Name: 单脂蛋白的SNARE介导融合在一个微流控流细胞拴支持双分子层通过偏光显微镜TIRF监控 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 了解利用偏振全内反射荧光显微镜在微流控流细胞中检测单个SNARE介导的脂质体与支持双分子层融合事件的方法。该技术可实现单分子灵敏度及约15毫秒时间分辨率，用于同步检测脂质和可溶性货物释放动态。

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我们感谢弗拉基米尔·波列亚耶夫（Vladimir Polejaev，耶鲁大学西校区成像中心）在偏振全内反射荧光显微镜的设计与构建方面所做的工作，感谢戴维·巴德利（David Baddeley，耶鲁大学）在双色检测仪器方面的协助，感谢詹姆斯·E·罗斯曼（James E. Rothman，耶鲁大学）、本·奥沙利文（Ben O'Shaughnessy，哥伦比亚大学）及其研究团队成员富有启发性的讨论。EK 获得了卡夫里基金会卡夫里神经科学学者奖以及美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 1R01GM108954 的支持。

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

成功实施本文所述的SUV-SBL融合实验在很大程度上依赖于若干关键步骤，例如将蛋白质功能性地重组至脂质体中、获得高质量的SBLs，以及选择合适的成像参数以检测单个分子。尽管该实验的成功可能需要一定的时间和努力，但一旦建立，便可提供其他方法无法获得的关于融合过程的丰富信息 体外 引言中讨论的融合实验。可确定小单层囊泡（SUV）与支撑双层膜（SBL）结合和融合的速率、结合至融合时间的分布、脂质扩散系数、每个融合脂质体的尺寸，以及特定融合事件中的脂质释放是受扩散控制还是孔道控制。如果释放速度远慢于扩散预期，则采用假设孔道闪烁导致脂质释放减缓的模型可解释该现象。 P0 融合过程中孔道开放时间所占的比例27.
先前针对单个 SUV-SUV 融合的研究18-20,28 或脂质体和病毒颗粒与SBLs的融合15-17,21,22,33,44 依赖于染料分子之间的FRET和自猝灭效应。相比之下，我们主要避免使用染料去猝灭来研究脂质标记物向SBL转移的动力学，原因有二。首先，FR...

膜融合是一种普遍存在的生物学过程，对于脂质和蛋白质的细胞内运输、分泌、受精、发育以及包膜病毒进入宿主生物体至关重要1-3。对于大多数细胞内融合反应（包括通过胞吐作用释放激素和神经递质），融合两个脂双层所需的能量来源于定位于囊泡（v-SNARE）和靶膜（t-SNARE）上的同源可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）蛋白之间形成的四螺旋束4。突触囊泡胞吐是调控最为严密的融合反应，在动作电位到达后一毫秒内即发生1,4,5。融合孔是两个融合区室之间的初始连接结构，可在最终重新闭合或不可逆地扩张之前多次瞬时开放和关闭5-7。前者导致短暂的“亲吻与逃逸”式融合，而后者则导致完全融合。目前对调控这两种融合模式之间平衡的因素以及调节融合孔闪烁行为的机制尚不完全清楚5,8。
SNARE 蛋白是胞吐作用所必需的；当神经毒素切割 SNARE 蛋白后，突触囊泡的融合即被阻断9。利用小单层脂质体（SUV）进行的群体融合实验表明，SNARE 蛋白不仅为膜融合所必需，而且足以驱动膜融合过程10。在此群体实验中，将含有 v-SNARE 的脂质体（v-SUV）掺入荧光磷脂标记物（N-(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)-磷脂酰乙醇胺（NBD-PE）和 N-(罗丹明 B 磺酰基)-磷脂酰乙醇胺（LR-PE）），并与不含标记、但含有 t-SNARE 的脂质体（t-SUV）混合。最初，v-SUV 中 NBD-PE 的荧光因与 LR-PE 发生荧光共振能量转移（FRET）而被淬灭。当标记的 v-SUV 与未标记的 t-SUV 发生融合后，合并膜中荧光探针的表面密度降低，导致 NBD-PE 荧光增强，从而反映脂质混合的程度10。由于该群体实验易于建立和分析，已被广泛用于研究 SNARE 介导的融合机制10–14。然而，该方法存在若干局限性，例如灵敏度较低、时间分辨率差。最重要的是，作为一种整体性测量手段，它对所有事件进行平均处理，因而难以区分囊泡停靠与融合过程，也难以检测半融合中间态。
在过去十年中，包括我们团队在内的多个研究小组开发了新的检测方法，用于在单个囊泡水平上监测融合事件15-27。Ha 及其同事使用固定在表面的v-SUVs，并监测其与游离的t-SUVs之间的融合过程18,19。通过全内反射荧光（TIRF）显微镜技术，利用分别嵌入v-SUVs和t-SUVs中的脂质结合荧光探针对之间的荧光共振能量转移（FRET）来监测脂质混合18。随后，Brunger 实验室采用一种单脂质标记物结合内容物标记物的方法，实现对脂质混合和内容物混合的同步检测20,28。脂质标记物和内容物标记物均以高浓度（自淬灭浓度）加入；当与未标记的SUVs发生融合时，荧光信号去淬灭20,28。
其他研究者已将v-SUV与重构有t-SNARE的平面双层膜进行融合15-17,21-27,29。含有t-SNARE的靶标（t-SNARE）双层膜的平面几何结构更接近于小而高度弯曲的囊泡与平坦的质膜之间生理融合过程的真实情况。Steinem研究组采用跨越孔隙的膜结构，其上重构了t-SNARE，并将该膜悬置于多孔氮化硅基底之上，利用共聚焦激光扫描显微镜检测单个v-SUV的融合事件23。其他研究则将v-SUV与负载在玻璃基底上的、重构有t-SNARE的平面双层膜进行融合15-17,21,22,24-27,29。使用支撑双层膜（SBLs）的最大优势在于，可利用全内反射荧光显微镜（TIRF）以优异的信噪比检测到停靠和融合事件，且不受游离v-SUV的干扰；尽管如此，使用微流控技术结合标准的远场落射荧光显微镜也可实现单事件分辨24。
一个主要问题是底物与双层膜之间的相互作用是否以及如何影响支撑双层膜的质量和融合过程。早期研究使用直接支撑在玻璃或石英基底上的平面支撑双层膜（SBL）15-17。这些SBL通过t-SUV膜在基底上的吸附、破裂、铺展和融合形成。然而，人们很快发现，以这种方式制备的SBL若缺少关键的t-SNARE组分SNAP25，其v-SUV的停靠与融合动力学与使用完整t-SNARE时所获得的结果并无差异17。由于SNAP25在体内融合过程中是绝对必需的in vivo30,31，这些早期实验的生理相关性因而受到质疑。Tamm课题组通过更精确控制的支撑双层膜形成方法克服了这一挑战21。该方法首先采用Langmuir-Blodgett沉积法制备不含蛋白质的SBL第一单层，随后通过该单层与t-SUV的融合完成双层构建21。该策略实现了SNAP25依赖性的膜融合。
为避免使用Langmuir-Blodgett方法，防止玻璃基底上直接支撑的双层膜产生潜在的人工假象，Karatekin 等 在双层膜与基底之间引入了一层柔软的水合聚乙二醇（PEG）缓冲层24该修饰还导致了SNAP25依赖性的融合24. 软聚合物层支撑的双层膜已被证实能更有效地维持跨膜蛋白的流动性与功能32，且已用于与病毒的融合研究33此外，聚乙二醇化的双分子层似乎仍保留一定的自愈能力，并且非常稳定。34,35首先，将一部分市售的脂质连接的PEG链掺入t-SUV膜中。当这些t-SUV破裂并在玻璃基底上形成平面双层膜时，PEG刷会覆盖平面双层膜的两个脂质单层。由于平面双层膜的形成依赖于t-SUV周围PEG链与亲水性玻璃表面的黏附作用，因此脂质体的破裂和平面双层膜的形成对所用脂质组成相对不敏感。然而，当含有大量胆固醇时，SUV的内聚性增强，可能导致SUV无法自发破裂。若出现这种情况，可采用渗透冲击或二价离子促进平面双层膜的形成。25.
如上所述，在该方法中，聚乙二醇（PEG）刷层覆盖了平面支撑双层膜的两侧。面向微流控流动通道的刷层有助于防止入射v-SUV（通常也覆盖有PEG层）的非特异性粘附。v-和t-SNARE复合物的形成始于远离膜的N末端，并逐步向靠近膜的结构域发展36。为了使v-SUV与t-SBL发生相互作用，v-和t-SNARE的N末端必须突出于PEG刷层之上，而在本实验条件下，这一情况似乎确实存在。通过调节PEG化脂质的密度和PEG链的长度，可调整刷层高度，从而适用于研究SNARE以外的其他蛋白质37,38。覆盖在融合双层膜近端表面的PEG刷层另一优势在于，其可模拟生物膜的拥挤环境——每平方微米生物膜上密集排列着30,000至40,000个内在膜蛋白39。正如本实验中的PEG链一样，覆盖在生物膜上的排斥性蛋白层也必须被推开，才能使两个磷脂双层膜接触，进而实现膜融合。
本实验采用微流控流动通道，因其具有独特优势。首先，微流控流动可实现t-SUV更均匀地沉积、铺展并融合形成t-SBL。其次，微小的通道体积（&lt; 1 µl）可显著减少样品消耗。第三，所需样品体积小，使得整个实验可在持续流动条件下进行。流动可去除弱结合（可能为非特异性结合）的v-SUV，从而清洁SBL16；同时维持t-SBL上方v-SUV的恒定密度，简化动力学分析17。此外，流动条件下可清晰区分已锚定的囊泡与随流移动的游离囊泡25。第四，可在同一盖玻片上设置多个微流控通道，分别用于检测不同实验条件，从而实现在同一次实验运行中对不同条件进行直接比较。van Oijen研究组曾采用类似方法研究流感病毒与缓冲型SBL之间的融合过程33。
在全内反射荧光显微镜（TIRF）中，倏逝波场呈指数衰减（衰减常数约为100 nm），可将荧光激发限制在紧邻玻璃-缓冲液界面的分子范围内。这最大限度地减少了远处荧光分子的信号干扰，提高了信噪比，并可在10–40毫秒的帧曝光时间内实现单分子检测灵敏度。倏逝波场还会在膜融合时导致信号增强：当标记的脂质从小单层囊泡（SUV）转移至固相支持双层膜（SBL）时，平均而言，它们处于更强的激发光场中。这种荧光增强效应在较大的脂质体中更为显著。
如果使用偏振光产生倏逝场，则当标记物从SUV转移到SBL时，额外的效应会进一步影响荧光的变化。一些脂质染料的跃迁偶极矩相对于其嵌入的双分子层具有特定的平均取向角。这导致荧光团在SUV中时所发射的荧光量与在其他环境中不同。 与 SBL，因为偏振光束对两种膜中的染料激发效果不同。对于前者，激发光束将与沿球形SUV分布的跃迁偶极子相互作用；而对于后者，偶极子取向则受限于平面SBL的几何结构。例如，当使用s偏振入射光（偏振方向垂直于入射面）时，若脂质染料的跃迁偶极子方向平行于膜，则染料在SBL中的激发效率高于在SUV中29,40 （如DiI或DiD）41-43。掺入此类荧光团的SUV在结合到SBL上时会显得较暗图7，代表性结果）。当融合孔打开并连接SUV与SBL膜时，荧光探针扩散进入SBL，更易被s偏振的衰逝场激发25,27,29因此，在染料从SUV转移到SBL的过程中，融合位点周围的荧光信号显著增强27 (图3 和 图7）。导致融合伴随信号变化的另一个因素是荧光标记在转移至SBL后因稀释而发生的去淬灭。在本实验所述的检测中，去淬灭的贡献通常远小于衰逝场衰减和偏振效应，因为仅有小部分（<img alt="约等于符号及数学表示法中小于1%的百分比" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 1">脂质的标记比例。
融合后信号的增加可用于推断融合孔的特性，方法是将脂质通过一个对脂质自由通透的孔逃逸所需的时间 <img alt="Static equilibrium equation, ΣFx=0, formula symbol for force balance analysis in mechanics." src="/files/ftp_upload/54349/54349eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 1"> 与实际释放时间 <img alt="τ&lt;sub&gt;release&lt;/sub&gt; symbol, kinetics concept, equation, chemical reaction analysis." src="/files/ftp_upload/54349/54349eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 1"> 进行比较。如果这两个时间尺度相近，则可推断该孔对脂质流动的阻力很小。然而，如果实际释放时间显著长于扩散限制下的释放时间，则表明存在某种阻碍脂质释放的过程，例如孔道闪烁（pore flickering）。扩散限制下的释放时间 <img alt="Static equilibrium equation, ΣFx=0, formula symbol for force balance analysis in mechanics." src="/files/ftp_upload/54349/54349eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 1"> 取决于融合脂质体的尺寸和脂质的扩散系数；对其估算需要量化这两个参数。该检测方法具备单分子灵敏度，可在每次融合事件中，通过追踪脂质释放到SBL后的多个单分子脂质荧光探针来测量脂质扩散系数26。每个融合囊泡的尺寸均可被估算27，方法结合以下四个因素：(i) 单个脂质染料的强度，(ii) 融合后所有荧光探针转移至SBL时，停靠位点周围总荧光的变化，(iii) SUV脂质的已知标记密度，以及 (iv) 每个脂质所占面积。在大量融合事件中发现，实际脂质释放时间远慢于扩散控制释放所预期的时间27，这一点在先前假设SUV尺寸均一的研究中已有报道44。若假设脂质释放的延迟是由孔道闪烁所致，则可通过定量模型估算“孔道开放度”（pore openness），即融合过程中孔道保持开放状态的时间比例27。
在实际可行的情况下，使用脂质和可溶性内容物标记物来检测融合机制非常重要。例如，脂质释放可能受到除孔道闪烁之外其他过程的延迟，例如由围绕孔道的SNARE蛋白限制脂质扩散所致。如果情况如此，那么只要孔道足够大以允许可溶性探针通过，内容物的释放就会先于脂质标记物的释放。该方法中一个更根本的缺陷可能在于这样一种假设：标记脂质转移到SBL是通过一个狭窄的融合孔进行的，该孔连接着SBL和一个基本保持其融合前形态的囊泡。脂质向SBL的转移也可能源于融合孔的快速扩张，伴随着小单层囊泡（SUV）极快地塌陷进入SBL膜，这在此前仅基于脂质释放数据的研究中已有提示29。通过同时监测脂质和内容物的释放，研究发现许多孔道在释放全部脂质标记物后会重新闭合，但仍保留部分可溶性内含物27。这表明至少部分脂质体在融合后并未塌陷进入SBL，且脂质染料向SBL的转移是通过融合孔进行的。此外，脂质和内容物的释放是同时发生的27，因此脂质释放的延迟不太可能是由于孔道周围SNARE蛋白阻碍了脂质扩散所致45。
此前，Karatekin 和 Rothman 发表了一种未监测可溶性内容物释放的 SUV-SBL 融合方案25此处包含了近期的一些进展，即对脂质和内容物释放的同步监测，以及对SUV、脂质和融合孔特性的估算27该方案首先介绍微流控细胞的制备方法，即通过将含有沟槽的聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体块与玻璃盖玻片键合而成25接下来，介绍同时含有脂质和内容物标记物的v-SUV的制备方法。第4和第5节提供了微流控芯片的组装以及SBLs形成的详细操作步骤。 原位 并检查缺陷和流动性，将v-SUV引入流动池以及检测融合事件。第6节提供数据分析的指导步骤。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Milli-Q (MQ) 水</td><td>默克密理博</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-05</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 190 Proof</td><td>去卷积</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Chemical</td><td>A416P4</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 (KCl)</td><td>AmericanBio</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>AmericanBio</td><td>AB00490</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-[2-羟乙基]哌嗪-&lt;em&gt;N&#039;&lt;/em&gt;-[2-乙磺酸] (HEPES)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409911000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;缓冲液&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>HEPES-KOH 缓冲液（pH 7.4）</td><td></td><td></td><td>25 mM HEPES-KOH, 140&amp;nbsp;毫摩尔 KCl，100&amp;nbsp;&amp;mu;M EGTA, 1&amp;nbsp;mM DTT</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;溶剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>氯仿&amp;nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>9180-01</td><td>置于玻璃瓶中，注意：穿戴个人防护装备</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>J.T. Baker</td><td>9070-03</td><td>置于玻璃瓶中，注意：穿戴个人防护装备</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;脂质体的制备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>耐压 Hamilton 注射器</td><td>Hamilton</td><td>不同尺寸</td><td>仅使用玻璃注射器与溶剂（氯仿/甲醇，2:1，v/v）</td></tr><tr><td>Pyrex Vista 11 ml 玻璃管，16x100 mm 螺口培养管</td><td>派热克斯&amp;nbsp;</td><td>70825-16</td><td>彻底清洁，用氯仿冲洗</td></tr><tr><td>1-棕榈酰-2-油酰-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷胆碱，16:0-18:1 PC（POPC）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457</td><td>脂质以氯仿（CHCl₃）溶解形式提供&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 或以密封小瓶中的冻干粉末形式保存。开启后分装。额外部分以干燥脂质膜形式保存于-20℃惰性气体环境中 &amp;deg;C. 将储备液保存在 CHCl 中&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;/MeOH（2:1，v/v）在 -20 &amp;deg;C. 在打开前让其恢复至室温</td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸（钠盐），18:1 PS（DOPS）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td>在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的开放建立了两个原先分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可短暂地反复开放与关闭，从而调控货物分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的模式：不可逆的重新闭合导致瞬时性的“接触—释放”（kiss-and-run）融合，而孔道扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动力学的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法在生化定义明确的体外系统中，利用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜实现单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率。实验中监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合，后者被支撑在柔软的聚合物垫上。该检测利用微流控流动通道，确保样品消耗极小，同时提供恒定密度的SUVs。通过利用融合过程中脂质标记物从SUV转移到SBL时产生的快速信号增强，监测脂质染料转移的动力学。TIRF显微镜的灵敏度允许追踪单个荧光脂质标记物，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV大小。脂质染料释放时间可能远长于永久开放孔道中无阻碍通过所预期的时间。利用假设脂质释放减缓源于孔道闪烁（flickering）的模型，可估算孔道“开放度”，即融合过程中孔道保持开放状态的时间比例。可在SUVs中包封可溶性标记物，以同时监测脂质和可溶性货物的释放。此类测量表明，某些孔道在丢失部分可溶性货物后可能重新闭合。</td></tr><tr><td>1-十八烷酰-2-花生四烯酰-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷脂酰乙醇胺，18:0-20:4 PE（SAPE）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850804</td><td>在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的打开建立了两个原先分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可短暂地反复开放与关闭，从而调控货物分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的模式：不可逆的重新闭合导致瞬时性的“接触—释放”（kiss-and-run）融合，而孔道扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动力学的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法在生化定义明确的体外系统中，利用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜实现单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率。实验中监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合，后者支撑于柔软的聚合物垫上。该检测利用微流控流动通道，确保样品消耗极小，同时提供恒定密度的SUVs。通过利用融合过程中脂质标记物从SUV转移到SBL时产生的快速信号增强，监测脂质染料转移的动力学。TIRF显微镜的灵敏度允许追踪单个荧光脂质标记物，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV大小。脂质染料释放时间可能远长于永久开放孔道中无阻碍通过所预期的时间。使用一种假设脂质释放受阻源于孔道闪烁（flickering）的模型，可估算出孔道“开放度”（openness），即融合过程中孔道保持开放状态的时间比例。可在SUVs中包封可溶性标记物，以同时监测脂质和可溶性货物的释放。此类测量表明，某些孔道在丢失部分可溶性货物后可能重新闭合。</td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（脑组织，猪）（铵盐），脑组织 PI(4,5)P₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046</td><td>在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的打开建立了两个原先分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可短暂地反复开放与关闭，从而调控货物分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的模式：不可逆的重新闭合导致瞬时性的“接触—释放”（kiss-and-run）融合，而孔道扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动力学的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法在生化定义明确的体外系统中，利用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜实现单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率。实验中监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合，后者被支撑在柔软的聚合物垫上。该检测利用微流控流动通道，确保样品消耗极小，同时提供恒定密度的SUVs。通过利用融合过程中脂质标记物从SUV转移到SBL时产生的快速信号增强，监测脂质染料转移的动力学。TIRF显微镜的高灵敏度可追踪单个荧光脂质标记物，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV大小。脂质染料释放时间可能远长于永久开放孔道中无阻碍通过所预期的时间。通过假设脂质释放减缓源于孔道的闪烁（flickering），可建立模型估算孔道“开放度”——即融合过程中孔道保持开放状态的时间比例。此外，可在SUV内包封可溶性标记物，以同时监测脂质与可溶性货物的释放。此类测量表明，部分孔道在释放部分可溶性货物后可能发生重新闭合。</td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷酰乙醇胺-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)（铵盐），18:1 NBD PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810145</td><td>在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的打开建立了两个原先分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可短暂地反复开放与关闭，从而调控货物分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的模式：不可逆的重新闭合导致瞬时性的“接触—释放”（kiss-and-run）融合，而孔道扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动力学的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法在生化定义明确的体外系统中，利用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜实现单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率。实验中监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合，后者支撑于柔软的聚合物缓冲层上。该检测利用微流控流动通道，确保样品消耗极小，同时提供恒定密度的SUVs。通过利用融合过程中脂质标记物从SUV转移到SBL时产生的快速信号增强，监测脂质染料转移的动力学。TIRF显微镜的灵敏度允许追踪单个荧光脂质标记物，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV大小。脂质染料释放时间可能远长于永久开放孔道中无阻碍通过所预期的时间。使用一种假设脂质释放受阻源于孔道闪烁（flickering）的模型，可估算孔道“开放度”（openness），即融合过程中孔道保持开放状态的时间比例。可在SUVs中包封可溶性标记物，以同时监测脂质和可溶性货物的释放。此类测量表明，某些孔道在丢失部分可溶性货物后可能重新闭合。</td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷酰乙醇胺-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]（铵盐），18:1 PEG2000 PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880130</td><td>在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的打开建立了两个原先分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可短暂地反复开放与关闭，从而调控货物分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的模式：不可逆的重新闭合导致瞬时性的“接触—释放”（kiss-and-run）融合，而孔道扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动力学的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法在生化体系明确的体外系统中，利用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜实现单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率。实验中监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE蛋白并支撑于软性聚合物垫上的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合过程。该检测方法采用微流控流动通道，可在持续提供恒定密度SUVs的同时最大限度减少样品消耗。利用融合过程中脂质标记物从SUV转移到SBL时产生的快速信号增强，监测脂质染料转移的动力学。TIRF显微镜的高灵敏度可追踪单个荧光脂质标记物，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV的尺寸。脂质染料的释放时间可能远长于永久开放孔道中无阻碍通过所预期的时间。通过假设脂质释放减缓源于孔道的闪烁行为（pore flickering）的模型，可估算出孔道“开放度”（openness），即融合过程中孔道保持开放状态的时间比例。此外，可在SUVs中包封可溶性标记物，以同时监测脂质与可溶性货物的释放。此类测量结果表明，部分融合孔可能在释放部分可溶性货物后重新闭合。</td></tr><tr><td>胆固醇（绵羊毛， &gt;98%)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td>在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的打开建立了两个原先相互分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可发生瞬时的反复开放与关闭，从而调控货物分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的模式：不可逆的重新闭合导致短暂的“接触—释放”（kiss-and-run）式融合，而孔道扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动力学的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法在生化体系明确的体外系统中，利用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜实现单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率。实验中监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE蛋白并支撑于软性聚合物垫上的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合过程。该检测方法采用微流控流动通道，确保样品消耗极小，同时提供恒定密度的SUVs。通过利用融合过程中脂质标记物从SUV转移到SBL时产生的快速信号增强，监测脂质染料转移的动力学。TIRF显微镜的高灵敏度可追踪单个荧光脂质标记物，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV的尺寸。脂质染料释放时间可能远长于永久开放孔道中无阻碍通过所预期的时间。通过假设脂质释放减缓源于孔道的闪烁（flickering），可建立模型估算孔道“开放度”（openness），即融合过程中孔道保持开放状态的时间比例。此外，可将可溶性标记物包封于SUVs中，以同时监测脂质与可溶性货物的释放。此类测量结果表明，部分融合孔可能在释放部分可溶性货物后重新闭合。</td></tr><tr><td>DiD' 油；DiIC18(5) 油（1,1'-二辛基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二碳菁高氯酸盐）</td><td>分子探针</td><td>D-307</td><td></td></tr><tr><td>Rotavapor R-210</td><td>布希</td><td>R-210</td><td>高于所用脂质相变温度（Tm）的恒温环境</td></tr><tr><td>OG 正辛基-&amp;beta;-D-葡萄糖吡喃糖苷</td><td>Affymetrix</td><td>0311</td><td>-20 保存 &amp;deg;C，让其在打开前恢复至室温</td></tr><tr><td>Shaker - Eppendorf Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyze 透析盒，20k MWCO，3 个&amp;nbsp;毫升</td><td>Life Technologies</td><td>66003</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 吸附剂</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep&amp;nbsp;密度梯度介质</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管，薄壁，Ultra-Clear，13.2&amp;nbsp;毫升，14 × 89 毫米</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Beckman SW41 Ti 转子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磺酰罗丹明B</td><td>分子探针</td><td>S-1307</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column&amp;nbsp;色谱柱，2.5 &amp;times; 10 cm</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>7372512</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0150-01</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Orange 蛋白凝胶染色剂</td><td>分子探针</td><td>S-6650</td><td>DMSO 中的 5,000 倍浓缩液</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;PDMS 块&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅弹性体试剂盒，PDMS</td><td>道康宁</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 玻璃培养皿，150 × 20 mm，带盖</td><td>康宁</td><td>3160-152</td><td></td></tr><tr><td>打孔器 - 可重复使用活检打孔针，0.75&amp;nbsp;毫米</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>手动打孔机&amp;nbsp;</td><td>SYNEO</td><td>MHPM-UNV</td><td></td></tr><tr><td>钻头，直径0.035 × 0.026 × 长度1.5，304不锈钢，TiN涂层，圆形冲头</td><td>SYNEO</td><td>CR0350265N20R4</td><td>钻头直径：0.9 mm，冲孔孔径：0.74 mm</td></tr><tr><td>Tygon Microbore 软管，内径 0.25 mm，外径 0.76 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>06419-00</td><td>0.010&quot; ID，0.030&quot; 光密度</td></tr><tr><td>硅胶管（内径 0.51 mm，外径 2.1 mm）</td><td>Cole-Parmer</td><td>95802-00</td><td>0.020&quot; 0.083&quot; 光密度</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;盖玻片 - 洁净室清洗&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Schott Nexterion 盖玻片玻璃 D</td><td>Schott</td><td>1472305</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;pTIRF装置与配件&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>IX81 显微镜机身</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>EM CCD相机</td><td>Andor</td><td>ixon-ultra-897</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Plate，加热显微镜载物台</td><td>东海日立</td><td>MATS-U52RA26</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 汉密尔顿玻璃注射器（4 个）</td><td>Hamilton</td><td>81365</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>kd Scientific</td><td>KDS-230</td><td></td></tr></tbody></table>

微流控流动池中通过偏振全内反射荧光显微镜监测单个蛋白脂质体与锚定支撑双层膜的snare介导融合

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的打开建立了两个原先相互分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可短暂地反复开放与关闭，从而调控 cargo 分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的方式；不可逆的重新闭合导致瞬时性 &#34;吻-运行&#34; 融合，而扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动态的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法采用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜，具有单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率，并在生化条件明确的体系中进行 体外 系统。通过监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE蛋白并支撑于软性聚合物垫上的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合过程，实现对膜融合事件的观察。该检测利用微流控流动通道，可在持续供给恒定密度SUVs的同时最大限度减少样品消耗。当SUV中的脂质标记物在融合过程中转移至SBL时，荧光信号迅速增强，借此可监测脂质染料转移的动力学过程。全内反射荧光（TIRF）显微镜的高灵敏度可实现对单个荧光脂质标记物的追踪，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV尺寸。脂质染料释放时间可能远长于通过永久开放孔道时预期的无阻碍通过时间。采用假设脂质释放延迟源于孔道闪烁（pore flickering）的模型，可分析孔道 &#34;开放性&#34;，融合过程中孔道保持开放的时间比例，可以被估算。可通过在SUV中包封可溶性标记物，以同时监测脂质和可溶性货物的释放。此类测量表明，某些孔道在释放部分可溶性货物后可能重新闭合。

SBL 质量
在融合实验之前，必须验证SBL的质量和流动性。微流控通道底部玻璃侧的荧光应均匀，无任何明显缺陷。如果气泡通过通道，通常会在SBL上留下可见的痕迹。若存在此类大范围的痕迹或缺陷，则不应使用该通道。有时SUV可能附着在基底上，但未能破裂并形成连续的SBL。在这种情况下，荧光可能仍然显得非常均匀，但在对小区域进行漂白后不会恢复。引入10 mM Mg2+通常有助于解决此问题。也可添加其他试剂以促进SUV破裂，例如其他二价阳离子51、聚合物溶液52或渗透冲击25。
即使荧光基本均匀且在漂白后能够恢复，仍可能有部分未融合的小单层囊泡（SUV）保持完整地存在于表面。如果这些脂质体足够大，会呈现为明亮的斑点。当对包...

本文介绍了一种利用偏振全内反射荧光显微镜（TIRFM），在微流控通道中以单分子灵敏度和约15毫秒时间分辨率检测脂质体与支撑双层膜之间由SNARE介导的单个融合事件的实验方案。该方法可同时检测脂质和可溶性货物的释放，并可测量脂质体尺寸、脂质扩散系数以及融合孔的特性。

微流控流动池中通过偏振全内反射荧光显微镜监测单个蛋白脂质体与锚定支撑双层膜的SNARE介导融合

在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的打开建立了两个原先相互分离的区室之间的首次连接。

本实验的总体目标是观察由神经元和胞吐作用SNARE蛋白驱动的单个膜融合事件，以理解神经递质和激素释放的基本机制。该方法有助于回答膜融合领域中的关键问题，例如货物分子如何通过动态融合孔释放，以及融合后融合孔的命运。该技术的主要优势在于，可在生化定义明确的环境中，对单个事件的囊泡停靠、融合开启及货物释放动力学等不同阶段进行观测。尽管该方法可为胞吐作用提供研究依据，也可应用于其他膜融合反应，例如包膜病毒在感染过程中与靶细胞膜的融合。通常，初学者会面临困难，因为该方法涉及多个不同步骤，需要从微加工技术到蛋白质纯化及成像等多个环节的熟练掌握。首先，使用标准的光刻技术及此处所示的模板制备硅胶母模。接下来，将100毫升PDMS基础液和10毫升固化剂加入一次性塑料杯中，充分搅拌混合。然后将杯子放入真空干燥器中。施加真空，但需密切观察，防止混合物溢出。脱气完成后，将大量脱气的PDMS混合物滴入玻璃培养皿中，将模具的模板面朝上压入PDMS中，以避免在晶圆下方截留气泡。然后，将脱气的PDMS缓慢倒入模板上，直至覆盖5至8毫米厚的聚合物层。若出现气泡，可用移液器吸头轻轻将其去除。将覆盖有PDMS的模板置于烤箱的水平表面上，在60摄氏度下烘烤三小时。随后，使用新的手术刀片切割出含有成型通道结构的PDMS块。注意，切割下的PDMS块需能适配于盖玻片。接下来，将通道凹槽的一侧朝上放置，使用打孔器以连续动作穿过方块进行钻孔。务必从八个孔位的每一个位置上移除被冲出的部分。完成后，将方块的凹槽面朝下粘贴到一张干净的铝箔上。现在，将导管切割成一端略带斜面，用镊子将导管推入打好的孔中约三分之一深度。切割导管的长度，使其能够分别到达缓冲液储液槽和注射泵。为了将导管连接到注射泵的注射器上，从较粗的硅胶管上截取一小段，将较细的导管插入其中一端。这种即用型PDMS模块可保存数月。首先，将PDMS模块置于高真空环境中至少20分钟，以去除溶解的气体，并降低在融合实验过程中微流控通道内产生气泡的风险。接下来，确保显微镜载物台区域已调节至所需温度。在温度平衡的同时，通过将30微升含有t-SNARE蛋白的NBD-PE荧光标记小单层囊泡或无蛋白对照囊泡与60微升缓冲液混合稀释来制备样品。然后，将溶液吸入一支3毫升注射器中。将注射器垂直放置，排出样品上方大部分空气。然后，用石蜡膜密封针头尖端，通过拉动活塞创建真空。在抽真空的同时，轻敲注射器筒以加速溶液脱气。重复此过程数次，直至施加真空时不再出现气泡。接下来，使用直径略大于微流控管路的皮下注射针头在微量离心管盖上打孔。将脱气的小单层脂质体注入微量离心管中，将其放入显微镜载物台上的样品槽内，并使溶液平衡至设定温度。将一块洁净的盖玻片放入等离子清洗仪中，通入空气等离子体处理约五分钟。然后，取下盖玻片，将处理面朝上放置在几层无尘纸巾上，以起到缓冲作用。接着，将PDMS块带有图案的一面朝下，放置在盖玻片上方。使用镊子轻轻按压PDMS块，但不要用力过猛以免压碎玻璃。将组装好的流动池放置在显微镜载物台上。然后，将管路连接至小单层脂质体储液池和注射泵。以每分钟三微升的速度开始抽吸小单层脂质体，直至溶液完全充满通道。当所有通道中的溶液开始在出口侧的管路中上升时，将流速降低至0.5微升/分钟，并孵育30至45分钟。从等离子体处理玻璃盖玻片到将小单层囊泡（SUVs）流入通道之间的时间不应超过10分钟，因为等离子体处理的效果是短暂的。使用低倍物镜通过荧光成像检查各通道是否存在泄漏，然后用脱气缓冲液冲洗所有通道，以去除未结合的囊泡。然后，切换至高倍油镜以进行全内反射荧光显微镜（TIRF）观察，并用胶带将流动池固定在显微镜载物台上。将视场光阑关闭至直径约40微米，并通过软件调节488纳米激发光的强度，使暴露区域的荧光被显著漂白，但不完全漂白。暴露区域中心的荧光强度应低于边缘，因为完整的NBD-PE分子会进入并扩散一定距离后才被漂白。然而，如果表面附着的小单层囊泡（SUV）未能破裂，则暴露区域内的所有荧光团都应被漂白。为了验证研究状态测量的结果，停止光照，数分钟后重新开启，观察荧光是否恢复。对重构缓冲液进行脱气处理，并用其稀释含有v-SNARE重组的小单层囊泡储备液，使最终溶液在60秒内于视野中产生10至100次融合事件。过多的融合事件会增加背景荧光，使事件的检测与分析变得困难。相反，融合率过低则可能导致统计结果不佳。以每分钟两微升的流速将重组了v-SNARE的小单层囊泡注入通道，并切换至适当的激发-发射设置以监测脂质混合。然后，根据随附文本方案中所述调整TIRF角度和偏振。使用561纳米激光持续激发并监测囊泡的荧光。当囊泡到达流动通道并停靠于支撑双层膜上发生融合时，背景荧光信号开始累积。通过软件调节激发激光强度，持续漂白背景荧光，以便清晰观察到新的停靠与融合事件。在给定通道的不同位置采集多个录像。检测NBD-PE荧光，以确认支撑双层膜在这些位置无缺陷。此处展示的是在相对无缺陷且具有流动性的重组t-SNARE支撑双层膜上进行光漂白后荧光恢复的实验结果。通过低光照条件成像，可追踪NBD标记脂质因扩散作用导致的荧光恢复情况。仅监测脂质标记的荧光时，更容易观察到停靠与融合事件。在此处显示的图像序列中，每18毫秒记录一帧。融合发生后，脂质标记物会转移至支撑双层膜中，并从融合位点处扩散开来。在某些情况下，可同时监测脂质混合与可溶性货物的释放。此处展示了一个同时发生脂质混合和可溶性货物释放的代表性事件。在用于包封的高浓度条件下，以红色显示的可溶性内容物荧光最初处于自淬灭状态。以蓝色显示的脂质荧光出现急剧增加，表明发生了脂质混合，这是融合事件的特征，与之前所示的单色脂质标记监测结果一致。孔道开放导致可溶性内容物染料释放，并解除染料在囊泡腔内的初始自猝灭。这引起可溶性货物信号增强，以红色曲线表示。有趣的是，货物的荧光达到一个稳定的平台期。这表明在释放全部脂质标记物和部分可溶性货物后，孔洞已重新封闭。最后，以红色显示的可溶性内容物信号迅速下降，这可能是由于快速的完全融合或脂质体破裂所致。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用重组了t-SNARE蛋白的支持性双层膜制备微流控流动池，并使用全内反射荧光显微镜监测与分析单个囊泡融合事件。感谢观看，祝您的实验顺利。

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