倒置胶体晶体聚乙二醇支架的制备：用于肝组织工程的三维细胞培养平台

本实验的总体目标是制备基于聚乙二醇（PEG）的反蛋白石结构支架，该支架含有适用于肝组织工程应用的细胞外基质编码。肝组织工程是组织工程与再生医学领域中一个极具前景的研究方向。我们正在构建三维工程化支架，以支持肝细胞长期维持其功能。

该技术在药物测试领域具有重要意义，因为利用此系统培养的肝细胞可能更长久地维持其功能，并对药物产生更佳的反应。尽管该方法可为组织工程研究提供见解，但也同样适用于其他系统，例如基于干细胞的系统。本次实验操作将由我实验室的研究生Hitomi进行演示。

制备微珠模具时，首先在0.2毫升耐煮沸微量离心管的40微升刻度处剪去管尖。使用防水胶将剪下的管顶部粘附在玻璃显微镜盖玻片上，然后在模具周围涂胶固定。接下来，将聚苯乙烯微球试剂瓶中的液体替换为70%乙醇。

将球形溶液置于超声波清洗仪中，以30瓦功率超声处理3分钟，以分散聚集的微球。待微球制备完成后，用移液器向每个模具中加入100微升乙醇。然后，将200微升移液器吸头顶端剪去4毫米，用其向模具中分两次加入共25微升的聚苯乙烯微球。

将模具置于摇床中，设置转速为120 RPM，过夜振荡。次日，将模具置于显微镜下观察，检查微球是否呈六方有序排列。

在室温下静置两个晚上，使乙醇完全蒸发。此时，小心地将模具与微珠复合物放入130摄氏度的烘箱中加热六小时，以退火聚苯乙烯微珠并形成三维支架的负模。首先，采用上述两篇参考文献中所述的成熟方案合成聚乙二醇二丙烯酸酯大分子单体。

接下来，配制50%的PEGDA去离子水溶液，并离心混合物直至完全溶解。对于细胞外基质偶联支架，需在50% PEGDA溶液中额外加入10%的磷虾油PEG NHS。然后，配制20%的光引发剂储备液于70%乙醇中。

每毫升 PEGDA 混合物中加入 50 微升光引发剂溶液。然后将混合物涡旋振荡一分钟。接着，从载玻片上剥离模具，用刮勺小心地将晶格推出，并放入各自独立的 1.5 毫升离心管中。

将300微升PEGDA溶液移液至各管中，随后离心试管，使PEGDA溶液渗入聚苯乙烯支架。接着用镊子将支架从管中取出，并小心吸去表面多余的PEGDA溶液。将支架置于覆盖有石蜡膜的玻片上，平整的圆形表面朝上。

然后，使用紫外点光源将支架暴露于365纳米紫外光下照射5分钟。将约10个PEGDA聚合的晶格放入新样品瓶中，并加入20毫升THF。将样品瓶置于摇床中，以300 RPM转速振荡6小时。

每隔一到两个小时取出小瓶，将含有聚合物的溶剂更换为新鲜的四氢呋喃（THF）。最后一次冲洗后，向使用过的THF溶液中加入水，以检查聚苯乙烯（PS）微球是否已完全溶解。如果溶液呈白色，则需进行额外冲洗，直至溶液变为透明。

为对支架进行灭菌，准备一个50毫升的微量离心管，每片支架加入2毫升70%乙醇，使用刮勺将支架放入管中。让支架在乙醇中浸泡1小时。1小时后，小心倒出乙醇，并替换为等体积的无菌PBS。

然后，离心支架以去除任何气泡。将离心后的支架置于 4 摄氏度保存，并每隔一到两小时取出一次，更换为新鲜的 PBS 溶液。经过数次 PBS 更换后，取出需包被胶原的支架，放入含有每支架一毫升 I 型胶原的离心管中进行包被。

接下来，将离心管按前述方法离心，然后在摇床中以 400 RPM 的转速振荡支架 30 分钟。将支架在 4 摄氏度下保存过夜。在 100 毫米细胞培养皿中加入 10 毫升培养基，培养肝癌细胞。

每三天更换一次培养基，直至细胞密度达到培养表面的75%至80%。当细胞准备就绪后，小心地将支架平面向上放入24孔板中。随后，用2毫升PBS冲洗每块支架。

吸去 PBS，向支架中加入 2 毫升培养基。30 分钟后，移除培养基，使支架干燥 1 小时。随后，采用胰蛋白酶消化法收集肝癌细胞。

离心收集细胞后，弃去上清液，并重悬沉淀，使每25微升中含有100万个细胞。将25微升细胞悬液缓慢地直接滴加到每个支架上。然后盖上培养板，放入培养箱中过夜。

接下来，小心地将支架转移至新的24孔板中，每孔加入两毫升培养基，然后将培养板放回培养箱。此处展示的是支架的扫描电子显微镜图像。支架由六方最密堆积排列的孔隙构成，孔隙平均直径为100至105 µm，相邻孔隙之间形成连通结构，连通孔径大多在35至40 µm之间。

当接种肝癌细胞时，细胞可在预先包被I型胶原的支架上生长和增殖，但在未包被的裸支架上则无法扩增。此外，包被I型胶原的支架上的肝癌细胞表现出浓度依赖性的更高细胞功能。在第14天，接种于400微克/毫升包被的ICC支架上的肝癌细胞分泌的白蛋白量超过裸支架上培养细胞的三倍以上。

在进行该操作时，重要的是要确保晶格中的聚苯乙烯微球排列正确。排列不当将导致较差的相互连通性，从而对细胞活性产生不利影响。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备带有涂层的、具有细胞亲和性的基于聚乙二醇的倒相胶体晶体支架。

请注意，使用四氢呋喃可能存在危险，在进行本实验操作时，必须采取预防措施，例如在通风橱中操作，并佩戴手套和护目镜。