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intraprep 透化试剂</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM2389</td><td>试剂盒包含两部分：固定液和通透液；有毒</td></tr><tr><td>cTnT 抗体</td><td>内源性标记物&amp;nbsp;</td><td>MS-295</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG APC抗体ThermoFisher</td><td>分子探针</td><td>A865</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 圆底流式细胞术管</td><td>FACS 仪器型号依赖</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

微孔中聚集体尺寸优化用于人多能干细胞的悬浮法心肌分化

Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells

人类多能干细胞（hPSCs）的心脏分化通常在悬浮细胞聚集体中进行。传统的hPSC聚集体形成方法是将细胞克隆解离成较小的细胞团，通过反复吹打细胞悬液来粗略控制细胞团的大小，直至达到理想的尺寸。传统基于聚集体的心脏分化主要挑战之一在于，培养体系的异质性和空间排列的无序性导致心肌细胞产量不稳定且效率低下。我们及其他研究团队此前已报道，可通过调节人胚胎干细胞（hESC）聚集体的大小来优化心脏诱导效率。为应对这一挑战，我们采用了一种可放大的、基于微孔阵列的方法，以精确控制聚集体形成的物理参数，特别是聚集体的大小和形状。本文所述方法包括在微孔中强制限定数量的hPSC形成聚集体，随后在特定条件下培养这些聚集体以引导其向心脏方向分化。该方案可根据所用微孔的尺寸和数量灵活放大。采用此方法，我们能够稳定获得心肌细胞比例超过70%的培养产物。

仅通过调节细胞浓度和微孔表面积，即可利用微孔系统有效形成尺寸可控的hPSC聚集体。经过短暂离心后，适量细胞（本方案中为1,000个）将在每个微孔中聚集（图1A）。重要的是，这些细胞在24小时内会重新建立细胞间连接，此时细胞聚集体不应再充满整个孔底，而是呈现为边缘光滑、结构致密的球形聚集体（图1B）。这些聚集体可作为进一步向心肌方向分化的起始材料。若细胞未能形成紧密的团簇，可能提示在解离和再聚集过程中发生了细胞死亡，此时应检查该细胞系进行单细胞传代时ROCK抑制剂的使用浓度是否合适。在微孔中培养的随后三天内，聚集体形态变化不大，但可观察到一定程度的生长。当从微孔中转移出来时，聚集体应保持圆形、紧密堆积的形态，并且彼此间大小相近（图1C）。在超低吸附24孔板中继续培养，将支持细胞进一步扩增和生长。
在暴露于Activin信号和Wnt抑制后的第8天，细胞聚集体将开始表现为更大且更明亮的聚集体（图1D）。在此期间，每个孔底部会出现大量细胞碎片，必须在更换培养基前让聚集体沉降以去除碎片。偶尔会观察到许多聚集体融合在一起，这种情况不会抑制孔中其他聚集体的分化，但这些“超级聚集体”通常不会表现出较小聚集体所具有的形态学变化，且完成完全分化的可能性较低。
持续分化会导致聚集体发生显著的形态学变化，表现为体积增大以及出现有序的纤维状区域。到第12天时，可观察到具有收缩功能的聚集体。这些聚集体始终由大而透明的细胞组成，且通常在聚集体外部包含大量细胞外基质（图2）。尽管整个聚集体出现收缩现象表明分化成功，但在一些未表现出收缩活性的聚集体中，仍可检测到心肌细胞标志物的表达。在将聚集体解离并进行免疫标记后，通过流式细胞术分析可发现，大多数细胞对心肌细胞标志物cTnT呈阳性反应（图3）。该标志物在细胞中的表达稳定，在分化第19天的聚集体中仍可观察到其表达。 
<img alt="细胞生长显微图像；A-D：培养过程中细胞聚集和增殖的不同阶段。" src="/files/ftp_upload/54308/54308fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 
图1：人多能干细胞向心肌细胞命运分化的时程。 聚集后立即观察，细胞几乎填满每个微孔 (A)。一天后，细胞聚集体呈现致密且表面光滑的形态 (B)。即使将聚集体从微孔中取出并接种到孔板中，该形态仍持续存在 (C)。至第8天，聚集体开始扩展，颜色变浅 (D)。比例尺：250 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞凋亡过程、显微镜图像、细胞解体、生物学研究、相差显微技术" src="/files/ftp_upload/54308/54308fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：分化第 12 天开始出现聚集体收缩。 在心脏诱导第三阶段培养基中培养六天后，观察到强烈的全聚集体收缩（上图：舒张状态；中图：收缩状态）。下图由上图与中图相减获得，差异最显著的区域呈现为黑色或白色（箭头所示）。比例尺：250 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术直方图，肌钙蛋白 APC-A，显示 74.8% 的细胞计数比较，数据分析图表。" src="/files/ftp_upload/54308/54308fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3：分化后人多能干细胞中心脏肌钙蛋白 T 的免疫标记。 在第 17 天，大多数细胞通过流式细胞术检测呈心脏肌钙蛋白 T 阳性（填充直方图）。同时显示仅用二抗染色的细胞（未填充直方图）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

传统方法在启动基于悬浮聚集体的人多能干细胞（hPSCs）心肌分化时，常因聚集体的大小和形状不均一而导致培养结果存在异质性。本文介绍一种利用微孔阵列生成尺寸可控的hPSC聚集体，并在促进心肌分化的条件下进行培养的可靠心肌分化方法。

人类多能干细胞（hPSCs）的心脏分化通常在悬浮细胞聚集体中进行。传统的聚集体形成……

首先，将单细胞人多能干细胞（hPSC）悬液在200 × g条件下离心5分钟。离心后，吸除洗涤培养基，并将细胞重悬于聚集培养基中，密度为1.2 × 10⁶ 个细胞/毫升。接着，将1毫升细胞悬液接种至预先准备好的微孔板的每个孔中，并均匀分布细胞。为接种大量孔板，需定期涡旋细胞悬液以防止细胞沉降。接种后，将板在200 × g下离心5分钟。离心结束后，在显微镜下观察板内细胞，确认细胞已沉降至各微孔底部。然后，将培养板置于含5%二氧化碳、5%氧气的低氧培养箱中，在37摄氏度下孵育24小时。聚集体形成后一天，在显微镜下观察聚集体。与离心后立即观察到的聚集体相比，此时的聚集体应保持完整，边缘光滑。将微孔板水平放置，用P-1000移液器的吸头接触培养基液面并紧靠孔壁，小心吸除上清液，注意不要扰动微孔底部的细胞聚集体。当培养基液面降低至距离微孔板纹理表面约1–2毫米时，缓慢倾斜微孔板，再缓慢吸除孔内剩余的培养基。沿孔内壁缓慢将1毫升新鲜配制的预热第一阶段诱导培养基加入孔中，移液时将移液器枪头紧贴孔内侧边缘，使培养基沿孔壁缓慢流出。将培养板放回低氧条件下培养箱中继续培养三天。第4天时，使用5毫升血清移液管收集微孔板中每个孔的细胞聚集体。在15毫升锥形管中收集最多10孔的细胞聚集体悬液。将聚集体置于低氧培养箱中静置15分钟，使其沉降。待聚集体沉降后，小心吸除上清液，并将聚集体重悬于10毫升预热的洗涤培养基中，以去除残留的诱导性细胞因子。将聚集体在50 × g条件下离心2分钟。离心后，吸除上清液，并将沉淀的聚集体重悬于预热的第二阶段诱导培养基中。将聚集体悬液转移至24孔超低吸附培养板中，每孔1毫升。在显微镜下观察聚集体，应为均匀致密的细胞簇。在低氧条件下孵育至第6天。第6天时，按之前方法将最多10毫升的聚集体收集至15毫升锥形管中。待聚集体沉降后，吸除上清液，并将聚集体重悬于预热的第三阶段诱导培养基中。使用5毫升血清学移液管，将聚集体重新分配至24孔超低吸附培养板中，每孔1毫升。在培养第10天进行完全换液。在第12天，将细胞转移至常氧培养条件（20%氧气和5%二氧化碳）下继续培养至培养期结束。经过12天的分化（相当于在心脏诱导第三阶段培养基中培养6天），可观察到细胞聚集体范围内强烈的收缩现象。在第17天，通过流式细胞术检测显示，74.8%的细胞心肌肌钙蛋白T呈阳性，如直方图中填充部分所示。图中还显示了仅用二抗染色的细胞，对应于直方图中的空心部分。在进行该操作时，重要的是在第4天充分洗涤细胞聚集体，以去除痕量的细胞因子，特别是激活素A（activin-A），该因子会促进内胚层分化，从而抑制心脏诱导。在完成该操作后，还可采用其他方法，例如在聚集体内对诱导性细胞类型进行低温培养，以探究其他科学问题，例如邻近胚胎组织的旁分泌信号如何影响人多能干细胞向心肌谱系的分化。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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本文介绍了一种利用微流控平台分离和培养单细胞的实验方案，该平台采用了一种新型的微孔设计概念，可实现高效的单细胞分离和长期克隆培养。...

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微孔中聚集体尺寸优化用于人多能干细胞的悬浮法心肌分化

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