通过计算机跟踪检测大鼠嗅觉行为果蝇在四象限嗅
2016年8月20日
我们在这里描述了一种行为设置和数据分析方法，用于检测多达 100 只醋蝇（黑腹果蝇）的嗅觉反应。该系统可与单个或多个嗅觉刺激一起使用，并适用于光遗传学激活或神经元亚群沉默。
此设置的总体目标是使用提供的自动苍蝇跟踪软件脚本在四象限嗅觉计中分析果蝇的嗅觉行为。这种方法可以帮助解决有关嗅觉神经系统如何检测外部世界以及大脑如何解码和指导行为决策的关键问题。这种技术的主要优点是它用途广泛且坚固耐用，并允许在大型实验场中按果蝇种群重复测试嗅觉反应。
对于该方案，准备五个气味室，由塑料外容器、玻璃内容器和定制的 PTFE 盖插件组成。插件是一个原始的容器盖，其中中央部分被移除，并连接了两个单向阀。使用四个加臭剂室进行溶剂控制，将一个室用于测试加臭剂。
确保每个腔室都干净，然后在加臭剂容器中加入 1 毫升溶剂或加臭剂稀释液。然后，检查容器在塑料室中的位置，确保没有液体溢出。使用螺帽和 PTFE 插件上的 O 形圈固定盖子，以防止泄漏。
将果蝇饲养在标准玉米粉培养基上。在一个标准瓶子中，放入 30 只雄性和 30 只雌性，并在室温下放置 5 天。从这样的瓶子中，收集新封闭的苍蝇。
对于每个实验队列，在短暂的二氧化碳麻醉下收集 25 只雄性和 25 只雌性果蝇，并让队列在标准果蝇培养基上陈化 2 至 4 天。实验前 40 至 42 小时，将队列转移到装有约 10 毫升 1% 琼脂糖凝胶的小瓶中，用于湿度，无需食物。饥饿有助于增加整个运动，超过 90% 的果蝇应该在饥饿过程中存活下来。
如果超过 10% 的死亡（这可能发生在弱基因型中），请尝试对实验中的所有果蝇使用一天的饥饿。至少提前 5 分钟，打开温度控制器并将其设置为 25 摄氏度。然后，通过塑料管将加臭剂室连接到竞技场。
使用电子流量计检查场馆每个象限的气流速率。确保控制气流和加臭气流都以每分钟 100 毫升的速度运行。苍蝇对气流非常敏感，因此在每次实验之前验证每个象限的气流至关重要。
现在，使用 70% 乙醇清洁竞技场和玻璃板。将所有部件擦拭两到三次，并让它们完全风干后再继续。接下来，将玻璃板夹在竞技场上。
然后，在没有麻醉的情况下将果蝇转移到竞技场中。利用重力，让它们通过其中一块玻璃板上的孔进入，然后用圆形网格覆盖孔。现在，将装载苍蝇的竞技场放入不透光的房间中。
然后，将四个控制气流连接到每个竞技场角落。关闭腔室门，让果蝇适应新环境 10 到 15 分钟。驯化期过后，进行 5 到 10 分钟的对照实验，将果蝇暴露在四个对照气流中。
现在必须立即分析数据。如果苍蝇在竞技场中分布不均匀，则必须重置竞技场。测试控制蝇对清洁空气的行为至关重要。
这将快速验证所有后台条件是否正常。漏光、温度不平衡、场地倾斜或气味污染都会导致问题。如有必要，丢弃苍蝇并再次清洁竞技场。
如果怀疑有加臭剂污染，请更换所有管路。继续对新的队列重复对照测试，直到动物对四个象限中的任何一个都没有表现出偏好。然后，使用三通阀将测试加臭剂室连接到装置上，或重新连接管道并运行测试实验 5 到 10 分钟。
对于较长的实验记录，请每 20 分钟快速停止并重新启动一次跟踪程序，否则数据文件将过大。在测试之间，丢弃苍蝇，用 70% 乙醇清洁竞技场和玻璃板，并更换连接管。保持干燥的气流继续运行，以持续冲洗系统。
为了提高效率，最好有两个场馆，这样就可以在运行期间进行清洁。如果同一天有多个实验出错，请格外小心，确保系统中没有上次运行的气味。对于低浓度的加臭剂或 CO2，这通常不是问题，但对于高度集中的刺激，可能需要在实验运行之间间隔长达 24 小时。
对于数据分析，请使用提供的定制 Matlab 例程将数据转换为 Matlab 格式。加载跟踪软件实时制作的原始数据文件，并创建遵循竞技场轮廓的空间蒙版。将蒙版应用于原始数据以删除落在 Aren 之外的所有数据点，因为它们代表噪声。
然后，删除所有以低于 0.163 厘米/秒的速度移动且移动时间超过 3 秒的数据点。此数据可能是噪声或不移动的苍蝇。现在，通过绘制记录周期中的所有数据点来可视化其余数据点。
数据也可以被视为单个轨迹。可以根据苍蝇行为数据快速估计气味边界。然后，计算吸引力指数，并按照文本协议中的描述进行统计测试。
在行为装置中测试了 25 只雄性果蝇和 25 只雌性果蝇。作为对干燥空气的回应，苍蝇探索了整个竞技场，对任何象限都没有偏好。该线显示一只苍蝇的跟踪轨迹。
当苹果醋被引入左上象限气流时，大多数果蝇都被吸引到那个气味象限。当在左上象限引入驱虫剂加臭剂 10% 丙酸乙酯时，该象限被避开。该象限的吸引力指数得分为 0.68。
有吸引力的指数是嗅觉反应测量中使用最广泛的指标。值大于或低于零表示吸引力或排斥力。该剧本补偿了两次试验之间竞技场位置的细微变化。
可能是噪声或不移动的苍蝇的数据点被删除。虽然测试可以运行任何持续时间，但观察队列在 10 秒箱中的移动变化以了解气味习惯和其他现象是很有趣的。观看此视频后，您应该对如何在四视野检测中有效地运行和分析嗅觉行为有很好的了解。
一旦掌握，每个嗅觉实验可以在大约一个小时内完成，我们通常会在一天内进行四到六个实验。
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概述
本文介绍了一种用于评估醋酸果蝇（Drosophila melanogaster）嗅觉反应的行为设置和数据分析方法。该系统设计用于单个或多个嗅觉刺激，并可适用于神经元子集的光遗传学操控。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 行为生物学
- 嗅觉系统
背景
- 该研究关注嗅觉神经系统如何检测外部刺激。
- 理解大脑对感官信息的解码对行为决策至关重要。
- 嗅觉计设置允许对嗅觉反应进行受控测试。
- 该方法可以容纳大量果蝇进行重复测试。
研究目的
- 评估Drosophila melanogaster的嗅觉行为。
- 调查嗅觉检测和行为反应的机制。
- 为未来的研究提供一个多功能且稳健的实验框架。
使用的方法
- 使用四象限嗅觉计进行行为测定。
- 使用自动化果蝇跟踪软件进行数据收集。
- 准备特定配置的气味室以进行测试。
- 包括溶剂控制以便与测试气味进行比较。
主要结果
- 该设置允许评估大量果蝇的嗅觉反应。
- 展示了对各种嗅觉刺激进行测试的多功能性。
- 通过自动化跟踪增强实验可靠性的稳健数据收集。
- 在测定过程中操控神经元活动的光遗传学应用的潜力。
结论
- 该方法为研究果蝇的嗅觉行为提供了一种全面的方法。
- 它为探索嗅觉处理的神经基础开辟了途径。
- 该设置可适用于神经科学研究中的各种实验需求。
常见问题
Executive Industry Relevance
This assay enables high-throughput, quantitative evaluation of olfactory-driven behaviors in Drosophila, supporting target validation in neuropharmacology and sensory neuroscience. By providing reproducible behavioral readouts linked to neural circuit function, it facilitates mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses involving olfactory processing or chemosensory pathways. The system’s adaptability to multiple stimuli and genetic models enhances its utility in early discovery workflows for lead identification and predictive confidence in target engagement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of olfactory neural circuits to validate targets involved in sensory detection and behavioral response pathways.
- Operational Value: Supports population-level behavioral screening with automated tracking, reducing variability and increasing throughput for target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative attraction/repulsion indices that serve as phenotypic readouts for compound or genetic screening campaigns.
- Operational Value: Standardized airflow control and arena design ensure reproducibility across runs, enabling reliable assay validation for downstream applications.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates continuity from gene or target manipulation to measurable behavioral output, supporting translational biomarker alignment in sensory phenotypes.
- Operational Value: Compatible with genetic models (e.g., transgenic lines), allowing assessment of target knockdown or overexpression effects on olfactory-guided behavior.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by linking genetic or pharmacological perturbations to quantifiable behavioral outputs, supporting progression from target identification to phenotypic validation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of olfactory circuit function by measuring real-time behavioral responses to controlled stimuli.
- Screening: Provides assay-ready, standardized conditions for evaluating large cohorts of flies under defined olfactory challenges.
- Analytics: Delivers spatial behavioral data and attraction index calculations that allow quantitative comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects neural manipulation to observable behavior, supporting preclinical validity of targets in sensory processing pathways.
- Enterprise Reuse: The modular olfactometer design allows reuse across multiple projects, stimuli, and genotypes, promoting platform-level efficiency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target-behavior relationships by reducing noise through automated tracking and behavioral filtering.
- Operational Value: Ensures reproducibility via strict airflow validation, arena cleaning protocols, and control experiment checks.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target validation by providing clear, quantifiable behavioral phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on behavioral de-risking data from olfactory assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, behavioral assay design, and basic MATLAB or equivalent data analysis.
- Depends on airflow regulation equipment, odorant delivery systems, and video tracking hardware with environmental controls.
- Necessitates standardization of starvation protocols, arena cleaning, and control experiments to eliminate positional or contamination biases.
- Must account for genotype-specific survival rates during starvation and adjust protocols accordingly to maintain cohort viability.
- Limited by the need for frequent system flushing and potential cross-contamination with high-concentration odorants, requiring extended downtime between runs.
