Name: 通过计算机跟踪检测大鼠嗅觉行为果蝇在四象限嗅 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 了解使用四象限嗅觉仪和自动化追踪软件检测黑腹果蝇嗅觉行为的方法。该技术可重复测试大群果蝇的嗅觉反应，适用于神经科学研究中的光遗传学应用。

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感谢Terry Shelley制造果蝇实验 arena 和避光密闭装置，感谢Liz Marr在果蝇品系维护方面的帮助，感谢Xiaojing Gao和Junjie Luo在用于数据分析的Matlab代码方面的协助。感谢Monell化学感官中心的Johan Lundström演示其气味递送装置。本研究得到了Whitehall基金会（CJP）和美国国立卫生研究院耳聋与其他沟通障碍研究所（NIH NIDCD，项目号R01DC013070，CJP）资助项目的资助。

1. 装置组装
<ol>
	<li>根据提供的图纸（补充材料，SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf），使用聚四氟乙烯（PTFE）制造星形实验 arena（19.5 cm × 19.5 cm × 0.7 cm）。该 arena 可由商业机构或定制加工单位制造。</li>
	<li>获取两块玻璃板（20.25 cm × 20.25 cm，厚度为 2 mm），使用金刚石涂层钻头在其中一块玻璃板的正中心精确钻一个直径约 0.7 cm 的孔。</li>
	<li>为行为实验 arena 制作一个避光行为箱。同时根据提供的图纸（补充材料，SupplementalSketch_LightTightBox.pdf）为红外 CCD 视频摄像机制作一个避光相机箱。这些箱子可由商业机构或定制加工单位制造。</li>
	<li>将空调单元安装在行为箱的后壁，将 LED 阵列安装在行为箱的侧壁。通过侧壁上的孔将温度探头置入行为箱内，以实现温度的实时反馈与调节（详见图 1和图 2）。</li>
	<li>将红外滤光片和圆形偏振镜安装到摄像机上，并将组件固定至相机箱中。行为箱与相机箱之间由一块玻璃窗隔开，以更好地控制行为箱内的温度（详见图 1和图 2）。</li>
	<li>将红外 CCD 摄像机连接至摄像机适配器，再将摄像机适配器连接至 USB 转换器，最后将 USB 转换器连接至计算机的 USB 接口，用于数据采集。</li>
	<li>根据制造商说明，在计算机上安装视频转换器的驱动程序。可选地，安装 USB 视频转换器制造商提供的图像处理软件，以访问更广泛的摄像机设置和采集参数。</li>
	<li>将空调单元（通过温度控制器背面的“output”接口）和温度探头（通过温度控制器背面的“thermocouple”接口）连接至温度控制器，并将探头放入行为箱内。 
	注意：本实验布局中的温控系统可将箱内温度维持在 18 °C 至 30 °C 之间。更高或更低的环境温度可用于热遗传学实验（如使用 dTrpA1、TrpM8 或 shibirets）以调控神经元活性或抑制突触传递。在大多数实验中，温度维持在 25 °C。</li>
	<li>按以下步骤组装气味递送系统（详见图 1B中的详细示意图和连接配件）：
	<ol>
		<li>使用气压调节器控制来自中央供气系统的空气输入。将碳空气过滤器（填充活性炭）连接至气压调节器，以净化来自中央供气系统的空气。</li>
		<li>组装由多个高分辨率流量计管路调控的流量控制系统。</li>
		<li>如图 1B和图 2F所示，通过分流管将碳空气过滤器的输出连接至流量计管路。将流量计管路的输出通过电子控制的三通电磁阀进行引导，以控制来自流量计的洁净空气是排入室内还是进入自制的气味室24。</li>
		<li>根据制造商手册安装电磁阀控制器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据制造商手册，将电子空气流量计连接至数据采集设备（DAQ）和电源。安装 DAQ 接口软件，以便在每次实验前验证 arena 各象限的气流速率是否相等。</li>
</ol>
2. 嗅觉刺激的制备
<ol>
	<li>准备5个气味室24，每个气味室由一个塑料外容器、玻璃内容器、定制的聚四氟乙烯（PTFE）盖子插件、已移除中心部分的原装容器盖以及两个单向阀组成。 
	注意：可在PTFE盖子周围使用O型圈，以防止在气味灌注过程中气味室漏气。气味室的示意图见图1，实物照片见图2。</li>
	<li>使用四个气味室作为溶剂对照，一个气味室用于测试气味物质。将玻璃容器中加入1,000 µl溶剂或气味物质稀释液（测试气味物质+适当溶剂，实验前充分混匀），然后将玻璃容器放入相应的塑料室中（注意不要将液体洒入塑料室），并拧紧盖子。务必始终为测试气味物质和溶剂对照使用清洁的气味室。 
	注意：水中1/16稀释的苹果醋（5%酸度）可能引发嗅觉吸引行为。相反，使用10%丙酸乙酯矿物油溶液可研究嗅觉排斥行为。在这些情况下，对照刺激为仅含纯矿物油的气味室。</li>
</ol>
3. 果蝇准备
<ol>
	<li>在标准玉米粉培养基上饲养果蝇。将30只雄性与30只雌性亲代果蝇放入一个标准培养瓶中，于25 °C下让其产卵5天 25 °C 或室温。</li>
	<li>每次实验时，收集新羽化的（&lt;1日龄的雄性果蝇25只和雌性果蝇25只，在短暂的CO₂麻醉下2 麻醉</li>
	<li>将果蝇置于含标准果蝇培养基的试管中饲养2-4天。</li>
	<li>实验前40-42小时，将果蝇转移至不含CO₂的环境中2 麻醉 加入含有约10 ml 1%琼脂糖凝胶的小瓶中。这可在不提供食物的情况下保持果蝇的湿度，有助于提高其运动活性。 
	注意：超过90%的果蝇应能在饥饿处理中存活。某些基因型健康状况较差，可能无法耐受40小时的饥饿。在此类情况下，可采用较短时间（如24–28小时），但所有实验条件及重复实验必须保持一致。</li>
</ol>
4. 对吸引性和驱避性气味物质的行为反应
<ol>
	<li>打开温度控制器并将其设置为 25 °C.</li>
	<li>将气味室（对照和测试气味）通过管路连接，一端插入气味室的出口，另一端插入行为箱上的快接接头。</li>
	<li>使用气流计检查每个象限的流速，确保对照和气味物质气流均等于100 ml/min。</li>
	<li>用70%乙醇对PTFE飞行 arena 和玻璃板清洁2-3次，并使其充分风干（约3-4分钟）。</li>
	<li>用夹子将玻璃板固定在实验区域上。</li>
	<li>转移果蝇，避免使用 CO₂2 通过玻璃板上的孔将麻醉气体导入arena。转移完成后，在孔上放置圆形网筛，以防止果蝇逃逸。 
	注意：CO2 麻醉已被证明会影响 果蝇 行为25 且不应在行为学实验前24小时内使用。</li>
	<li>将装有果蝇的实验 arena 置于避光暗室中，通过将连接至行为箱快接接头的管路与 arena 四个角落相连，接入四路控制气流，关闭暗室门，静置 10–15 分钟，使果蝇适应新环境。若条件允许，关闭实验所在房间的照明，以避免可能的微弱光线泄漏对实验结果造成干扰。</li>
	<li>运行一个5-10分钟的对照实验，使果蝇暴露于4股对照气流中。</li>
	<li>立即分析数据（参见下文的数据分析部分），以确保果蝇在实验区域内分布均匀，且吸引指数接近于0。此步骤至关重要，因为它可验证实验区域内是否存在未受控的偏好或回避因素。例如 外部光线泄漏、温度分布不均、实验区域不平整、气味污染 等等。）。如果果蝇分布不均或运动活性较低，应弃用这些果蝇，再次清洁实验区域（步骤4.4），并使用新的一批果蝇重复实验。</li>
	<li>通过打开三通阀或重新插接连接管，将测试气味室与实验装置连接。</li>
	<li>运行测试实验5-10分钟，并按照下文第5节所述分析数据（另见参考文献14） 图3记录时间超过20分钟可能导致数据文件过大，难以进行计算处理。若需进行更长时间的实验记录，可快速停止并重新启动追踪程序，这将导致实验记录之间出现约10秒的间隔。</li>
	<li>弃去果蝇。</li>
	<li>用70%乙醇清洁实验区域和玻璃板（步骤4.4），并在避光 enclosure 内更换连接管。为加快实验进度，可使用一个新的清洁实验区域，同时在进行实验运行时清洗脏污的实验区域。</li>
	<li>如有需要，使用新一批果蝇进行另一次实验。若在同一天内进行多个实验，需格外注意确保系统中无前次测试残留的气味剂。通常情况下，低浓度气味剂或CO2但对于高浓度刺激物，两次实验之间可能需要长达24小时的间隔。此外，若在对照实验中怀疑存在气味污染，可更换流量管之后的所有管路。每次实验间应始终保持干燥空气流通，以持续冲洗系统。</li>
</ol>
5. 数据分析
注意：推荐的果蝇追踪采集软件（详见材料部分）可在采集过程中实时追踪果蝇，并以 *.dat 格式保存所有被检测果蝇的时间戳和坐标信息。我们开发了一套定制的 Matlab 程序，用于将数据转换为 Matlab 格式并进行数据分析。补充材料中提供了代码示例，但具体实现细节将取决于所使用的数据采集软件。
<ol>
	<li>加载原始数据。创建一个与实验区域轮廓一致的空间掩膜，并将该掩膜应用于原始数据，以去除所有位于实验区域外的数据点，因为这些数据代表噪声（图 4A，补充代码 MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask.m）。</li>
	<li>去除所有持续超过 3 秒、移动速度低于 0.163 cm/s 的数据点，因为这些数据很可能是噪声或由静止不动的果蝇产生（图 4B，补充代码 TemporalFiltering.m）。</li>
	<li>通过一次性绘制所有剩余数据点或绘制单条轨迹来可视化结果（图 3，补充代码 SingleTrajectoryViewer.m）。 
	注意：四区域中气味边界的定位可能取决于多种因素，例如每种气味分子的特性以及所使用的气流速率。例如，高挥发性气味分子可能比低挥发性气味分子更充分地填充其所在气味象限。因此，不同气味分子的气味边界可能存在轻微差异。使用光离子化检测器测量气味边界可能存在干扰，因为它通过真空方式从特定位置采样空气，从而破坏该位置的气味浓度。尽管如此，仍可根据果蝇行为数据快速估算气味边界。例如，在图 3C和3D中，基于累积果蝇轨迹可清晰观察到不同气味刺激下的气味边界。</li>
	<li>计算吸引指数（Attraction Index, AI），以判断对照实验是否产生无偏好反应，并评估对气味分子（或光遗传学9）刺激的响应。计算吸引指数时，使用对照组或测试组记录的最后 5 分钟数据。为获得一个介于 +1（完全吸引）和 -1（完全排斥）之间的吸引度量值，采用以下公式计算 AI： 
	<img alt="用于实验分析中测试组与对照组比较的 AI 公式。" src="/files/ftp_upload/54346/54346eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 1"> 
	其中 Ntest 表示测试象限内的数据点数量，Ncontrol 表示三个对照象限中数据点数量的平均值。该指标直观，接近零的值表示无偏好。然而，它不能准确反映位于气味象限内果蝇总数的比例。为获得此比例，可使用百分比指数（Percentage Index, PI）： 
	<img alt="性能指数公式，PI = N_test/N_total，与研究计算相关。" src="/files/ftp_upload/54346/54346eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 2"> 
	其中 Ntest 表示测试象限内的数据点数量，Ntotal 表示四个象限中所有数据点的总数。该公式给出的值介于 0 到 1 之间，0.25 对应无行为偏好（图 3E 和 4C，补充代码 AttractionIndex.m）。</li>
	<li>每种实验条件重复进行 5–10 次，每次使用一组新的果蝇。使用 Kolmogorov-Smirnov 非参数检验比较不同条件之间的吸引指数或与对照组的差异（图 3F，Matlab 中的 kstest2 函数）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

本文所述的四区嗅觉仪是一种多功能行为学系统，可用于研究大量野生型和突变型Drosophila果蝇的嗅觉反应。每次实验约需1小时（包括准备、实验运行和清洁），每天通常可完成4至6次实验。一次典型的实验使用40至50只果蝇，持续5分钟，可产生约450,000个可追踪的数据点用于分析。所述配置经过轻微修改后，也可用于监测其他昆虫或昆虫幼虫在数分钟至数天时间内对嗅觉或其他感官刺激的运动行为。四象限实验对吸引性和排斥性刺激均具有敏感性。大多数气味物质产生的吸引指数（AI）介于-0.9至+0.9之间（公式1）。AI值在+0.5至+1范围内表示果蝇对刺激物表现出强烈的趋近行为，而AI值在-0.5至-1范围内则由强排斥物引发。一般而言，对照气味（干燥空气、湿润空气、矿物油）引起的中性反应应介于+0.1至-0.1之间。AI值通常在整个测试过程中发生变化，反映出果蝇进入气味羽流所需的时间、对新刺激的初始趋近行为及运动活性增强，以及最终对刺激产生的脱敏反应。实验前的对照运行至关重要，必须仔细执行，以确保在无目标刺激条件下果蝇在实验区域内分布均匀。
导致果蝇在实验区域内出现空间偏好最常见...

适应并响应外部环境的能力对所有动物的生存至关重要。动物需要躲避危险、寻找食物和配偶，并从以往经历中学习。感觉系统的作用是接收多种刺激，例如视觉、化学和机械感觉刺激，并将这些信号传递至中枢神经系统进行解释和解码。随后，大脑根据所感知的环境指挥适当的动作行为，例如觅食或逃避捕食者。理解感觉系统如何探测外部世界，以及大脑如何解码信息并做出决策，是神经生物学领域的主要挑战之一。
黑腹果蝇 是研究神经回路如何调控行为的有力模型系统。除了结构简单且维护成本低廉之外， 黑腹果蝇 表现出多种多样且复杂的刻板行为，却仅依靠约10万个神经元组成的紧凑神经系统。目前已存在强大的遗传学技术，可用于操控 黑腹果蝇 基因组，并已生成数千个转基因品系，这些品系能够选择性且可重复地标记相同的神经元亚群10-13这些转基因品系可用于选择性地调控标记神经元的活动（激活或抑制），并通过这些调控手段来研究神经功能如何引导行为。
已开发出多种行为学实验方法用于研究各种 果蝇 行为。 黑腹果蝇与许多动物一样，利用嗅觉来指导多种行为选择，例如寻找食物、寻找配偶以及躲避危险。因此，嗅觉是研究动物神经系统如何检测和解读外部刺激以引导适当行为选择的一个良好感觉系统。为此，已开发出多种用于研究幼虫和成体嗅觉行为的实验方法。传统上，嗅觉行为研究在 果蝇 采用双选T型迷宫范式进行检测，该范式可用于评估先天性和习得性嗅觉行为3在此实验中，约50只果蝇被给予在两个管子之间进行选择的机会：其中一个管子含有待测气味物质，另一个管子含有对照气味（通常为气味溶剂）。果蝇在设定的时间内进行选择，随后统计位于不同小室中的果蝇数量。尽管T型迷宫适用于多种实验，但仍存在若干局限性。例如，仅在一个时间点测量嗅觉行为，而在此时间点之前发生的其他选择行为则被忽略。同样，果蝇群体中个体的行为差异也被忽略。此外，T型迷宫需要人工计数果蝇，可能引入误差。最后，由于仅记录两种选择结果，这降低了检测细微行为变化所需的统计效能。一种替代两选择T型迷宫的方法是四象限（四区域）嗅觉仪14-18在该实验中，动物在一个实验区域内活动，该区域的四个角落均设有潜在的加味气流来源。实验区域呈褶皱的星形，以最大化形成四个明确划分的气味象限。若某一角落提供气味，则该气味仅局限于对应的单个象限内。可追踪动物进入和离开气味象限的行为，并将其与在其余三个对照象限中的行为进行简便比较。因此，四象限嗅觉仪实验可在较大的实验区域内记录动物对气味刺激的空间和时间行为反应。
四象限嗅觉仪最初由 Pettersson 开发 等15 和兽医 等17 研究个体寄生性生物的嗅觉行为反应 膜翅目. Faucher 等18 和 Semmelhack 与 Wang16 调整装置以监测个体的嗅觉反应 果蝇四象限嗅觉仪对吸引性和排斥性反应具有同等的敏感性，可适用于多种测试气味物及实验条件。由 Alex Katsov 开发的自定义果蝇追踪软件19 并由 Julian Brown（详见材料部分）持续维护，为近期四象限嗅觉仪的应用带来了更多优势14,20-23现在可以同时对多达100只果蝇进行高空间分辨率（27.5 像素/厘米）和高时间分辨率（每秒30帧）的检测，从而能够提取果蝇在任意时间点的位置、速度和加速度等多种参数。这使得研究人员能够深入探究果蝇对气味行为反应的动态特征。20需要注意的是，在整个追踪期间，无法持续保持对种群中每只果蝇个体的身份识别。相反，每只果蝇的轨迹仅在两条轨迹未发生交叉时被记录；一旦果蝇轨迹相交，在它们分开后将重新分配新的轨迹。通过结合其他视频采集软件（详见 材料表），相同的配置支持灵活的追踪时长，通过降低帧率可实现长达24小时的果蝇追踪。该选项已被用于研究果蝇的产卵行为，并将其身体姿态与产卵偏好进行比较14四通道嗅觉仪也可用于研究对多模态（例如 嗅觉和视觉刺激，或结合光遗传学9 或热遗传学21 通过呈现感觉刺激进行刺激。此外，高时间分辨率使得能够从群体数据集中提取每只果蝇的运动轨迹。因此，该方法可用于研究嗅觉引导的群体行为以及个体间的社会互动。该实验方法产生的数据具有高度稳健性和可重复性，适用于四通道嗅觉仪在行为筛选中的应用。
本文介绍了四象限嗅觉仪的组装设置。我们进一步展示了该装置在检测果蝇对苹果醋的嗅觉吸引反应以及对高浓度丙酸乙酯的排斥反应中的应用。最后，我们描述了记录的果蝇追踪数据的分析方法，并提供了示例代码。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;空气输送系统&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;（所需数量）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;管路与连接件&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>热塑性NPT(F)歧管</td><td>Cole-Parmer，IL，美国</td><td>R-31522-31</td><td>1</td></tr><tr><td>六角减压接头&amp;nbsp; 乳头接头（1/4英寸MNPT-&gt;1/8MNPT</td><td>McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国</td><td>5232T314</td><td>1</td></tr><tr><td>管路（内径：1/8）</td><td>McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国</td><td>5108K43</td><td>50 英尺</td></tr><tr><td>管路（内径：1/16）</td><td>McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国</td><td>52355K41</td><td>100 英尺</td></tr><tr><td>带倒刺的管路接头</td><td>McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国</td><td>5117K71</td><td>1 包</td></tr><tr><td>快接式管路接头</td><td>McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国</td><td>5779K102</td><td>4</td></tr><tr><td>带倒刺管接头（1/4MNPT-&gt;1/8BF</td><td>McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国</td><td>5463K439</td><td>1 包（10 个）</td></tr><tr><td>带倒刺管接头（1/8MNPT-&gt;1/8BF</td><td>McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国</td><td>5463K438</td><td>2 包（10）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带倒刺管接头（1/8MNPT-&gt;1/16BF</td><td>McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国</td><td>5463K4</td><td>2 包（10）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带倒刺管接头（1/4MNPT-&gt;1/4BF</td><td>McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国</td><td>&amp;nbsp; 5670K84</td><td>1</td></tr><tr><td>六角头塞</td><td>McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国</td><td>48335K152</td><td>1</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;空气压力调节器、空气过滤器和流量计&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;（所需数量）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>实验室气体干燥装置</td><td>W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, 美国</td><td>型号：L68-NP-303；货号 #26840</td><td>1</td></tr><tr><td>150 mm 流管用多管架</td><td>Cole-Parmer，IL，美国</td><td>R03215-30</td><td>1</td></tr><tr><td>150 mm 流管用多管架</td><td>Cole-Parmer，伊利诺伊州，美国</td><td>R03215-76</td><td>1</td></tr><tr><td>150 mm 流管</td><td>Cole-Parmer，IL，美国</td><td>R-03217-15</td><td>9</td></tr><tr><td>阀体组件</td><td>Cole-Parmer，伊利诺伊州，美国</td><td>R-03218-72</td><td>9</td></tr><tr><td>精密空气调节器</td><td>McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国</td><td>6162K13</td><td>1</td></tr><tr><td>电磁阀</td><td>Automate Scientific，加利福尼亚州伯克利</td><td>02-10i</td><td>4</td></tr><tr><td>电磁阀控制器</td><td>ValveLink 8.2，Automate Scientific，Berkeley，CA</td><td>01-18</td><td>1</td></tr><tr><td>电子流量计</td><td>霍尼韦尔</td><td>AWM3100V</td><td>1</td></tr><tr><td>DAQ（NI USB-6009，National Instruments）和一个&amp;nbsp;</td><td>国家仪器公司</td><td>NI USB-6009</td><td>1</td></tr><tr><td>电源</td><td>Extech Instruments</td><td>382200</td><td>1</td></tr><tr><td>气味室</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯广口瓶 2 oz；60 ml</td><td>Nalgene</td><td>562118-0002</td><td>每次实验至少需要5个，但每种稀释浓度的每种气味剂都需要一个独立的容器。可于Container Store购买，货号#635114。</td></tr><tr><td>玻璃气味室，0.25 盎司</td><td>日晕瓶</td><td>LB4B</td><td>每次实验至少需要5个&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&quot;在&quot; 气味室阀门</td><td>Smart Products, Inc.，加利福尼亚州，美国</td><td>214224PB-0011S000-4074</td><td>每个气味室使用其中1个部件，但该部件需要频繁更换</td></tr><tr><td>&quot;出&quot; 气味室阀门</td><td>Smart Products, Inc.，加利福尼亚州，美国</td><td>224214PB-0011S000-4074</td><td>每个气味室使用其中1个部件，但该部件需要频繁更换</td></tr><tr><td>O型圈</td><td>RT Dygert 国际公司，明尼苏达州，美国</td><td>AS568-029 Buna-N O形圈</td><td>1 包（100 个）</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;果蝇实验 arena、相机与行为记录箱&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;（所需数量）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>行为观测与相机箱材料</td><td>Interstate plastics，加利福尼亚州，美国</td><td>ABS黑色挤出板（https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php）</td><td>1803 平方英寸</td></tr><tr><td>用于果蝇实验 arena 和气味室插件的聚四氟乙烯，3/8&quot; 厚，12&quot; ×12&quot;</td><td>McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国</td><td>8545K27&amp;nbsp;</td><td>1</td></tr><tr><td>玻璃板，1/8&quot; 厚，9&quot; × 9&quot;</td><td>McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国</td><td>8476K191&amp;nbsp;</td><td>2</td></tr><tr><td>双作用热电控制器</td><td>WAtronix 公司，加利福尼亚州，美国</td><td>DA12V-K-0</td><td>1</td></tr><tr><td>红外LED阵列</td><td>Advanced Illumination，美国佛蒙特州罗切斯特</td><td>AL4554-88024, PS24-TL</td><td>2 个 LED 阵列和 1 个电源</td></tr><tr><td>空调机组</td><td>Melcor Store</td><td>&amp;nbsp;MAA280T-12</td><td>1</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;成像系统&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;（所需数量）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cosmicar/Pentax C21211TH（12.5 mm F/1.4）C接口镜头</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, 美国</td><td>PEC21211 KP</td><td>1</td></tr><tr><td>CCXC-12P05N 互连电缆</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, 美国</td><td>SOCCXC12P05N</td><td>1</td></tr><tr><td>DC-700 相机适配器</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, 美国</td><td>SODC700</td><td>1</td></tr><tr><td>B+W 40,5 093 IR 滤光片</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, 美国</td><td>65-072442</td><td>1</td></tr><tr><td>TiFFEN 40.5 mm 圆形偏振镜</td><td>亚马逊</td><td></td><td>1</td></tr><tr><td>红外摄像机</td><td>工业视觉源，佛罗里达州，美国</td><td>Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)</td><td>1</td></tr><tr><td>USB视频转换器</td><td>The Imagingsource，北卡罗来纳州，美国</td><td>DFG/USB2-It</td><td>1</td></tr><tr><td>iFlySpy2（果蝇追踪软件）</td><td>Julian Brown，美国加利福尼亚州斯坦福：julianrbrown@gmail.com</td><td>iFlySpy2</td><td>1</td></tr><tr><td>IC Capture 2.2 软件</td><td>The Imaging Source，北卡罗来纳州，美国（http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;其他&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;（所需数量）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dremel 旋转工具</td><td>Dremel，Racine，WI，USA</td><td>Dremel 8000-03&amp;nbsp;</td><td>1</td></tr><tr><td>用于玻璃切割的金刚石涂层钻头</td><td>可从多家供应商处获取；MSC工业供应公司，纽约州梅尔维尔</td><td>90606328</td><td>1</td></tr></tbody></table>

通过计算机追踪检测的嗅觉行为 果蝇 四象限嗅觉仪中

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

神经生物学的一个关键挑战是理解神经回路如何发挥作用以引导动物产生适当的行为。 黑腹果蝇 因其复杂的行为、强大的遗传学技术手段以及紧凑的神经系统，是开展此类研究的极佳模式系统。实验室行为检测已长期应用于 黑腹果蝇 以模拟自然环境的特性，并研究相应行为背后的神经机制（例如 趋光性，趋化性，感觉学习与记忆1-3. 随着近期大量转基因品系的可获得性 果蝇 用于标记特定神经元亚群的品系，行为检测在将神经元与行为关联方面已发挥出重要作用4-11多功能且可重复的实验范式，以及用于数据分析的底层计算程序，对于快速测试具有不同基因型的果蝇品系至关重要。尤其有价值的是那些在测试动物数量、实验持续时间以及所呈现刺激的性质方面具有灵活性的实验装置。所选用的检测方法还应能产生可重复、易于获取和分析的数据。本文详细介绍了一种用于检测果蝇行为反应的系统及实验方案。 果蝇 在大型四区域实验 arena 中观察果蝇行为。该装置在此用于检测果蝇对单一嗅觉刺激的反应；然而，相同装置可经修改以测试多种嗅觉、视觉或光遗传学刺激，或其组合。嗅觉仪装置记录果蝇群体对气味刺激的活动，通过计算分析方法对果蝇行为进行量化。所收集的数据经分析后可快速获得单次实验的读数，这对于高效数据采集和优化实验条件至关重要。

四象限嗅觉仪实验可记录并分析大量果蝇在广阔行为空间中的行走活动。可将气味物质引入进入一个、两个、三个或全部四个象限的气流中。在无气味刺激时，果蝇会在四个象限之间自由移动。观察该行为至关重要，因为它表明实验中未引入非预期的偏差。这些偏差可能包括光照、温度波动、气流差异或气味污染物。图3B展示了25只雄性与25只雌性果蝇在四象限嗅觉仪中对干燥空气的行为反应。采集数据中的一条单个果蝇轨迹也在图3B中被突出显示，表明该果蝇探索了整个行为区域。在5分钟测试期间，所有分析轨迹的吸引指数（AI）接近于0，表明果蝇对气味象限无吸引倾向。同样，该实验的百分比指数（PI）为0.24，表明在5分钟测试期间，果蝇在四个象限中的分布较为均匀。
四区域对吸引性气味物质的行为反应如图所示 图3C将苹果醋引入气流中 将6.25%稀释的苹果醋溶液置于测...

本文介绍了一种用于检测多达100只醋蝇（Drosophila melanogaster）嗅觉反应的行为学实验装置及数据分析方法。该系统可应用于单一或多种嗅觉刺激，并可适用于对神经元亚群进行光遗传学激活或抑制。

神经生物学的一个关键挑战是理解神经回路如何发挥作用以引导动物产生适当的行为。黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）是一种……

本实验装置的总体目标是利用提供的自动化果蝇追踪软件脚本，在四象限嗅觉仪中检测果蝇的嗅觉行为。该方法有助于解答关于嗅觉神经系统如何感知外部环境，以及大脑如何解码并引导行为决策的关键科学问题。该技术的主要优势在于其多功能性和稳健性，能够在较大的实验区域内对果蝇群体进行多次重复测试以评估其嗅觉反应。本实验方案中，准备五个气味室，每个气味室由一个塑料外容器、一个玻璃内容器以及一个定制的聚四氟乙烯（PTFE）盖子插件组成。该插件是在原始容器盖中央部分被移除后制成，并配有两个单向阀。使用其中四个气味室作为溶剂对照，一个气味室用于测试气味物质。确保每个小室清洁，然后向气味容器中加入一毫升溶剂或气味稀释液。接着检查容器在塑料小室中的位置，确保没有液体洒出。使用螺口盖和聚四氟乙烯（PTFE）插件上的O形圈密封盖子，以防泄漏。在标准玉米粉培养基上饲养果蝇。在标准培养瓶中放入30只雄蝇和30只雌蝇，在室温下放置5天以产卵。从此类培养瓶中收集新羽化的果蝇。对于每个实验组，收集25只雄性和25只雌性果蝇，在短暂的二氧化碳麻醉下操作，并将该组果蝇置于标准果蝇培养基中老化两到四天。实验前40至42小时，将果蝇组转移至含有约10毫升1%琼脂糖凝胶的试管中，以提供湿度但不提供食物。饥饿有助于增强整体活动性，且超过90%的果蝇应能存活通过饥饿处理过程。如果死亡率超过10%，这在弱基因型中可能发生，则尝试对实验中的所有果蝇进行一天的饥饿处理。至少提前五分钟打开温度控制器，并将其设定为25摄氏度。然后，通过塑料管将气味室连接到实验 arena。使用电子流量计检测实验区域每个象限的气流速率。确保对照和气味气流的流速均为每分钟100毫升。果蝇对气流极为敏感，每次实验前必须确认每个象限的气流速率。现在，使用70%乙醇清洁实验区域和玻璃板。将所有部件擦拭两到三次，并在继续下一步之前使其完全风干。接下来，将玻璃板用夹具固定在实验区域上。然后，将果蝇转移至实验 arena 中，无需麻醉。利用重力使果蝇从其中一块玻璃板的孔洞进入，随后用圆形网膜封住孔洞。接着，将装有果蝇的 arena 置于避光密闭室中。然后，将四个对照气流分别连接至实验区域的四个角落。关闭培养室的门，让果蝇在新环境中适应10至15分钟。适应期结束后，进行一次5到10分钟的对照实验，使果蝇暴露于四股对照气流中。现在必须立即分析数据。如果果蝇在实验区域内分布不均，则必须重置实验区域。测试对照果蝇对纯净空气的行为反应至关重要。这将快速验证所有背景条件是否正常。漏光、温度不均、 arena 倾斜或气味污染均可能导致问题。如有必要，弃去果蝇并再次清洁 arena。如果怀疑存在气味污染，请更换所有管路。持续使用新的动物群组重复对照实验，直至动物对四个象限均无偏好性。随后，使用三通阀将测试气味室连接至装置，或重新连接管路，并运行5至10分钟的测试实验。对于较长时间的实验记录，每20分钟需快速停止并重新启动追踪程序，否则数据文件会过大。每次测试之间，弃去果蝇，用70%乙醇清洁实验区域和玻璃板，并更换连接管。保持干燥气流持续通入，以不断冲洗系统。为了提高效率，最好准备两个实验区域，以便在进行实验的同时清洁另一个区域。如果同一天内多个实验出现问题，需格外注意确保系统中不存在前次实验残留的任何气味。通常情况下，低浓度的气味物质或CO2不会造成此类问题，但对于高浓度的刺激物，可能需要在两次实验之间留出长达24小时的间隔。进行数据分析时，使用提供的自定义 Matlab 程序将数据转换为 Matlab 格式。加载跟踪软件实时生成的原始数据文件，并创建一个沿实验区域轮廓的空間掩膜。将该掩膜应用于原始数据，以去除所有落在实验区域外的数据点，因为这些数据点代表噪声。然后，移除所有移动速度低于每秒 0.163 厘米且持续时间超过三秒的数据点。这些数据很可能是噪声或静止不动的果蝇。现在，通过在整个记录期间绘制所有剩余的数据点来可视化这些数据。数据也可以单条轨迹的形式进行观察。可根据果蝇行为数据快速估算气味边界。然后，计算趋化指数，并按照文本方案中所述进行统计检验。在行为实验装置中测试了25只雄性和25只雌性果蝇。在干燥空气刺激下，果蝇对整个实验区域进行探索，无任何象限偏好。线条显示了一只果蝇的追踪轨迹。当将苹果醋引入左上象限的气流时，大多数果蝇被吸引至该气味象限。当在左上象限引入驱避性气味物质10%丙酸乙酯时，果蝇则避开该象限。该象限的吸引指数评分为0.68。趋性指数是嗅觉反应测量中最常用的指数。数值大于或小于零分别表示吸引或排斥。该脚本对不同实验之间arena位置的微小差异进行了校正。可能为噪声或非活动果蝇的数据点已被剔除。尽管该实验可运行任意时长，但以每10秒为一个时间区间观察群体运动的变化，有助于理解气味适应及其他现象。观看本视频后，您应能够充分掌握如何有效开展并分析四区域实验中的嗅觉行为。一旦掌握，每项嗅觉实验大约可在一小时内完成，我们通常每天进行四到六项实验。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

通过计算机跟踪检测大鼠嗅觉行为<em&gt;果蝇</em&gt;在四象限嗅

在本视频文章中，我们介绍了一种构建具有稳定且可控几何形状的气味梯度的新方法。我们简要说明了如何利用这些梯度来筛查嗅觉缺陷（完全性与部分性嗅觉丧失），并研究趋化行为中更为细微的特征。...

高分辨率测量果蝇幼虫的嗅觉驱动行为

本文介绍了如何优化嗅觉磁束缚（OMT）装置所获取的视频图像。同时描述了两种用于研究视觉-嗅觉融合的示例性实验方案。...

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本视频介绍了一种用于检测果蝇嗅觉探索行为的方法，称为Y型迷宫法。所展示的实验方案片段演示了如何搭建并实施该检测。...

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自闭症谱系障碍（ASD）与社交和沟通行为受损以及重复性行为的出现相关。本文描述了在黑腹果蝇（Drosophila）模型中研究ASD相关基因与行为缺陷之间相互关系的五种行为范式，用于检测社会间距、攻击性、求偶、理毛以及习惯化行为。...

自闭症谱系障碍的Drosophila模型中的行为评估范式

本文描述了在基于计算机游戏的认知任务期间记录高密度脑电图（EEG）和眼动数据的操作步骤。使用电子游戏来呈现认知任务可在不牺牲实验控制的前提下提高生态效度。...

结合计算机游戏型行为实验与高密度脑电图及红外眼动追踪

了解使用四象限嗅觉仪和自动化追踪软件检测黑腹果蝇嗅觉行为的方法。该技术可重复测试大群果蝇的嗅觉反应，适用于神经科学研究中的光遗传学应用。

通过计算机追踪检测的嗅觉行为果蝇四象限嗅觉仪中

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通过计算机追踪检测的嗅觉行为 果蝇 四象限嗅觉仪中

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