连续波铥激光用于加热培养细胞以研究细胞热效应

本实验的总体目标是通过精确控制培养细胞的温度和时间，在体外研究热剂量依赖性的细胞生物学反应。该方法有助于回答研究细胞或组织对高温反应领域的关键问题，例如视网膜激光治疗的研究。该技术的主要优势在于能够快速加热细胞，并精确控制加热持续时间，从而在实验过程中实现高度可重复的热暴露。

尽管该方法可用于研究培养的视网膜色素上皮细胞对热激光辐照的反应，但也适用于其他模型，例如癌细胞。我们最初是在使用可见激光照射含黑色素的细胞时萌生了该方法的想法。然而，由于色素沉着的差异，导致温度分布不一致。

开始实验操作时，将一个加热板放置在清洁实验台上的可调节金属实验架中。将加热板温度设定为39摄氏度。将一根数值孔径为0.22、纤芯直径为365微米的光纤固定在支架的水平臂上。

将金属臂置于加热板上方，并调节支架，使光纤尖端位于加热板上方12厘米处。将一台波长为1.94微米、功率为20瓦的铥激光器连接至光纤尖端，该激光器配备波长为365纳米、功率为1毫瓦的瞄准光束。在加热板上放置一个直径为30毫米的培养皿。

小心地在加热板表面描出培养皿的边缘轮廓，然后取下培养皿。打开瞄准光束，调节支架，直到光束在加热板上的中心点与所描画的圆圈重合。随后关闭瞄准光束。

开始温度校准程序时，使用本生灯加热20号针头的尖端。用加热后的针尖在直径为30毫米的培养皿底部附近每隔90度穿刺四个孔，使孔径约为300微米。在孔上覆盖电工胶带。

使用细针在覆盖每个孔的胶带上穿一个直径约200微米的小孔。在培养皿底部，将每对相对（相隔180度）的孔之间画一条连线。从线条交叉点开始，沿每条线每3毫米标记一个点，共标记21个测量点。

然后将恰好 1.2 毫升预热至 37 摄氏度的新鲜培养基加入培养皿中。盖上培养皿，将其放置在加热板上已标记的圆圈位置。将直径为 200 微米的热电偶连接至激光控制计算机，并打开温度校准程序。

将热电偶插入培养皿的其中一个孔中，使探针尖端位于培养皿底部的标记位置处。必须仔细检查热电偶尖端是否在测量精度范围内与培养皿底部接触，因为温度可能随深度变化。等待培养基温度稳定在 37 摄氏度。

然后打开铥激光器，并将激光功率设置为所需的起始水平。确认预热时间已设置为140秒和8秒，随后启动预热照射程序。在140秒后，听到提示音蜂鸣时，立即移除培养皿的盖子。

等待预热完成并进行10秒辐照。然后立即盖上培养皿。以这种方式在21个标记位置测量温度。

在铥激光的功率范围内，以3瓦为间隔，每个功率点重复此操作三次。完成后，关闭铥激光器。导出并分析温度数据。

实验前，在直径为30的培养皿中培养色素上皮细胞。将细胞培养物置于37摄氏度、5%二氧化碳的环境中，并使用活细胞成像系统进行观察。照射前一小时，将每皿中的培养基更换为 exactly 1.2 毫升的新鲜培养基。

将培养物放回培养箱。确认辐照站已准备就绪，且加热板已设置为39摄氏度。准备开始辐照时，启动铥激光器并调节至所需功率。

打开实验方案，确认预热时间已设置为140秒和8秒。将RPE细胞培养物放入密闭培养皿中，置于加热板标记位置，并立即开始140秒和8秒的预热照射程序。预热140秒后，移除培养皿盖。

等待预热完成并进行10秒辐照。立即盖上培养皿，等待7秒，然后将培养皿放回培养箱。以逐步增加的激光功率水平辐照其他样品。

实验结束后，关闭铥激光器。开始细胞活力评估前，用PBS洗涤经照射的细胞。获取一种能够区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的试剂盒。

然后在避光条件下，将500 µL结合缓冲液与25 µL碘化乙啶同型二聚体-3、FITC标记的annexin以及Hoechst 33342混合。将细胞与该染色液在室温下孵育15分钟。随后用1×结合缓冲液洗涤细胞两次。

用 PBS 替换结合缓冲液，将细胞置于具有 DAPI、FITC 和 TRITC 滤光片的荧光显微镜载物台上。将显微镜光路设置为目镜，并选择 DAPI 滤光片。打开照明光源，使用 4X 物镜找到焦平面。

将光路切换至显微镜相机。使用显微镜成像软件对图像进行居中和聚焦。使用DAPI滤光片设置图像采集参数。

使用 FITC 和 TRITC 滤光片重复聚焦过程和图像采集设置。然后利用成像软件在培养皿的不同区域使用三种滤光片组合采集多幅图像，并将它们合并为一幅完整的培养皿全貌图像。使用分析软件确定细胞凋亡和细胞死亡的温度阈值。

通过所述的热校准程序，确定了细胞培养皿中心最大温升与激光功率之间的比例关系。随后，将细胞培养皿内的最大温度分布拟合为高斯函数。辐照后观察到三种染色模式。

在温度低于或等于43摄氏度的条件下培养，未观察到细胞活力发生变化。在47摄氏度辐照后3小时首次观察到细胞凋亡。在51摄氏度及以上温度处理后，细胞死亡发生在3小时之后。

随后，通过将测得的死亡和凋亡区域半径的平均值代入描述温度分布的高斯函数，确定细胞凋亡和细胞死亡的平均阈值温度。通过该方法，可在多种不同条件下进行辐照，例如不同的激光轮廓、光斑尺寸和辐照时间。这有助于理解和研究与细胞水平上特定时间点的温度效应相关的问题。

观看本视频后，您应能充分理解如何对细胞培养物进行加热，并良好地控制温度和时间。这可能有助于研究生物体对不同热辐射条件的响应。请务必注意，激光操作可能对眼睛和皮肤造成严重危害。

请随时了解激光照射安全培训的相关信息。进行此操作时，务必佩戴合适的安全眼镜、实验服和手套。