在细胞间接触缺失的两个蜂窝型的插入共培养系统的开发
2016年7月17日
在多细胞生物中，由于旁分泌信号传导，分泌的可溶性因子会引起不同细胞类型的反应。插入室共培养系统提供了一种简单的方法来评估在没有细胞间接触的情况下由分泌的可溶性因子介导的变化。
该程序的总体目标是使用具有可渗透膜的插入物创建两种细胞类型的细胞共培养系统，从而允许分泌的可溶性因子的扩散。这是通过一系列步骤完成的，将含有一种细胞类型的插入片段精细放置在含有第二种细胞类型的多孔组织培养板中。我们在插入物中开始接种 1 型细胞，并在多孔组织培养板中接种 2 型细胞。
第二步是将插入片段转移到含有 2 型细胞的板孔中。最终，这提供了收获两种细胞类型以及相应上清液的能力。因此，可以评估分泌的可溶性因子对目标细胞类型的影响。
在多细胞生物中，由于旁分泌信号传导，分泌的可溶性因子会引起不同细胞类型的反应。因此，插入片段共培养系统的价值在于它能够提供一种原始方法来评估在没有细胞间接触的情况下由分泌的可溶性因子介导的细胞参数变化。与其他共培养技术相比，插入片段共培养系统具有多种优势，例如：一个通过定向信号传导;两个保守的细胞极性;以及三种细胞群特异性检测细胞变化。
下面将详细介绍测量脂多糖激活的 N9 小胶质细胞分泌的细胞因子对神经元 PC12 细胞的毒性作用的具体方案，从而提供对插入片段共培养方法的具体理解。首先，从包装中取出 24 孔组织培养板和 0.4 微米多孔聚四氟乙烯插入物。然后，使用无菌镊子抓住插入物的最上边缘，将插入物放入组织培养板的空孔中。
接下来，用常规 N9 培养基填充小室，直到膜完全覆盖。将插入片段孵育至少 1 小时或过夜，以提高细胞的粘附能力。插入片段准备好后，使用常规 N9 培养基以 80% 至 90% 汇合度分离 N9 小胶质细胞，以获得用于接种插入片段的细胞悬液。
然后，从插入物中取出常规培养基，注意不要用微量移液器吸头刺穿膜。接下来，以每平方厘米 60， 000 个细胞的速度接种 50 微升细胞悬液，或根据插入片段制造商的方案接种每个插入片段。在分配细胞悬液时，通过偶尔倒置试管来确保其保持均匀。
当所有插入物都接种完毕后，轻轻地来回摇动板，然后从左到右摇动，以使细胞均匀分布。避免做圆周运动，因为这会导致细胞在插入片段的中心积累。随后，将含有插入片段的板孵育 24 小时，然后再进行 N9 小胶质细胞活化。
首先称取 10 毫克脂多糖，并将其储存在 1.5 毫升 Eppendorf 管中以备后用。由于脂多糖是一种有效的促炎内毒素，需要特别的安全预防措施，因此强烈建议佩戴眼镜、手套和颗粒物呼吸器。然后，使用温热的 N9 处理培养基制备一组连续稀释的脂多糖，以获得每毫升 4 微克、2 微克和 1 微克的工作溶液。
最后，从插入物中取出一半的培养基，注意不要干扰细胞。然后，向插入物中轻轻加入 25 μL 脂多糖工作溶液，以产生每毫升 2 μg、1 μL 或 0.5 μL 的最终稀释液。在进行共培养实验之前，将板再孵育 24 小时。
此步骤需要以每平方厘米 30， 000 个细胞分化的中间神经元接种 PC12 细胞，并用脂多糖激活 N9 小胶质细胞 24 小时，如上一节所述。首先轻轻地从插入物中取出所有培养基，然后用 50 微升新鲜、温暖的 N9 处理培养基代替。这对于去除所有痕量的脂多糖是必要的，只留下活化的 N9 小胶质细胞。
请记住，小室在组织培养板的孔中是松散的，如果吸头用力压在壁上，可能会四处移动。此步骤应一次执行一个插入片段，以防止细胞因长时间接触空气而变干。随后完全去除神经元 PC12 细胞培养基，并用 0.6 mL 新鲜、温热的 PC12 处理培养基替换。
一次做一个，以确保细胞不会变干。使用镊子夹住插入片段的最上边缘，然后将其轻轻放入含有神经元 PC12 细胞的孔中。转移所有插件后，检查插件膜下方是否存在气泡。
气泡会阻止穿过插入室膜的任何交换，并可能危及整个实验。使用镊子非常轻柔地将插入物从孔中提起，然后将其放回细胞培养基中，以去除任何气泡，此作应去除大多数气泡。但是，对于持续存在的气泡，请尝试将插入片段以一定角度轻轻浸回细胞培养基中。
不要敲击或搅动插入片段，因为这容易导致贴壁细胞解离。然后，检查插入物和孔中的介质体积，两个隔室中的液体应大致处于同一水平。当去除所有气泡且培养基体积合适时，孵育板。
然后可以收获细胞、培养基或两者兼而有之，以测量 N9 小胶质细胞和神经元 PC12 细胞之间的旁分泌信号传导的影响。在下隔室的细胞培养基上进行酶联免疫吸附测定，以定量促炎细胞因子。结果表明，活化期后 24 小时，与未处理的小胶质细胞相比，用每毫升 2 微克脂多糖处理的 N9 小胶质细胞分泌的促炎细胞因子（如间溶蛋白-6、肿瘤坏死因子-α 和干扰素 γ）明显更多。
此外，用每毫升 1 微克脂多糖处理的 N9 小胶质细胞在 24 小时后分泌的干扰素 γ 明显增加，而需要 48 小时才能看到细胞培养基中 interluken-6 和肿瘤坏死因子-α 水平显着增加。相比之下，0.5 μg/mL 的条件在激活期后 24 小时和 48 小时均未能增强 N9 小胶质细胞中的细胞因子表达。此外，每毫升 2 微克组在 24 小时的数据表明存在小胶质细胞增生，即小胶质细胞种群的增加。
然而，直到 48 小时后，蜂窝数量才显着增加。最后，为了评估小胶质细胞激活导致细胞因子分泌增强和小胶质细胞的后果，在共培养的神经元 PC12 细胞中评估了细胞毒性。通过测量受损细胞释放的细胞外乳酸脱氢酶水平，发现随着 N9 细胞上脂多糖浓度的增加，神经元 PC12 细胞表现出更多的细胞死亡。
因此，这些结果表明，分泌的可溶性因子能够穿过共培养插入物的膜，并且在没有细胞间接触的情况下，可以对神经元 PC12 细胞造成细胞毒损伤。虽然这里只介绍了一种插入片段共培养的情况，但这是一种非常灵活的技术。在该方案中，一种细胞类型用负责减少可溶性因子分泌的分子进行预处理，这些可溶性因子在将插入片段转移到孔中时，会影响第二种细胞类型的行为。
然而，可以在共培养系统中将两种细胞类型一起孵育，以检测一种或两种细胞群对后续处理的弱点或抵抗力增加。例如，该技术可以简单地利用两个细胞群一起孵育而不进行任何处理，以评估基础旁分泌相互信号传导。除了如此处所示在神经炎症领域受到重视外，插入片段共培养系统还可用于回答与肿瘤再生、神经松阻症、细胞凋亡信号传导或任何其他具有旁分泌信号成分的主题有关的大量问题。
观看此视频后，您现在应该对插入片段共培养系统如何提供一种简单的方法来评估分泌型可溶性因子介导的变化有了很好的了解。我们希望让您相信这种插入共培养系统在没有细胞间接触的情况下研究多细胞旁分泌信号传导的巨大潜力。
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概述
本文描述了一种使用带有可渗透膜的插入件创建细胞共培养系统的方法。此设置允许在没有直接细胞-细胞接触的情况下研究分泌的可溶因子对不同细胞类型的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 共培养系统
- 旁分泌信号传导
背景
- 多细胞生物利用分泌的可溶因子进行通信。
- 旁分泌信号传导涉及各种细胞类型的反应。
- 共培养系统可以简化这些相互作用的研究。
- 插入件允许分离细胞类型，同时实现因子扩散。
研究目的
- 评估分泌的可溶因子对目标细胞类型的影响。
- 在受控环境中评估这些因子介导的变化。
- 促进收集两种细胞类型及其上清液以进行分析。
使用的方法
- 在插入件中播种一种细胞类型。
- 在多孔组织培养板中播种第二种细胞类型。
- 将插入件转移到含有第二种细胞类型的孔中。
- 收集两种细胞类型及其各自的上清液。
主要结果
- 该方法允许评估可溶因子对目标细胞的影响。
- 促进旁分泌信号传导机制的研究。
- 能够收集两种细胞类型的数据以供进一步分析。
- 提供了一种简单的共培养系统方法。
结论
- 共培养系统对研究细胞相互作用有效。
- 可以在没有细胞直接接触的情况下分析分泌的可溶因子。
- 该方法可以增强对多细胞生物中细胞通信的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Insert co-culture systems enable biopharma R&D to de-risk target validation by isolating paracrine signaling effects without confounding cell-cell contact. This approach supports mechanistic understanding of cytokine-mediated neuroinflammation and cytotoxic outcomes in neuronal models. The method provides quantitative, population-specific readouts that inform go/no-go decisions in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring secreted factor effects on target cell phenotypes.
- Operational Value: Enables bidirectional signaling assessment while preserving cell polarity and population-specific detection.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking microglial activation states to neuronal cytotoxicity thresholds.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream cytokine or compound screening in neuroinflammatory models.
- Operational Value: Standardizes soluble factor exchange via defined pore-size inserts, ensuring reproducible paracrine signaling assays.
- Scalability: Facilitates multiplexed condition testing (e.g., LPS dose-response) using identical insert-well configurations.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant neuroinflammation by quantifying microglial cytokine secretion and downstream neuronal LDH release.
- Operational Value: Provides continuity from discovery mechanism validation to preclinical risk assessment of neurotoxic compounds.
- Risk Mitigation: Enables mechanism-based go/no-go decisions by establishing causal links between soluble factors and cellular damage.
Pipeline & Workflow Integration
The insert co-culture method integrates into early discovery biology to validate targets, supports assay development for screening campaigns, and informs translational decisions through quantitative paracrine signaling readouts.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about microglial-derived soluble factors in neuronal dysfunction without direct contact confounders.
- Screening: Delivers standardized, quantitative cytokine and cytotoxicity outputs for compound or genetic perturbation evaluation.
- Analytics: Enables comparison of ELISA-measured cytokines (IL-6, TNF-α, IFN-γ) and LDH release across experimental conditions.
- Translational Research: Connects microglial activation states to neuronal viability outcomes, supporting biomarker-aligned risk assessment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying paracrine signaling in cancer, angiogenesis, differentiation, and neuroinflammation contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by isolating paracrine mechanisms from adhesion-dependent artifacts.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized insert seeding, transfer, and bubble removal procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of neuroinflammatory targets before costly in vivo studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions via dose-dependent cytokine and cytotoxicity correlations.
Implementation Considerations
- Requires aseptic technique expertise for insert handling and media exchange without membrane damage.
- Depends on compatible tissue culture plates and inserts with defined pore sizes (e.g., 0.4 μm PTFE) for factor diffusion.
- Necessitates standardized protocols for cell seeding density, activation timing, and co-culture duration across teams.
- Requires validation of air bubble removal and media equilibration to ensure consistent paracrine signaling.
- Limited to studying soluble factor effects; cannot assess contact-dependent signaling or extracellular matrix interactions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:54
Seeding of N9 Microglia in Inserts
3:47
Activation of N9 Microglia With Lipopolysaccharide
5:02
Co-Cultivation of Neuronal PC12 Cells With N9 Microglia
7:31
Results: Lipopolysaccharide-activated N9 Microglia Secrete Cytokines That Are Toxic to Neuronal PC12 Cells
9:48
Conclusion
