竞争性移植评价造血干细胞健身
2016年8月31日
该方案为建立竞争性小鼠骨髓移植实验以研究造血干细胞/祖细胞功能提供了分步指南，而无需通过细胞分选事先纯化干细胞。
本实验的总体目标是使用竞争性移植测定确定骨髓造血干细胞在体内的适应性。因此，这种方法可以帮助回答干细胞生物学和造血细胞移植领域关于各种作对移植后干细胞自我更新影响的关键问题。该技术的主要优点是它需要的动物数量有限，并且不涉及细胞分选。
虽然这种方法可以提供对干细胞功能的见解，但它也可以通过使用混合骨髓嵌合体在其他领域有用，例如免疫学。这项技术在 1960 年代的初步发展为干细胞生物学领域的研究人员探索人类和小鼠造血干细胞的身份和功能铺平了道路。演示该程序的是实验室的硕士生 Roxanne Hetu-Arbour 和博士生 Edward Owusu Kwarteng。
首先将鼠标放在手术平台上的生物安全柜中，然后用 70% 乙醇润湿皮肤和皮毛。接下来，抓住一只后脚，沿着腿切开皮肤。继续拉开皮肤并切掉多余的肌肉。
然后，用剪刀刀片抵住骨盆骨作为反作用力，拉动腿骨以使股骨脱臼。将胫骨和股骨从膝盖骨上拆下，然后移开脚，并去除剩余的肌肉和肌腱。然后，将骨头放入 6 孔组织培养板的一个孔中的 2 到 3 毫升无菌 PBS 中。
收获所有骨头后，用镊子一次抓住一根骨头，然后将一根 25 号针头插入骨头的一端，针头连接到装满无菌 PBS 的 1 毫升注射器上。压下柱塞，将细胞收集在 15 毫升锥形管中，直到每块骨头的中心呈白色。使用 22 号针头，通过反复穿过针尖，将细胞解离成单个细胞悬液。
收集完所有骨髓后，通过 70 微米尼龙过滤器过滤细胞并计数所得细胞悬液。然后，离心骨髓细胞，去除上清液，并在冰上用新鲜 PBS 将样品稀释至每毫升浓度的 1 倍 10 至 8 分之一细胞。为了确定供体造血干细胞等效物，将 30 微升等分试样的细胞转移到 5 毫升圆底聚苯乙烯管中，并在室温下向样品中加入等体积的未标记 CD16 和 CD32 抗体 5 分钟，以阻断任何非特异性染色。
接下来，将细胞置于 90 μL 适当的荧光染料偶联一抗预混液中，避光孵育。30 分钟后，向细胞中加入 2 mL 染色缓冲液，并涡旋试管。然后离心。
倒出上清液，轻弹重悬沉淀。然后，用 10 μL 荧光染料偶联的链霉亲和素在冰上在黑暗中标记细胞 20 分钟。孵育结束时，在另外两毫升缓冲液中洗涤细胞，并通过流式细胞术分析样品。
使用一个样本作为基线，确定每个样本的估计造血干细胞当量。按照文中概述的计算每个样品的造血干细胞数量后，以一比一的比例混合竞争对手和测试造血干细胞，并在无菌 PBS 中将细胞的最终体积调整为每次注射 200 微升。对于造血干细胞的过继转移，用加热灯加热受辐照的受体小鼠。
然后将 750 微升细胞吸出到一个配备 27 号针头的 1 毫升结核菌素注射器中，并去除气泡。接下来，将鼠标插入适当的约束装置中，用乙醇擦拭注射部位。将针头插入侧尾静脉，斜面朝上并与皮肤平行，然后轻轻按下柱塞。
注射完所有细胞后，取出针头并用无菌纱布压迫注射部位几秒钟以止血。然后将鼠标放在干净的笼子里。要分析外周血，刺穿位于颌骨下方无毛点附近的面部皮肤，并在 EDTA 管中收集一到两滴血液。
将试管放入旋转器中，以防止在等待过程中凝血。接下来，将 1 mL 新鲜制备的室温红细胞裂解缓冲液与血液混合，然后将样品转移到 5 mL 圆底聚苯乙烯管中。在室温下放置 4 分钟后，向每管中加入 4 体积的冰冷 PBS，并用盖子盖住开口。
倒置将试管混合几次，并立即将细胞置于冰上。离心后，倒出透明的红色上清液，轻弹重悬沉淀。然后向细胞中加入 2 毫升染色缓冲液并短暂涡旋。
然后进行第二次离心。轻弹重悬沉淀，然后按照文中的详细说明进行流式细胞术染色。竞争者来源的细胞应存在于骨髓、B 淋巴和 T 淋巴细胞系的所有三个谱系中。
竞争细胞和供体细胞也存在于谱系阴性和造血干细胞骨髓细胞群中。当供体造血干细胞在功能上与竞争细胞等效时，供体和竞争者来源的细胞的比例相等。残留的宿主细胞通常几乎完全是 T 淋巴细胞，因为这些细胞具有更强的放射抗性。
当观察到供体细胞的外周血白细胞比例远低于竞争对手细胞时，造血干细胞功能的某些方面存在缺陷，需要进一步研究。当供体细胞和竞争细胞的数量都较低且宿主细胞占外周血细胞的大部分时，移植被认为不成功，并且无法得出关于供体细胞与竞争细胞的相对功能的结论。一旦掌握，如果作得当，骨髓准备和移植步骤可以在 6 到 7 小时内完成。
在尝试此程序时，请务必记住在细胞制备和动物作步骤中保持无菌条件。在此程序之后，可以执行其他方法，如限制稀释测定，以回答有关功能性干细胞数量的其他问题。看完这个视频，你应该对如何进行有竞争力的骨髓移植有了很好的了解。
不要忘记，使用辐照可能非常危险，并且在执行此程序时应始终采取适当的预防措施。
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概述
该协议提供了一步步指南，用于设置竞争性小鼠骨髓移植实验，以研究造血干/祖细胞功能，无需通过细胞分选提前纯化干细胞。该方法旨在使用竞争性移植测定来确定体内骨髓造血干细胞的适应性。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 造血细胞移植
- 免疫学
背景
- 该技术最初在20世纪60年代开发。
- 它允许探索造血干细胞的身份和功能。
- 它需要有限数量的动物。
- 它不涉及细胞分选。
研究目的
- 评估各种操作对移植后干细胞自我更新的影响。
- 提供有关干细胞功能的见解。
- 探索在其他领域（如免疫学）中的应用。
使用的方法
- 竞争性移植测定。
- 使用混合骨髓嵌合动物。
- 体内评估干细胞适应性。
- 硕士和博士生之间的合作以进行演示。
主要结果
- 对造血干细胞功能的见解。
- 对移植后自我更新机制的理解。
- 在各种研究领域的潜在应用。
- 由受过培训的学生演示程序。
结论
- 竞争性移植测定是干细胞研究中的宝贵工具。
- 它提供关键见解，而无需细胞分选。
- 这种方法可以推进干细胞生物学和免疫学的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Competitive hematopoietic stem cell (HSC) transplant assays provide a rigorous in vivo benchmark for functional stem cell fitness, enabling direct comparison of donor populations under standardized conditions. This approach is pivotal for de-risking early-stage cell therapy candidates and optimizing preclinical models for bone marrow transplantation. The method supports portfolio decisions by clarifying the impact of genetic or experimental manipulations on long-term hematopoietic reconstitution.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of HSC self-renewal and differentiation capacity in vivo.
- Supports functional validation of genetic or pharmacological interventions on stem cell fitness.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing intrinsic versus extrinsic effects on HSCs.
- Provides a gold-standard readout for target validation in hematopoietic research.
Screening & Assay Development
- Standardizes quantification of HSC equivalents for reproducible assay setup.
- Enables robust flow cytometry-based lineage tracking for quantitative outputs.
- Supports assay scalability and cross-study comparability without reliance on cell sorting.
- Prepares validated biological systems for downstream compound or genetic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant transplantation scenarios.
- Enables assessment of HSC expansion or manipulation strategies for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement of cell therapy candidates based on functional engraftment data.
- Facilitates biomarker development by correlating in vivo reconstitution with molecular signatures.
Pipeline & Workflow Integration
This competitive transplant assay bridges early discovery and preclinical validation, providing a functional readout from hypothesis testing through lead identification. It integrates seamlessly with flow cytometry analytics and supports iterative optimization of cell therapy protocols.
- Discovery Biology: Clarifies the impact of experimental variables on HSC function and engraftment.
- Screening: Delivers quantitative, lineage-specific outputs for comparative analysis.
- Analytics: Enables statistical evaluation of donor versus competitor cell contributions.
- Translational Research: Provides continuity from in vitro manipulation to in vivo functional validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for benchmarking HSC fitness across studies and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in HSC-based interventions and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Streamlines workflows by eliminating cell sorting and minimizing animal use.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for cell therapy and transplantation programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates based on functional engraftment data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, sterile technique, and flow cytometry analysis.
- Demands access to irradiation facilities and appropriate biosafety infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of HSC quantification and transplantation protocols.
- Adaptable to various mouse genotypes and experimental manipulations with protocol modifications.
- Dependent on rigorous statistical analysis to interpret competitive engraftment outcomes.
