Name: 倒胶体晶体聚（乙二醇）脚手架制作:肝脏组织工程三维细胞培养平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学习制作聚乙二醇倒胶体晶体支架用于肝脏组织工程三维细胞培养。该方法利用Huh-7.5细胞在胶原涂层支架上长期维持肝功能，可提升药物测试效果并应用于再生医学研究。

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作者希望感谢国家研究基金会博士后奖学金（NRF -NRFF2011-01）和竞争性研究计划（NRF-CRP10-2012-07）提供的支持。

1. ICC支架的制备（图1）
<ol>
	<li>制备聚苯乙烯（PS）微球层（直径 = 6 mm；8–13 层微珠）。
	<ol>
		<li>为制备模具，将0.2 ml耐煮微离心管的管尖剪下 40 µl 水平。将切好的管子顶端粘附至 24 x 60 mm2 用水性防水胶将显微镜盖玻片粘合。</li>
		<li>将PS微球（直径 = 140 µm将水悬浮液中的样品转移至一个20 ml的小瓶中，小心地用移液器吸出水悬浮液，然后向小瓶中加入18 ml 70%乙醇溶液。将球形颗粒悬浮液置于超声浴中，以分散聚集的微球。重复此洗涤步骤数次，以彻底去除水及水溶性成分。</li>
		<li>移液器 100 µl 将乙醇注入模具中。</li>
		<li>剪去顶部的 200 µl 微量移液器吸头深入4 mm。移液 25 µl 将球体放入模具中两次，使用 200 µl 微量移液器定容至总体积 50 µl 在每个模具中。</li>
		<li>将模具置于摇床中，120 rpm 振荡过夜。</li>
		<li>在光学显微镜下检查每个模具中微球的排列情况。如果微球未呈六边形有序排列，则添加 50 µl 用70%乙醇处理，并手动沿纵向和横向轴方向摇动以校正排列。</li>
		<li>在室温下让乙醇挥发两天。将模具与珠复合物放入 130 °C 将PS微球在炉中退火6小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备裸露及ECM包被的PEGDA支架
	<ol>
		<li>使用既定方案合成PEGDA大分子单体45,46 用于丙烯酸化线性 PEG 大分子单体（Mw = 4.6 kDa</li>
		<li>在去离子水（DI 水）中配制 50% (w/v) 的 PEGDA 溶液，并在 4,713 × g 离心，直至大分子单体完全溶解。
		<ol>
			<li>对于ECM偶联的ICC支架，额外溶解10% (w/v) 丙烯酰基-PEG-NHS（Mw=3.4 kDa）溶于50% PEGDA溶液中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制20%（w/v）的2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮（PI）乙醇溶液，溶剂为70%乙醇。</li>
		<li>添加 50 µl 每1 ml 50%（w/v）PEGDA中加入20%（w/v）PI储备液，根据PEGDA的分子量调整所需PI储备液的用量。</li>
		<li>在离心管中涡旋混合物1分钟，以获得均一溶液。</li>
		<li>从玻璃载玻片（步骤1.1.7）上剥离模具，去除模具上的胶水，用刮刀小心地将晶格推出，并将每个晶格放入1.5 ml离心管中。用移液器吸取 300 µl 将PEGDA溶液离心，845 × g 离心5分钟，以使PEGDA溶液充分渗入晶格结构中。</li>
		<li>用镊子将晶格从管中取出，并在手套上轻轻吸干多余的 PEGDA 溶液。将晶格放置在覆有石蜡膜的玻璃片上，使平坦的圆形表面朝上。</li>
		<li>将渗入PEGDA溶液的支架暴露于365 nm紫外光（UV）下（10.84 mW/cm²）2使用紫外灯照射5分钟。</li>
		<li>将PEGDA聚合的晶体晶格放入新的小瓶中（每瓶约10个晶格），加入20 ml四氢呋喃（THF）。在摇床上以300 rpm振荡小瓶，每隔1–2小时更换THF，至少更换3次。 
		注意：更换 THF 时切勿完全去除，以防止气泡进入支架，进而导致 PS 去除不完全。应保留足量溶液以浸没晶格，再加入新的 THF。 
		注意：四氢呋喃具有毒性。请佩戴手套、实验服和护目镜，并在通风橱内操作以避免吸入。</li>
		<li>通过向使用过的THF溶液中加入水并观察溶液颜色，检查PS微球是否已完全溶解。如果PS微球未完全溶解，则重复步骤1.2.9。 
		注意：如果存在未完全去除的聚苯乙烯微球，溶液颜色将变为白色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在生物安全柜（BSC）中清洁支架。
	<ol>
		<li>为对支架进行灭菌，准备一个50 ml离心管，按每片支架2 ml的量加入70%乙醇，用刮勺将支架放入管中。让支架在乙醇中浸泡1小时。从本步骤开始，后续所有操作均须在生物安全柜（BSC）中进行。</li>
		<li>小心倒出乙醇，加入磷酸盐缓冲液（PBS）（每支架2 ml），在524 × g离心3分钟以去除气泡。将样品置于冰箱中，并每隔1–2小时更换PBS数次。
		<ol>
			<li>对于I型胶原包被的支架，另准备一个50 ml离心管，其中含有I型胶原原液（每支架1 ml），用刮勺将灭菌后的支架转移至该离心管中，于524 × g离心3 min。随后在旋转摇床上以400 rpm振摇30 min，将离心管置于冰箱中过夜。</li>
			<li>使用前，将支架浸入新鲜的 PBS 中，然后吸除 PBS，重复洗涤两次。 
			注意：由于NHS化学反应需要氨基来形成共价键，因此也可使用其他细胞外基质蛋白替代I型胶原蛋白（图2).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="胶体晶体合成示意图；步骤：PS微球、紫外光固化、PEG-DA水凝胶、胶原蛋白包被。" src="/files/ftp_upload/54331/54331fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. ICC 制备流程概述。 基于 PEG 的 ICC 支架通过微加工技术制备，可选择是否进行细胞外基质（ECM）功能化。ECM 包被的 ICC 支架需要使用 PEG-NHS 以及 PEGDA（详见图 2）。PS 晶格的直径为 6 mm，高度为 8–13 层微球。PS，聚苯乙烯；PEGDA，聚乙二醇二丙烯酸酯；UV，紫外光；THF，四氢呋喃；ECM，细胞外基质。本图经 Wiley47 许可修改并使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54331/54331fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

2. ICC 结构表征
<ol>
	<li>为分析带有或不带有偶联蛋白的ICC结构，使用扫描电子显微镜（SEM）47。
	<ol>
		<li>用4%多聚甲醛（PFA）固定支架，依次在25%、50%、75%、95%和100%乙醇溶液中进行梯度脱水，并在-80 °C下保存直至乙醇完全挥发。</li>
		<li>将样品在冷冻干燥机中干燥48小时。</li>
		<li>使用导电碳胶带将样品固定在样品台上，并放入溅射镀膜仪中。</li>
		<li>自动抽真空后，在20 mA条件下溅射60秒，使样品表面覆盖一层10 nm厚的铂膜。</li>
		<li>在5 kV电压下使用SEM对ICC支架进行成像（图3A，图4A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为测量孔隙及孔腔间连通结构的直径，使用图像分析软件分析SEM显微照片48（例如，ImageJ；图3B,C）。</li>
	<li>为在无细胞条件下可视化支架上偶联的胶原蛋白，使用针对I型胶原的一抗（1:100）对胶原进行荧光标记，并通过共聚焦激光扫描显微镜47（CLSM；图4B）成像。</li>
</ol>
3. Huh-7.5 细胞培养与接种
<ol>
	<li>在100 mm细胞培养皿中，以2-2.5 × 106 个细胞/ml的接种密度培养Huh-7.5细胞，加入10 ml含10%胎牛血清（FBS）和100 U/ml青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）（即生长培养基），在37 °C、5% CO2条件下培养。在生物安全柜（BSC）中每三天更换一次培养基，直至细胞融合度达到75-80%。</li>
	<li>在生物安全柜（BSC）中准备用于接种细胞的支架。
	<ol>
		<li>将支架小心放入24孔板中，确保平面朝上。</li>
		<li>用移液枪向每孔含支架的孔中加入2 ml PBS以清洗支架，随后吸除PBS，并向每孔加入2 ml新鲜PBS。</li>
		<li>吸除PBS，向每孔加入2 ml生长培养基（见步骤3.1），静置30分钟。然后吸除培养基，让支架在空气中干燥1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在生物安全柜（BSC）中使用胰蛋白酶消化法将融合的Huh-7.5细胞（来自步骤3.1）从培养皿上解离。
	<ol>
		<li>吸除培养皿中的培养基，加入4 ml PBS洗涤贴壁细胞，随后吸除PBS。</li>
		<li>加入0.75-1 ml 0.25%胰蛋白酶，置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育3分钟。</li>
		<li>从培养箱中取出培养皿，加入5 ml培养基终止胰蛋白酶反应。将培养基、解离的细胞和胰蛋白酶混合液用移液枪转移至15 ml离心管中。</li>
		<li>以524 × g离心3分钟，弃上清液，将细胞沉淀重悬于5 ml培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用血细胞计数板计数细胞，并计算含有目标细胞数N0的细胞悬液体积（每25 µl，标准实验中N0为1 × 106个细胞）。 
	细胞悬液体积 =（目标细胞数）/（细胞悬液浓度）</li>
	<li>将含有N0个细胞的25 µl细胞悬液缓慢地直接滴加至每个支架（来自步骤3.1.4）的表面。将24孔板放入培养箱中。</li>
	<li>12小时后，使用刮铲小心地将支架转移至新的24孔板中，并向每孔加入2 ml培养基。将24孔板放入培养箱中。</li>
	<li>每3天更换一次培养基，或根据收集培养基进行蛋白分泌分析的时间点决定（见步骤5.1）。</li>
</ol>
4. 细胞活力
<ol>
	<li>为定性分析细胞活力，使用荧光活/死细胞染色试剂盒对细胞进行染色，并采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像。
	<ol>
		<li>按照试剂盒说明书，配制溶液 4 µM 钙黄绿素 AM 和 8 µM 培养基中的碘化乙锭同源二聚体-1（参见步骤 3.1.3）。 
		注意：根据细胞数量进行优化。若细胞增殖且数量翻倍（约200万），则使用两倍量的试剂。</li>
		<li>在生物安全柜中，用移液器吸除每个含有支架的孔中的培养基（步骤 3.7） 500 µl 所配制溶液的孵育样品 37 °C 孵育1小时。</li>
		<li>用铝箔覆盖培养板，以在将培养板从培养箱中取出时保护样品免受光照。使用CLSM49对样品进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为了定量评估细胞活力，使用比色法测定活细胞中的酶活性50 (即2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四氮唑（单钠盐试剂）
	<ol>
		<li>为ICC平台创建标准曲线（即，吸光度（OD）与给定细胞数量的关系图。 
		注意：与其他平台相比，细胞接种效率并非100%，因为细胞可能穿过支架的孔隙。
		<ol>
			<li>确定细胞接种数量 N0 用于绘制标准曲线。 
			注意：选择一个包含实验中预估细胞数量范围的区间。例如，如果初始细胞数量为 5 x 105 细胞，且在实验最后一天估计数量增加约3倍，选择2.5 x 105，5 × 105，1 × 106，以及 2 × 106 细胞作为N0.</li>
			<li>在ICC支架中进行细胞接种（一个N0 每支架接种体积为 25 µl如步骤 3.1-3.6 所述。</li>
			<li>6 小时后，将支架转移至另一个 24 孔板的孔中。选择一个允许细胞贴附但不发生细胞增殖的时间点。</li>
			<li>对转移后的ICC支架进行细胞计数。
			<ol>
				<li>在生物安全柜（BSC）中用培养基将10倍浓度的单钠盐试剂（MSR）溶液稀释至1倍浓度，并用移液器转移 500 µl 将1x MSR溶液加入每个含支架的孔中。将24孔板置于 37 °C 1 小时。</li>
				<li>从每个孔中转移 100 µl 加入96孔板的一个孔中。作为空白对照，用移液器吸取 100 µl 将新鲜的1×单钠盐试剂溶液分别加入96孔板的不同孔中。使用干燥的移液枪头手动去除存在的气泡，并用铝箔覆盖96孔板以避光。</li>
				<li>使用分光光度计在 λ = 450 nm 处测定吸光度。从其他数值中减去空白对照的吸光度，以获得准确的吸光度值51.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>统计细胞数量（NL) 在使用血细胞计数板转移支架后（步骤 4.2.1.3）残留于孔中的数量。 
			注意：使用 300 µl 胰蛋白酶消化细胞。</li>
			<li>计算实际细胞数量，NA. 
			实际值 = 初始值 - 残留在孔中的量 
			NA=0- NL</li>
			<li>通过绘制步骤 4.2.1.4.3 中获得的光密度值（OD）与实际细胞数（N）的关系曲线，制作标准曲线A）并利用此数据估算实验中的细胞数量。 
			注意：如果任何 ICC 参数（即， 造孔剂尺寸、支架的尺寸、细胞外基质蛋白 等等。）发生变化。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 细胞功能
<ol>
	<li>通过Huh-7.5细胞分析蛋白质分泌（即， 通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测收集的培养基（来自步骤 3.7）中的白蛋白、尿素52. 
	注意：根据接种的细胞数量和收集的培养基体积，对培养基进行相应稀释。对于 5 x 105 细胞在ICC中接种时，使用约1:25的比例，再加入抗体包被的孔板中。</li>
	<li>为定性分析细胞功能，对特定的细胞内蛋白进行免疫染色（即，白蛋白），酶（即，CYP450），染色结构组分（即， 细胞肌动蛋白）以及细胞核，并使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行成像49.
	<ol>
		<li>吸除步骤 3.7 中的培养基，加入 2 ml PBS 洗涤含细胞的 ICC 支架。</li>
		<li>用移液器吸取1 ml 4% PFA，在室温下孵育5 min以进行固定。</li>
		<li>用 2 ml PBS 洗涤 3 次。</li>
		<li>通过将支架在1 ml 0.1% 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇（表面活性剂）中孵育30分钟，以通透细胞膜。</li>
		<li>用 2 ml PBS 洗涤 3 次，以去除任何泄漏的蛋白质。</li>
		<li>移液器 500 µl 1% 牛血清白蛋白（BSA）溶液中孵育，室温下孵育1小时，以阻断非特异性结合。</li>
		<li>制备稀释的一抗（即， 白蛋白，CYP450）溶液。
		<ol>
			<li>移液器 500 µl 将1% BSA溶液1 mL加入15 mL离心管中，再加入4.5 mL 0.1%表面活性剂溶液，配制总体积为5 mL的0.1% BSA溶液。</li>
			<li>移液器 98 µl 0.1% BSA 溶液的 200 µl 微量离心管和 2 µl 将一抗稀释至1:50（一抗:0.1% BSA）的比例，配制一抗溶液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>移液器 40 µl 将一抗溶液加至支架上，并用石蜡膜覆盖基质。用铝箔包裹24孔板，并将培养板置于 4 °C 过夜。</li>
		<li>用 2 ml PBS 洗涤 3 次，每次洗涤之间轻轻振荡培养板。</li>
		<li>制备稀释的生物素化二抗（即，抗小鼠抗体）储备液。
		<ol>
			<li>移液器 198 µl 0.1% BSA 溶液及 2 µl 二抗溶液配制：将二抗按1:100比例（二抗：0.1% BSA）稀释。</li>
			<li>在0.1% BSA溶液中配制0.1%鬼笔环肽-罗丹明或鬼笔环肽-荧光素标记物的储备液（用于染色细胞肌动蛋白纤维）。</li>
			<li>移液器 25 µl 将每种溶液取适量加入试管中，充分混匀。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>移液器 50 µl 在支架上加入二抗储存液。用石蜡膜覆盖支架，用铝箔包裹培养皿，并在室温下孵育2小时。</li>
		<li>用 2 ml PBS 洗涤 3 次。</li>
		<li>移液器 200 µl 在支架上加入0.2% 4'-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；一种细胞核染料）溶液，室温孵育2-3分钟。用铝箔包裹培养板。</li>
		<li>用 2 ml PBS 洗涤 2 次。</li>
		<li>使用滴管在载片上滴加一滴封片介质。</li>
		<li>将支架小心置于载玻片上，使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行成像47.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过实时聚合酶链反应（qPCR）检测基因表达。采用标准试剂盒进行逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）。53 和 qPCR54 按照制造商说明书操作。按以下方法从细胞中提取RNA。
	<ol>
		<li>将支架（来自步骤 3.7）放入 1.5 ml 微离心管中。</li>
		<li>将1 ml RNA提取液移入离心管中，室温下置于超声波破碎仪中处理5分钟。</li>
		<li>移液器 200 µl 加入氯仿至各微量离心管中，用手剧烈振荡管子15-20秒。室温放置约3分钟，直至相分离完成。</li>
		<li>以 13,000 x g 离心样品， 4 °C 15 分钟，然后小心取出试管，避免相层混合。</li>
		<li>小心地用移液器吸取 500-600 µl 将第一根离心管中的上层水相转移至第二根微量离心管中。</li>
		<li>加入等体积（500-600 µl向第二个试管中加入异丙醇。</li>
		<li>将离心管倒置3-5次，室温静置10分钟。</li>
		<li>在 13,000 x g 条件下离心样品， 4 °C 15分钟。
		<ol>
			<li>如果试管底部未见沉淀物，则再次离心5分钟。 
			注意：如果仍未观察到可见的沉淀物，则RNA的量可能不足。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将管子倒置并打开管盖以弃去上清液，然后用移液器向管中加入1 ml用DEPC水稀释的70%乙醇。</li>
		<li>轻轻涡旋离心管，使沉淀脱离管壁，然后将离心管晾干。</li>
		<li>添加 50 µl 加入DPEC水以重悬沉淀。</li>
		<li>反复吹打直至沉淀溶解。</li>
		<li>保持10分钟 55 °C 以使双链 RNA 变性为单链 RNA。</li>
		<li>轻轻用手指敲击管底，然后短暂离心（7,500 × g，4 分钟） 4 °C).</li>
		<li>将试管置于冰上，直至进行逆转录酶反应55 以及如所述的实时 PCR 56.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何竞争性财务利益需要披露。

组织工程支架正在迅速发展，旨在提供再生、维持或修复组织所需的各种物理和生化信号，应用于器官替代、疾病研究、药物开发等多个领域57。在肝脏组织工程中，原代人肝细胞一旦从体内分离，便会迅速丧失其代谢功能，因此迫切需要设计合适的支架并开发能够维持肝细胞功能的培养平台。目前的体外（in vitro）肝细胞培养平台已采用多种生物材料。该领域的研究主要集中于模拟体内（in vivo）肝脏微环境的多种特征，例如细胞外基质（ECM）蛋白的构型58,59、共培养系统60,61以及微图案化技术62。然而，仍缺乏具有可控孔隙率和高度空间有序结构的支架。在这方面，本文所描述的ICC细胞培养平台凭借其各向同性特性和高度有序结构，填补了这一空白。我们证明，ICC PEGDA支架是一种适用于培养肝癌细胞（作为肝细胞的模型细胞类型）的合适平台，且进一步的胶原蛋白包被可增强细胞行为47。
在实际操作中，ICC支架的孔隙尺寸可通过聚苯乙烯（PS）微球的尺寸进行调节。此外，支...

肝脏是一个高度血管化的器官，具有多种功能，包括血液解毒、外源性物质代谢以及血清蛋白的合成。肝组织具有复杂的三维（3D）微结构，包含多种细胞类型、胆小管、肝窦，以及具有不同生物基质组成和不同氧浓度的区域。由于这种复杂的结构，构建一个合适的肝脏模型一直存在困难 体外1然而，人们对功能性需求日益增长 体外 携带人肝细胞的模型作为药物毒性测试平台2 以及研究与肝脏相关的疾病3.
现有的肝组织工程平台通过分离单一参数或仅关注少数几个参数，例如细胞的共培养，简化了肝脏的复杂性4，分区微环境的生化组成5，流体动力学6,7 以及生物基质的构型8生物基质的构建可分解为若干参数，如支架材料、细胞外基质（ECM）蛋白的组成、基质刚度以及支架的设计与结构。近年来，采用合成水凝胶进行组织工程研究的报道日益增多，尤其是聚乙二醇（PEG）水凝胶9，鉴于其可调节水凝胶的机械性能、生物活性和降解速率。在肝脏相关研究中，该生物相容性水凝胶已被用于肝脏疾病病毒性感染的研究3作为一种肝细胞平台设计，许多研究采用了肝细胞三明治培养法10,11 以及细胞在水凝胶内的包封12,13 提供模拟所必需的三维环境以及细胞-细胞外基质和细胞-细胞相互作用 体内 微环境。然而，这些平台缺乏高度的控制性和空间有序性，导致支架内部性质不均一14.
倒置晶体胶体（ICC）14 支架是一种高度有序的三维细胞培养支架，最早于21世纪初被提出。该支架独特的结构源于一种利用胶体晶体的简单制备工艺，胶体晶体是由不同直径的胶体颗粒组成的有序晶格。简要来说，该制备过程包括将颗粒整齐排列，并通过加热退火形成晶格结构；随后，将聚合的水凝胶浸入有机溶剂中，使晶格溶出，从而形成六方密排的球形孔隙。15 具有高比表面积。这种高度有序的支架此前已使用合成材料和天然材料制备，包括但不限于聚丙烯酰胺16-21聚（乳酸-共-乙醇酸）15,22-30聚乙二醇31,32聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）21,33-35，以及壳聚糖36-39由防污材料制成的ICC支架倾向于在空腔内促进细胞球状体的形成14,23,40多种细胞类型已证明可在该构型中成功增殖、分化并发挥功能，包括软骨细胞41骨髓基质细胞42和干细胞43,44关于肝细胞，已有研究采用由Na制成的ICC支架进行2SiO3 以及聚丙烯酰胺，但不包括聚乙二醇。采用简单的生物偶联策略（即，通过EDC/NHS介导的胺偶联反应，可制备出共价结合细胞外基质蛋白的聚乙二醇基支架，从而提供更多细胞结合位点，使其更有利于细胞黏附 体内 类似环境并增强肝功能。
在本文及相关的视频中，我们详细描述了利用聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）水凝胶和聚苯乙烯微球晶格制备ICC支架的过程，该支架已针对肝癌细胞（Huh-7.5）培养进行了优化。我们展示了通常不具备细胞黏附性的裸PEGDA ICC支架与胶原蛋白包被的PEGDA ICC支架在支架拓扑结构和细胞性能方面的差异。通过定性和定量方法评估Huh-7.5细胞的活力和功能，以分析其细胞行为。

<table><tbody><tr><td>0.2 ml PCR管</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-02D-C</td><td>耐煮</td></tr><tr><td>Gorilla Glue</td><td>Gorilla Glue, Inc.</td><td>取决于供应商。此物品购自当地商店。</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td>尺寸：24&amp;times;60 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>聚苯乙烯微球</td><td>Fisher Scientific</td><td>TSS#4314A</td><td>直径 = 140 &amp;micro;米；3×10&lt;sup&gt;4&lt;/sup&gt; 每毫升颗粒数及1.4%的粒径分布</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>默克</td><td>1.00983.1011</td><td>分析纯 EMSURE；用 Milli-Q 水稀释至 70%</td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>Elma</td><td>S10H</td><td>设备</td></tr><tr><td>熔炉</td><td>Nabertherm</td><td>N7/H</td><td>设备</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l 移液器吸头</td><td>Axygen Scientific</td><td>T-210-Y-R-S</td><td></td></tr><tr><td>摇床振荡器</td><td>VWR</td><td>444-0142</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇（PEG）</td><td>默克</td><td>1.09727.0100</td><td>M&lt;sub&gt;w&lt;/sub&gt;= 4 kDa；PEG单体的丙烯酰化及所得沉淀物的纯化可制备出分子量为M的PEGDA大分子单体&lt;sub&gt;w&lt;/sub&gt; = 4.6&amp;nbsp;kDa</td></tr><tr><td>离心</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td>设备</td></tr><tr><td>丙烯酸酯-聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯</td><td>莱桑生物</td><td>ACRL-PEG-SVA-3400-1g</td><td>M&lt;sub&gt;w&lt;/sub&gt; = 3.4 kDa</td></tr><tr><td>2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>涡旋</td><td>VWR</td><td>58816-123</td><td>设备</td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5404 000.413</td><td></td></tr><tr><td>石蜡膜</td><td>Parafilm M&amp;nbsp;</td><td>#PM996</td><td>保持在 9&quot; 强度为10.84&amp;nbsp;mW/cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Bluewave 200 紫外光源</td><td>Blaze Technology&amp;nbsp;</td><td>120008, 122300</td><td></td></tr><tr><td>四氢呋喃（THF）</td><td>默克</td><td>107025</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>Heidolph</td><td>543-123120-00-5</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>来自大鼠。1倍，不含CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;和 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;；pH = 7.2</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>16% W/V 水溶液，10 × 10&amp;nbsp;毫升</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>VWR</td><td>43368.9M</td><td>设备</td></tr><tr><td>Freezone 4.5 冷冻干燥机</td><td>Labconco</td><td>7750020</td><td>设备</td></tr><tr><td>溅射镀膜仪</td><td>Jeol Ltd.</td><td>JFC-1600</td><td>设备</td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>Jeol Ltd.</td><td>JSM 5310</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 I 型胶原一抗</td><td>Abcam</td><td>ab6308</td><td></td></tr><tr><td>与Alexa Fluor 488偶联的抗小鼠二抗</td><td>Life Technologies</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>培养板，24孔组织培养板，平底（Nunclon）&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rev PTE LTD</td><td>3820-024</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）&lt;br/&gt; 2.5 g/L 葡萄糖含 L-谷氨酰胺</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（P/S）</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122 E</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Corning 未处理培养皿</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430591</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>设备；37&amp;nbsp;&amp;deg;C，5% 湿度</td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>371</td><td></td></tr><tr><td>豪泽亮线相差血细胞计数板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>哺乳动物细胞活性/细胞毒性Live/Dead检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>L3224&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 检测</td><td>Dojindo Laboratories</td><td>CK04-11</td><td>单钠盐试剂（MSR）</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO 酶标仪&amp;nbsp;</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人白蛋白ELISA试剂盒</td><td>Abcam</td><td>ab108788</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610407</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠一抗（针对CYP3A4、白蛋白）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53850；sc-271605</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 标记的鬼笔环肽</td><td>Life Technologies</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>VWR</td><td>22706.326</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>DPEC 水</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000c 分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>iScript 逆转录超级混合液&amp;nbsp;</td><td>伯乐实验室</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>SYBR select Master Mix for CFX</td><td>生命技术</td><td>4472937</td><td></td></tr><tr><td>引物（需自行选择）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 实时系统，C-1000 Touch 梯度PCR仪</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>SOFT-CFX-31-PATCH&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

倒置胶体晶体聚乙二醇支架的制备：用于肝组织工程的三维细胞培养平台

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

维持肝细胞功能的能力 体外 为了测试外源性物质的细胞毒性、研究病毒感染以及开发靶向肝脏的药物，需要一个能够为细胞提供适当生化和力学信号的平台。近年来的肝组织工程系统已采用由合成或天然水凝胶构成的三维（3D）支架，因其具有高保水性，并能为细胞提供所需的力学刺激。倒置胶体晶体（inverted colloidal crystal, ICC）支架作为一种新兴技术，近年来受到越来越多关注，该支架可实现高度空间有序性，促进同型及异型细胞间的相互作用，以及细胞与细胞外基质（extracellular matrix, ECM）之间的相互作用。本文描述了一种利用聚乙二醇二丙烯酸酯（poly(ethylene glycol) diacrylate, PEGDA）和颗粒沥滤法制备ICC支架的实验方案。简言之，首先由微球颗粒构建晶格结构，随后加入预聚物溶液并进行适当聚合，最后使用有机溶剂去除（即沥滤）微球颗粒例如， 四氢呋喃）。晶格的溶解形成了一种高度多孔的支架，其孔径大小和孔间连通性可控，有利于培养基更易到达细胞。这种独特结构为细胞提供了较大的附着表面积，并促进孔隙之间的有效物质交换；此外，对PEGDA ICC支架进行蛋白质包被亦显著影响细胞性能。本文分析了支架的形态特征以及肝癌细胞（Huh-7.5）在存活率和功能方面的行为，以探究ICC结构及细胞外基质（ECM）包被的影响。总体而言，本论文提供了一种新兴支架的详细制备方案，该支架在组织工程尤其是肝组织工程中具有广泛的应用前景。

以下展示了ICC支架的结构表征代表性结果，以及不同ICC支架条件下培养肝细胞效果的比较。本结果中使用的ICC支架条件包括胶原蛋白包被浓度分别为0 µg/ml（无包被）、20 µg/ml（胶原蛋白20）、200 µg/ml（胶原蛋白200）和400 µg/ml（胶原蛋白400），初始接种的Huh-7.5细胞数量为1×106个。
ICC 孔隙连接与支架拓扑结构的表征。
在对ICC支架进行固定和冷冻干燥后，首先采用扫描电镜（SEM）成像以确定ICC孔隙之间是否形成了适当的连通结构，并观察不同浓度胶原蛋白偶联对支架拓扑结构的影响。利用ImageJ软件对二维裸ICC的SEM图像（图3A）进行定量分析，结果显示平均孔径为102.3 ± 9.3 µm，平均孔间连通直径为38.6 ± 4.3 ...

本文提供了一种新型三维肝细胞培养平台——反向胶体晶体支架的详细制备方案，以及评估肝细胞行为的相关技术。该聚乙二醇（PEG）支架具有可调控的孔径尺寸、良好的孔间连通性，并能够偶联细胞外基质蛋白，从而显著提升Huh-7.5细胞的性能。

体外维持肝细胞功能的能力，可用于测试外源性物质的细胞毒性、研究病毒感染以及开发……

本实验的总体目标是制备基于聚乙二醇（PEG）的反蛋白石结构支架，该支架含有适用于肝组织工程应用的细胞外基质编码。肝组织工程是组织工程与再生医学领域中一个极具前景的研究方向。我们正在构建三维工程化支架，以支持肝细胞长期维持其功能。该技术在药物测试领域具有重要意义，因为利用此系统培养的肝细胞可能更长久地维持其功能，并对药物产生更佳的反应。尽管该方法可为组织工程研究提供见解，但也同样适用于其他系统，例如基于干细胞的系统。本次实验操作将由我实验室的研究生Hitomi进行演示。制备微珠模具时，首先在0.2毫升耐煮沸微量离心管的40微升刻度处剪去管尖。使用防水胶将剪下的管顶部粘附在玻璃显微镜盖玻片上，然后在模具周围涂胶固定。接下来，将聚苯乙烯微球试剂瓶中的液体替换为70%乙醇。将球形溶液置于超声波清洗仪中，以30瓦功率超声处理3分钟，以分散聚集的微球。待微球制备完成后，用移液器向每个模具中加入100微升乙醇。然后，将200微升移液器吸头顶端剪去4毫米，用其向模具中分两次加入共25微升的聚苯乙烯微球。将模具置于摇床中，设置转速为120 RPM，过夜振荡。次日，将模具置于显微镜下观察，检查微球是否呈六方有序排列。在室温下静置两个晚上，使乙醇完全蒸发。此时，小心地将模具与微珠复合物放入130摄氏度的烘箱中加热六小时，以退火聚苯乙烯微珠并形成三维支架的负模。首先，采用上述两篇参考文献中所述的成熟方案合成聚乙二醇二丙烯酸酯大分子单体。接下来，配制50%的PEGDA去离子水溶液，并离心混合物直至完全溶解。对于细胞外基质偶联支架，需在50% PEGDA溶液中额外加入10%的磷虾油PEG NHS。然后，配制20%的光引发剂储备液于70%乙醇中。每毫升 PEGDA 混合物中加入 50 微升光引发剂溶液。然后将混合物涡旋振荡一分钟。接着，从载玻片上剥离模具，用刮勺小心地将晶格推出，并放入各自独立的 1.5 毫升离心管中。将300微升PEGDA溶液移液至各管中，随后离心试管，使PEGDA溶液渗入聚苯乙烯支架。接着用镊子将支架从管中取出，并小心吸去表面多余的PEGDA溶液。将支架置于覆盖有石蜡膜的玻片上，平整的圆形表面朝上。然后，使用紫外点光源将支架暴露于365纳米紫外光下照射5分钟。将约10个PEGDA聚合的晶格放入新样品瓶中，并加入20毫升THF。将样品瓶置于摇床中，以300 RPM转速振荡6小时。每隔一到两个小时取出小瓶，将含有聚合物的溶剂更换为新鲜的四氢呋喃（THF）。最后一次冲洗后，向使用过的THF溶液中加入水，以检查聚苯乙烯（PS）微球是否已完全溶解。如果溶液呈白色，则需进行额外冲洗，直至溶液变为透明。为对支架进行灭菌，准备一个50毫升的微量离心管，每片支架加入2毫升70%乙醇，使用刮勺将支架放入管中。让支架在乙醇中浸泡1小时。1小时后，小心倒出乙醇，并替换为等体积的无菌PBS。然后，离心支架以去除任何气泡。将离心后的支架置于 4 摄氏度保存，并每隔一到两小时取出一次，更换为新鲜的 PBS 溶液。经过数次 PBS 更换后，取出需包被胶原的支架，放入含有每支架一毫升 I 型胶原的离心管中进行包被。接下来，将离心管按前述方法离心，然后在摇床中以 400 RPM 的转速振荡支架 30 分钟。将支架在 4 摄氏度下保存过夜。在 100 毫米细胞培养皿中加入 10 毫升培养基，培养肝癌细胞。每三天更换一次培养基，直至细胞密度达到培养表面的75%至80%。当细胞准备就绪后，小心地将支架平面向上放入24孔板中。随后，用2毫升PBS冲洗每块支架。吸去 PBS，向支架中加入 2 毫升培养基。30 分钟后，移除培养基，使支架干燥 1 小时。随后，采用胰蛋白酶消化法收集肝癌细胞。离心收集细胞后，弃去上清液，并重悬沉淀，使每25微升中含有100万个细胞。将25微升细胞悬液缓慢地直接滴加到每个支架上。然后盖上培养板，放入培养箱中过夜。接下来，小心地将支架转移至新的24孔板中，每孔加入两毫升培养基，然后将培养板放回培养箱。此处展示的是支架的扫描电子显微镜图像。支架由六方最密堆积排列的孔隙构成，孔隙平均直径为100至105 µm，相邻孔隙之间形成连通结构，连通孔径大多在35至40 µm之间。当接种肝癌细胞时，细胞可在预先包被I型胶原的支架上生长和增殖，但在未包被的裸支架上则无法扩增。此外，包被I型胶原的支架上的肝癌细胞表现出浓度依赖性的更高细胞功能。在第14天，接种于400微克/毫升包被的ICC支架上的肝癌细胞分泌的白蛋白量超过裸支架上培养细胞的三倍以上。在进行该操作时，重要的是要确保晶格中的聚苯乙烯微球排列正确。排列不当将导致较差的相互连通性，从而对细胞活性产生不利影响。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备带有涂层的、具有细胞亲和性的基于聚乙二醇的倒相胶体晶体支架。请注意，使用四氢呋喃可能存在危险，在进行本实验操作时，必须采取预防措施，例如在通风橱中操作，并佩戴手套和护目镜。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

倒胶体晶体聚（乙二醇）脚手架制作：肝脏组织工程三维细胞培养平台

我们介绍一种基于芯片的平台，用于在微型生物反应器中进行细胞的三维培养。一块芯片可容纳多达1000万个细胞，并可在无菌、封闭的循环系统中，对流体流动、氧张力等条件进行精确控制，从而实现细胞培养。...

基于芯片的灌注式微型生物反应器中的三维细胞培养

为了构建高度有序的复杂组织结构，必须将多种材料和细胞类型组装成一个整体复合物。这种组合设计结合了器官特异性的分层细胞片，以及两种不同的生物来源材料，后者包含强韧的纤维基质基础和内皮细胞，以促进新生血管的形成。...

组织工程：构建用于递送分层细胞片的多细胞三维支架

组织特异性的细胞外基质（ECM）是调控细胞功能的关键介质。本文介绍了一种合成纯ECM来源的泡沫材料和微载体的方法，这些材料在培养中稳定，无需化学交联，可用于先进的三维体外细胞培养模型或作为促再生生物支架。...

用于组织特异性细胞培养与递送的细胞外基质来源泡沫及微载体的制备

本方案描述了一种结合微加工技术与冷冻凝胶化技术制备弹性三维大孔微凝胶的方法。在载入细胞后，可形成三维微组织，且易于注射 在体内 以促进再生治疗，或组装成阵列用于 体外...

用于可注射再生治疗和高通量药物筛选的三维微组织

本文介绍了一种在自组装肽支架中建立三维培养系统以促进去分化的成人关节软骨细胞向类软骨组织分化的实验方案。...

在三维肽支架中培养哺乳动物细胞

本方案介绍了一种具有伴随性纤维化间质区室的三维仿生模型。该模型采用生理相关浓度的水凝胶按比例制备，模拟间质细胞外基质的生物物理特性，而细胞外基质是细胞相互作用、肿瘤生长及转移的活性调节介质。...

一种用于在具有可调生物物理特性的三维环境中研究肿瘤-间质相互作用的肝癌仿生模型

肝脏疾病可由多种原因引发，导致纤维化或肝硬化。移植是恢复健康的唯一选择。然而，鉴于可移植器官的稀缺，必须探索替代方案。我们的研究提出在动物模型的肝组织中植入胶原支架。...

三维胶原基质支架植入作为肝脏再生策略

非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中肝脏细胞外基质的三维成像

类器官技术革新了器官发育、药物发现和疾病研究中的个性化组织建模。类器官工程正朝着构建复杂合成组织的方向发展。其目标是整合形态发生、类组装体技术与生物基质，以推动组织工程的进步。本实验方案有助于模拟肝脏器官发生过程，并为合成组织的构建建立指导性规范。...

利用人类细胞系进行肝脏器官发生建模、类组装体构建及合成组织设计的体外培养技术

本方案介绍了一种在大鼠模型中优化的两步胶原酶肝脏灌注技术，并展示了分离肝细胞的应用 体外...

大鼠肝脏灌注与原代肝细胞分离：一种对前沿3D类器官培养至关重要的传统方法

学习制作聚乙二醇倒胶体晶体支架用于肝脏组织工程三维细胞培养。该方法利用Huh-7.5细胞在胶原涂层支架上长期维持肝功能，可提升药物测试效果并应用于再生医学研究。

倒置胶体晶体聚乙二醇支架的制备：用于肝组织工程的三维细胞培养平台

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