Name: 在细胞间接触缺失的两个蜂窝型的插入共培养系统的开发 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 学习使用插入式共培养系统研究旁分泌信号传导，通过可渗透膜分离两种细胞类型，实现可溶性分泌因子的扩散与细胞间无直接接触。该方法适用于评估细胞参数变化及分析细胞培养上清液。

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本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）向 MGM 提供的资助项目支持。JR 是 NSERC-Vanier 学生研究员。

注意：以下每个步骤均须在层流罩内按哺乳动物细胞培养要求的无菌条件下进行。此外，还需遵循最佳无菌细胞培养的一般准则。 例如，弃去吸头时应避免任何可能导致交叉污染的情况，在进行全量换液时尽量减少细胞暴露于空气中的时间，所有细胞悬液均需适当且轻柔地混匀以确保移液均匀等。此外，小室（inserts）属于需要特殊操作的一类塑料耗材。首先，操作小室时应避免触碰其脆弱的膜，该膜极易撕裂，可能因此危及实验结果。其次，不宜采用真空抽吸法去除细胞培养基，因其存在刺穿膜或使贴壁细胞脱落的风险。再者，小室在多孔组织培养板中为悬垂状态，因此在移动耗材或移液时需格外小心，以防贴壁细胞脱落。此外，当使用孔径较大的小室时，培养基可能渗过膜，因此需频繁监测液体水平。最后需注意，本方案专为贴壁细胞设计，若用于悬浮细胞，需进行少量修改。
1. 进行插入式共培养实验的一般指南
<ol>
	<li>在插件中接种细胞类型 #1
	<ol>
		<li>将插件从包装中取出。</li>
		<li>使用镊子夹住插件的最上缘，将其放入适当尺寸的空多孔组织培养板中。</li>
		<li>为促进贴壁细胞的附着和铺展，在接种前用细胞培养基对插件进行预处理。使用微量移液器将细胞培养基覆盖整个膜表面。 
		注意：根据需要对相应数量的插件进行此操作。</li>
		<li>盖上培养板盖子，在相同条件下（通常为 37°C，5-10% CO2）孵育至少 1 小时或过夜。</li>
		<li>插件预处理完成后，使用微量移液器吸除所有细胞培养基，并弃去废液。</li>
		<li>以与在多孔板中相同的方式，将细胞类型 #1 接种于新鲜细胞培养基中。使用微量移液器吸取适量细胞悬液，并将其加入插件中。 
		注意：根据需要准备相应数量的插件。</li>
		<li>接种完所有插件后，轻轻左右摇动培养板，再前后摇动，以使细胞均匀分布。避免做圆周运动，否则会导致细胞在插件中心聚集。</li>
		<li>盖上培养板盖子，并根据细胞培养要求进行孵育（通常为 37°C，5-10% CO2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在多孔组织培养板中接种细胞类型 #2
	<ol>
		<li>按照第 1 节所述方法，将细胞类型 #2 接种于新鲜细胞培养基中。</li>
		<li>根据所需插件数量准备相应数量的孔。参照步骤 1.1.7 的方式轻轻摇动培养板，确保细胞在孔内均匀分布。</li>
		<li>盖上培养板盖子，并在相同条件下（通常为 37°C，5-10% CO2）孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>更换插件中的培养基
	<ol>
		<li>使用微量移液器吸除含有细胞类型 #1 的插件中的部分或全部细胞培养基，并弃去废液。</li>
		<li>吸取适量新鲜细胞培养基，将移液器吸头轻轻靠在插件内壁，缓慢加入培养基。</li>
		<li>盖上培养板盖子，并参照步骤 1.1.4 的条件进行孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>更换多孔组织培养板中的培养基
	<ol>
		<li>使用微量移液器吸除含有细胞类型 #2 的孔中的部分或全部细胞培养基，并弃去废液。</li>
		<li>吸取适量新鲜细胞培养基，将移液器吸头靠在孔的内壁，缓慢加入培养基。</li>
		<li>盖上培养板盖子，并根据既定的细胞培养方案进行孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有细胞类型 #1 的插件转移至含有细胞类型 #2 的多孔组织培养板中。 
	注意：当两种细胞均达到适当的生长阶段时，执行此步骤。
	<ol>
		<li>在将插件转移至孔中之前，根据步骤 1.3 和 1.4 所述方法进行必要的培养基更换。 
		注意：此时应严格按照插件制造商的说明，在两个腔室中加入适当体积的培养基。</li>
		<li>使用镊子夹住含有细胞类型 #1 的插件的最上缘，轻轻将其放入含有细胞类型 #2 的相应孔中。</li>
		<li>转移完所有插件后，检查插件膜下方是否存在气泡。 
		注意：气泡会阻碍插件膜两侧的物质交换，可能危及整个实验。</li>
		<li>若存在气泡，使用镊子非常轻柔地将插件从孔中提起，再重新浸入细胞培养基中，气泡将消失。若气泡仍存在，可尝试以一定角度轻轻将插件斜向浸入培养基中。 
		注意：切勿敲击或搅动插件，以免导致贴壁细胞脱落。</li>
		<li>在清除所有气泡并确认两个腔室中培养基体积正确后，盖上培养板盖子并进行孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共培养系统中更换培养基 
	注意：尽管膜可允许插件与孔之间进行培养基交换，但由于仅靠扩散达到上下腔室平衡所需时间较长，因此需在两个腔室中分别更换培养基。
	<ol>
		<li>更换含有细胞类型 #1 的插件中的培养基，操作方法同步骤 1.3。</li>
		<li>更换含有细胞类型 #2 的孔中的培养基时，先将插件轻轻移至一侧，腾出足够空间以插入移液器吸头，然后按照步骤 1.4 的方法更换培养基。</li>
		<li>参照步骤 1.5.3 至 1.5.5 检查是否存在气泡并确认培养基体积。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 示例：检测脂多糖激活的N9小胶质细胞所分泌细胞因子对神经元PC12细胞的影响
注意：以下步骤是针对特定规格的烧瓶、培养板孔和培养皿设计的。然而，本方案可根据任何塑料器皿的尺寸进行调整。有关培养基及其成分，请参见材料表。
<ol>
	<li>在多孔组织培养板中接种并诱导PC12细胞分化
	<ol>
		<li>将常规PC12细胞培养基、PC12分化培养基和胰蛋白酶-EDTA置于37°C水浴中预热。</li>
		<li>使用来自75 cm2培养瓶、融合度为60-80%的PC12细胞。</li>
		<li>用15 mm巴斯德吸管，通过负压抽吸去除培养瓶中的全部培养基。</li>
		<li>用5 ml无菌磷酸盐缓冲液轻轻冲洗细胞单层，并用巴斯德吸管移除液体。此步骤中注意避免细胞脱落。</li>
		<li>向细胞单层加入3 ml胰蛋白酶-EDTA，于37°C孵育2-3分钟。</li>
		<li>在显微镜下确认所有细胞均已脱离。若仅有极少数细胞悬浮，可延长孵育时间，最长不超过5分钟。</li>
		<li>加入10 ml常规PC12细胞培养基以灭活胰蛋白酶-EDTA。</li>
		<li>用10 ml移液管轻轻吹打，确保大多数细胞从瓶底解离。避免在细胞悬液中产生气泡。</li>
		<li>用同一支10 ml移液管将细胞悬液转移至50 ml离心管中。</li>
		<li>以3,200 × g离心1分钟。</li>
		<li>用巴斯德吸管小心弃去上清液，注意不要扰动沉淀。</li>
		<li>用10 ml移液管加入10 ml常规PC12细胞培养基。 
		注：若沉淀异常小或大，可调整该体积。</li>
		<li>用同一支10 ml移液管吹打混匀沉淀。PC12细胞易发生聚集，因此至少需上下吹打20次。 
		注：尽管需要充分吹打，但仍应避免在细胞悬液中产生气泡。</li>
		<li>在1.5 ml离心管中，用台盼蓝对细胞悬液进行适当稀释。根据既定方案74使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
		<li>在另一个50 ml离心管中，用PC12分化培养基稀释细胞悬液，制备适合接种24孔板孔的稀释细胞悬液（按厂家说明书，30,000 ¢/cm2，每孔0.6 ml）。 
		注：24孔板必须事先按照既定方案75用胶原蛋白包被。</li>
		<li>使用微量移液器，每孔加入0.6 ml细胞悬液。</li>
		<li>所有孔接种完成后，轻轻摇动培养板，操作同步骤1.1.7）。</li>
		<li>为使PC12细胞充分分化，在进行共培养实验前，将24孔板置于37°C、5% CO2湿润环境中，用PC12分化培养基培养7-9天15,16。</li>
		<li>每隔一天更换培养基，移除一半液体，并补充等体积的新鲜PC12分化培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在插入式培养小室中接种N9小胶质细胞并用LPS处理
	<ol>
		<li>在进行共培养实验前一天，按照步骤1.1.1）至1.1.4）的操作，用常规N9细胞培养基预处理聚四氟乙烯（PTFE）0.4 µm孔径的插入式培养小室，以优化细胞贴附。</li>
		<li>将常规N9细胞培养基和胰蛋白酶-EDTA置于37°C水浴中预热。</li>
		<li>同时，在1.5 ml离心管中称取约10 mg LPS，以备后续使用。 
		注：LPS是一种强效的促炎性内毒素，需采取特殊安全防护措施，强烈建议佩戴护目镜、手套和颗粒物呼吸器。</li>
		<li>使用来自75 cm2培养瓶、融合度为80-90%的N9细胞。</li>
		<li>执行步骤2.1.3）至2.1.14），但始终使用常规N9细胞培养基而非常规PC12细胞培养基。另请注意，N9小胶质细胞的聚集程度低于PC12细胞，因此在步骤2.1.13）中可能需要较少的吹打次数。</li>
		<li>在另一个50 ml离心管中，用N9细胞培养基稀释细胞悬液，制备适合接种设计用于24孔板的插入式小室的稀释细胞悬液（按厂家说明书，60,000 ¢/cm2，每小室0.05 ml；膜表面积请参见厂家信息）。 
		注：这些插入式小室已由厂家预先包被胶原蛋白，有利于细胞贴附。</li>
		<li>使用微量移液器，每小室加入0.05 ml细胞悬液。</li>
		<li>所有小室接种完成后，轻轻摇动培养板，操作同步骤1.1.7）。</li>
		<li>使用N9处理培养基对LPS进行系列稀释，配制4 µg/ml、2 µg/ml和1 µg/ml&#160;的工作液。</li>
		<li>向一组插入式小室中加入0.05 ml 4 µg/ml工作液，使终浓度为2 µg/ml。</li>
		<li>对另外两组插入式小室，分别重复步骤2.2.10），加入其余两种工作液，使终浓度分别为1 µg/ml和0.5 µg/ml。</li>
		<li>将含插入式小室的培养板置于37°C、5% CO2湿润环境中孵育24小时，以实现LPS对N9小胶质细胞的激活，之后再进行共培养实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>神经元样PC12细胞与N9小胶质细胞的共培养
	<ol>
		<li>在PC12细胞分化7-9天后，将N9处理培养基和PC12处理培养基置于37°C水浴中预热，以激活经LPS孵育24小时后的N9小胶质细胞。</li>
		<li>对N9小胶质细胞进行完全换液，操作同步骤1.3），将每小室原有培养基全部更换为0.1 ml N9处理培养基。对每个插入式小室均需执行此操作。此步骤旨在彻底去除LPS残留，仅保留已激活的N9小胶质细胞。</li>
		<li>对神经元样PC12细胞进行完全换液，操作同步骤1.4）。将插入式小室转移至24孔板中，操作同步骤1.5）。将N9-PC12共培养体系在37°C、5% CO2湿润环境中孵育24小时或48小时。</li>
		<li>孵育24小时或48小时后，收集上清液和/或细胞，用于细胞毒性检测、酶联免疫吸附测定（ELISA）、Western blot或其他检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在任何插入式共培养系统实验中，最关键的步骤实际上在于选择合适的插入式培养小室。孔径大小和膜材料必须被充分考虑，同时不能忽视将要接种的细胞类型以及实验目的。例如，趋化性实验可能使用与细胞共培养相同的膜类型，以分析在无细胞-细胞直接接触条件下由分泌的可溶性因子诱导的细胞行为改变。然而，这两类实验需要不同的孔径大小：前者需要较大的孔径以允许细胞迁移，而后者则需要较小的孔径以阻止细胞迁移和细胞间的直接接触。在评估由分泌的可溶性因子介导的细胞变化（无细胞-细胞接触）时，通常选用0.4 µm或3 µm的孔径，因为这些孔径允许大分子（如蛋白质）通过，但可阻止大多数细胞穿过。膜材料的选择主要取决于细胞类型以及细胞培养结束后拟采用的技术手段。简而言之，PET膜透明度高，有利于良好的细胞观察，但其未包被胶原蛋白，这可能对需要支持物经过处理才能贴附的贴壁细胞造成问题；此外，PET膜对固定剂具有最佳的化学耐受性，结合其优良的光学特性，使其成为组织学研究的理想选择。另一方面，PC膜呈半透明状，细胞可视性较差，且同样未包被胶原蛋白；但其具有最高的孔密度以及最丰富的孔径规格可供选择。最后，PTFE膜在湿润状态下透明，但在显微镜下仅能观察到细胞轮廓；其主要优势在于已包...

组织、器官或系统的研究 体外 旨在简化构成多细胞生物的多种细胞亚型之间存在的极为复杂的相互关系。事实上， 体外 研究使得深入理解单细胞群体成为可能。进行此类研究有两个主要优势。 体外 实验具有两个优势：1）减少细胞间的相互作用；2）能够便捷地调控细胞所处的微环境。因此，这两个优势使得科学家能够预测特定细胞类型的行为 体内，从而能够在整体生物体水平上调控外部因素的影响结果。从这一意义上讲， 体外 细胞培养常常作为连接基础生命科学与应用生命科学的桥梁。然而，进行细胞培养也存在若干缺点 体外，其中最重要的一点是，所观察到的表型在生理相关性方面可能存在一定局限性。事实上，当单一细胞类型在培养容器中生长时，该培养体系在不同程度上失去了与其他细胞类型的细胞间连接，失去了对原组织及机体体液环境的贡献，也失去了在组织中维持其特定三维结构（有时对细胞功能至关重要）的锚定位点。
细胞间关系的问题已通过混合培养技术的发展得到解决。该方法将两种或多种细胞群体共同培养于同一培养容器中。然而，这种混合培养存在重要缺陷。一方面，某些细胞亚型在来源组织中并不直接发生物理相互作用，而是完全依赖由分泌的可溶性因子和邻近受体介导的旁分泌信号进行通讯。许多依赖邻近细胞因子信号传导的炎症过程即属于此类情况。在混合培养中，细胞间的物理接触不可避免，导致无法在排除细胞间直接接触的情况下研究旁分泌通讯，而这些接触可能引发结果偏差。另一方面，若不采用剧烈的分离技术，就难以从混合细胞群体中获得针对特定细胞类型的明确解释，但此类分离手段本身又可能显著影响实验结果。
为了解决这些重要问题，研究人员开发了使用条件培养基的技术，该技术可实现细胞的区室化共培养，并用于研究旁分泌信号传导。该方法需要将一种细胞类型的上清液（即条件培养基）转移至含有另一群细胞的培养孔中。然而，这一方法存在一个重要缺陷：寿命较短的分子在条件培养基中无法稳定存在足够长的时间，因而难以有效转移至第二群细胞所在的培养孔中。此外，即使寿命较长的分子也会因扩散作用而随时间推移被显著稀释。更进一步，两群细胞之间仅能实现单向旁分泌通信，而无法进行活跃的双向交互。这导致缺乏在重建真实存在的多细胞相互关系中至关重要的反馈信号。 体内.
因此，出于更准确模拟原始状态的需求 体内 条件在 体外 细胞环境方面，多年来细胞培养技术取得了多项进展。其中最重要的进展之一是使用带有微孔膜的可渗透支撑物来实现细胞培养的区室化，该方法最早由 Grobstein 于 1953 年首次采用1此类可渗透性支持物经过多年改进，已可适配多种细胞类型，并应用于多种不同实验场景。如今，这些支持物以中空插入式装置的形式存在，设计用于放置在多孔组织培养板的孔内或圆形培养皿中。在共培养系统中，插入装置内含一种细胞类型，而孔板或培养皿内则含有另一群细胞，从而可研究两种不同细胞群体对其体液环境的相互影响。图1）。因此，细胞极性（基底外侧与顶端分泌或信号接收）得以保持，从而使插入式共培养系统相较于混合培养和条件培养基技术具有重要优势。目前可提供多种类型的膜材料，最常见的是聚酯（PET）、聚碳酸酯（PC）或胶原包被的聚四氟乙烯（PTFE），其孔径大小从0.4 µm到12.0 µm不等。这些不同材料和孔径规格的组合提供了具有多种特性的插入式培养装置，其特性涉及光学性质、膜厚度以及细胞黏附能力，在以下应用中具有不同程度的实用性，包括但不限于： 
-通过可渗透膜的趋化性实验研究细胞分化、胚胎发育、肿瘤转移和伤口修复； 
- 通过评估药物在可渗透支持物上培养的上皮或内皮单层中的转运情况，以评价药物渗透性； 
- 进行细胞共培养，以分析在无细胞间直接接触条件下由分泌的可溶性因子诱导的细胞行为改变。
本文旨在描述实现上述第三项功能的一般方法学指南，即利用插入式共培养系统，在无细胞间直接接触的条件下评估由分泌型可溶性因子介导的细胞变化。多个不同研究领域均采用插入式共培养系统，以探讨分泌型可溶性因子对细胞群体作用的相关问题。事实上，以旁分泌方式在多个层面调控细胞行为的信号通路普遍存在于各类组织与系统中，这使得插入式共培养系统成为推动这些领域进展不可或缺的工具。相反，插入式装置也可用于验证信号转导是否依赖于直接的细胞间接触，而非通过可溶性分泌因子实现。插入装置最重要的应用之一是在炎症研究2-14中评估分泌性细胞因子对各类免疫相关细胞的作用。特别是在中枢神经系统（CNS）炎症研究中，插入式共培养方法发挥了重要作用，有助于更清晰地界定神经元与小胶质细胞在驱动神经炎症过程中的不同旁分泌功能15-21。这些系统还被用于研究依赖于抑制或减少促炎因子分泌能力的分子所具有的抗炎潜力22-26。在癌症相关研究27-31中，尤其是关于肿瘤发生过程中血管生成32-34和炎症机制35-42的研究，也广泛受益于插入式共培养系统。此外，可溶性因子在细胞分化驱动过程中具有关键作用，已有大量研究利用插入装置探讨该领域的具体问题43-50。在中枢神经系统中，由于神经组织自我更新能力极为有限，神经营养与神经保护的研究至关重要，而干细胞在共培养系统中的应用为此提供了重要支持51-56。此外，插入装置还被应用于肾脏病学57,58、血管内皮相互作用与血管生成59-62、凋亡信号传导63-65、肥胖与代谢综合征中的炎症22,23,66-67、内耳毛细胞保护68,69，甚至真菌毒力70,71和寄生虫学72,73等广泛领域。
本文提供了建立实验的一般方法学指南，旨在利用插入式共培养系统评估由分泌的可溶性因子介导的细胞变化。特别地，我们将重点关注神经细胞的共培养及其在研究神经炎症过程中的应用。鉴于插入式培养系统可实现的实验范围极为广泛，无法涵盖该细胞培养技术的各个方面。作为示例，本文将详细描述一种具体实验方案，用于检测脂多糖（LPS）激活的小胶质细胞N9所分泌的细胞因子对神经元PC12细胞的影响，从而为插入式共培养方法提供具体而清晰的理解。

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>Sigma</td><td>R8755</td><td>37℃预热 &amp;deg;使用前将水浴预热至 C</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;Ham's F-12 营养混合物</td><td>Sigma</td><td>D6421</td><td>37℃预热 &amp;deg;使用前需在 C 水浴中预热，并添加 0.365 g/L L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>马血清</td><td>ATCC</td><td>30-2040</td><td>37℃预热 &amp;deg;使用前将水浴锅预热至 C</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>多细胞</td><td>80350</td><td>37℃预热 &amp;deg;使用前将水浴锅预热至 C</td></tr><tr><td>来自小鼠下颌下腺的神经生长因子-7S</td><td>Sigma</td><td>N0513</td><td>用含有0.1%的缓冲盐溶液或组织培养基重新溶解冻干粉&amp;ndash;1.0% 牛血清白蛋白或 1–10% 血清</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>37℃预热 &amp;deg;使用前将水浴锅预热至 C</td></tr><tr><td>脂多糖来自&amp;nbsp;大肠杆菌&amp;nbsp;055:B5</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>用于24孔板的细胞培养小室</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td>0.4 &amp;mu;微米级孔隙</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>TrueLine</td><td>TR5002</td><td>使用前用胶原蛋白包被</td></tr><tr><td>常规PC12细胞培养基</td><td></td><td></td><td>常规N9细胞培养基</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 85% RPMI 培养基</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 90% DMEM-F12 培养基</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 10% 热灭活马血清</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 10% 热灭活马血清</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 5% 热灭活胎牛血清</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC12分化培养基</td><td></td><td></td><td>N9 处理培养基</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 99% RPMI 培养基</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 99% DMEM-F12 培养基</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1% 热灭活胎牛血清</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1% 热灭活胎牛血清</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 50 ng/mL 神经生长因子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC12处理培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 99% RPMI 培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1% 热灭活胎牛血清</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种非细胞接触式双细胞共培养插件系统的开发

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

分泌型可溶性因子在调控细胞反应中的作用是各类组织和系统研究中反复出现的主题。为了简化多细胞生物中多种细胞亚型之间极为复杂的关系，研究人员已开发出体外（in vitro）技术，以深入理解单一细胞群体的行为。其中一种技术采用带有通透性膜的插入式培养小室，使分泌的可溶性因子得以扩散。因此，可将生长在插入小室中的一群细胞与另一类细胞共同培养于同一孔板或培养皿中，从而在无细胞间直接接触的条件下，评估旁分泌信号传导所引发的细胞变化。此类插入式共培养系统相较于其他共培养技术具有多种优势，包括支持双向信号传递、维持细胞极性，以及能够特异性检测特定细胞群体的改变。除了广泛应用于炎症、癌症、血管生成和分化研究外，这类共培养系统在研究中枢神经系统中不同细胞亚型之间复杂相互作用方面尤为重要，特别是在神经炎症的背景下。本文旨在提供通用的方法学指导，以建立基于插入式共培养系统来评估分泌型可溶性因子介导的细胞变化的实验。此外，还将详细描述一项具体实验方案：检测脂多糖激活的N9小胶质细胞所分泌的细胞因子对神经元样PC12细胞产生的神经炎症效应，从而为插入式共培养技术提供具体而清晰的理解。

使用插入式共培养系统在研究展示中枢神经系统（CNS）不同细胞参与者之间旁分泌关系的神经炎症过程时尤为关键。中枢神经系统的免疫功能主要由一类称为小胶质细胞的常驻细胞完成，这些细胞在其静息的分支状状态下持续监测周围环境（图2A），并能够感知可能破坏神经元正常功能所依赖的极为重要的稳态的干扰76-78。小胶质细胞的活化表现为细胞形态转变为阿米巴样（图2B）以及细胞数量增加（称为小胶质细胞增生，图3），随后释放促炎性介质（如细胞因子），这是神经炎症的核心特征79。细胞因子的释放旨在保护神经元免受有害攻击，且受到严密调控。然而，当神经炎症脱离这种严格控制时，便会表现出破坏性，可能对中枢神经系统造成严重损伤。由于神经组织的再生能力极为有限，中枢神经系统尤其容易受到此类自我破坏性炎症反应的影响。研究神经元与小胶质细胞之间存在的相互作用，对于阐明神经炎症的潜在机制至关重要。与混合培养不同，插入式共培养系统使研究者能够明确识别出哪一类细胞群体产生...

在多细胞生物中，分泌的可溶性因子通过旁分泌信号传导，引发不同类型细胞的反应。插入式共培养系统提供了一种简单的方法，可在无细胞间直接接触的情况下评估分泌的可溶性因子所介导的变化。

分泌性可溶因子在调控细胞反应中的作用是所有组织和系统研究中的一个常见主题。为了……

本实验的总体目标是利用带有可渗透膜的插入式培养小室，建立两种细胞类型的细胞共培养体系，从而允许分泌的可溶性因子自由扩散。该过程通过一系列精细操作实现，即将含有第一种细胞类型的插入式培养小室放置于含有第二种细胞类型的多孔组织培养板中。我们首先在插入式培养小室内接种第一种细胞，在多孔组织培养板中接种第二种细胞。第二步是将插入物转移至含有第二种细胞类型的孔板孔中。最终，这种方法能够分别收获两种细胞类型及其相应的上清液。因此，可以评估分泌的可溶性因子对目标细胞类型的影响。在多细胞生物中，分泌的可溶性因子通过旁分泌信号传导，引发不同类型细胞产生反应。因此，插入式共培养系统的优势在于能够提供一种独特的方法，在无细胞间直接接触的条件下，评估由分泌的可溶性因子介导的细胞参数变化。与其他共培养技术相比，插入式共培养系统具有多种优势，例如：一、实现定向信号传导；二、维持细胞极性；三、可对特定细胞群进行细胞变化的特异性检测。本文将详细介绍一种用于评估脂多糖激活的N9小胶质细胞所分泌细胞因子对神经元PC12细胞毒性的特定实验方案，从而具体阐明插入式共培养技术的操作方法。首先，打开24孔组织培养板及其0.4微米孔径聚四氟乙烯插入式培养小室的包装，然后使用无菌镊子夹住插入小室的上缘边缘，将其放入组织培养板的空孔中。接下来，用常规的 N9 培养基填充小室，直至膜表面完全被覆盖。将小室孵育至少一小时，或过夜，以增强细胞的贴附能力。待小室准备就绪后，使用常规 N9 培养基将 N9 小胶质细胞在 80% 至 90% 汇合度时进行传代，获得细胞悬液，用于接种小室。然后，从插入式培养小室中移除常规培养基，注意不要用微量移液器吸头刺穿膜。接下来，根据插入式培养小室制造商的说明书，或以每平方厘米60,000个细胞的密度，向每个插入式培养小室中加入50微升细胞悬液进行接种。在分配细胞悬液时，应通过偶尔颠倒试管的方式确保细胞悬液保持均匀。当所有插入物均接种完毕后，轻轻前后摇动培养板，然后再左右摇动，以使细胞均匀分布。避免做环形晃动，以免细胞在插入物的中央聚集。随后，将含有插入物的培养板孵育24小时，再进行N9小胶质细胞的激活。首先称取10毫克脂多糖，并将其储存于1.5毫升离心管中以备后续使用。由于脂多糖是一种强效的促炎性内毒素，需采取特殊安全防护措施，强烈建议佩戴护目镜、手套和颗粒物呼吸器。随后，使用预热的N9处理培养基对脂多糖进行一系列梯度稀释，以获得4、2和1微克/毫升的工作溶液。最后，从插入式培养小室中移除一半的培养基，注意不要扰动细胞。然后，轻轻向插入式培养小室中加入 25 微升脂多糖工作液，使其最终稀释浓度分别为每毫升 2、1 或 0.5 微克。继续孵育 24 小时后，再进行共培养实验。此步骤需要使用已接种于每平方厘米30,000个细胞的PC12细胞、分化为中间神经元的细胞，以及如前文所述经脂多糖激活24小时的N9小胶质细胞。首先，轻柔地移除插入式培养小室中的全部培养基，并替换为50微升新鲜且预温的N9处理培养基。此操作旨在彻底去除脂多糖残留，仅保留已激活的N9小胶质细胞。请注意，插入物在组织培养板的孔中是松动的，如果移液枪头过度紧贴孔壁，可能会导致其移动。为避免细胞因长时间暴露于空气中而干燥，此步骤应逐个插入物进行操作。随后，完全移除神经元PC12细胞的培养基，并更换为0.6毫升新鲜且预热的PC12处理培养基。一次只操作一个，以确保细胞不会干燥。使用镊子夹住插入物的最上缘，轻轻将其放入含有神经元型PC12细胞的孔中。当所有插入物转移完毕后，检查插入物膜下是否存在气泡。气泡会阻碍插入物膜上的任何物质交换，并可能危及整个实验。使用镊子非常轻柔地将插入物从孔中提起并重新放回细胞培养基中，以此去除气泡，此操作应能消除大部分气泡。然而，对于顽固性气泡，可尝试以一定角度将插入物轻轻斜向浸入细胞培养基中。请勿敲击或搅动小室，因为这容易导致贴壁细胞脱落。随后检查小室和孔内培养基的体积，两个区域的液面应大致处于相同高度。待所有气泡完全去除且培养基体积合适后，将培养板放入培养箱孵育。随后可收集细胞、培养基或两者，以检测N9小胶质细胞与神经元样PC12细胞之间旁分泌信号传导的作用。对下层隔室的细胞培养基进行酶联免疫吸附试验，以定量促炎性细胞因子。结果显示，在激活期24小时后，用每毫升2微克脂多糖处理的N9小胶质细胞所分泌的促炎性细胞因子（如白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ）显著高于未经处理的小胶质细胞。此外，用每毫升一微克脂多糖处理的N9小胶质细胞在24小时后显著分泌更多的干扰素γ，而白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α的细胞培养基水平则需48小时才出现显著升高。相比之下，在激活后的24小时和48小时，每毫升0.5微克的处理条件均未能增强N9小胶质细胞的细胞因子表达。此外，每毫升两微克组在24小时的数据表明出现了小胶质细胞增生，即小胶质细胞数量增加。然而，直到48小时后，细胞数量才显著增加。最后，为了评估小胶质细胞活化导致细胞因子分泌增加及小胶质细胞增生的后果，检测了共培养的神经元PC12细胞的细胞毒性。通过测定受损细胞释放的胞外乳酸脱氢酶（Extracellular Lactate Dehydrogenase）水平，发现随着N9细胞上脂多糖浓度的增加，神经元PC12细胞的死亡率也随之升高。因此，这些结果表明，分泌的可溶性因子能够穿过共培养小室的膜，并在无细胞间直接接触的情况下对神经元PC12细胞造成细胞毒性损伤。尽管此处仅展示了一种共培养小室的实验情景，但该技术具有很高的灵活性。在本方案中，一种细胞类型首先经过预处理，以减少某些可溶性因子的分泌；随后将小室转移至培养孔中，从而影响第二类细胞的行为。然而，可以将两种细胞类型在共培养体系中共同孵育，以检测其中一种或两种细胞群体对后续处理的敏感性增加或耐受性增强。例如，该技术可简单地利用两种细胞群体在无任何处理条件下共同孵育，以评估基础状态下的旁分泌相互信号传导。除了如本研究中所展示的在神经炎症领域具有重要价值外，插入式共培养系统还可用于回答涉及肿瘤再生、神经腊样病变（neurolathyrisma）、细胞凋亡信号传导，或任何其他含有旁分泌信号成分的广泛科学问题。观看本视频后，您现在应该对插入式共培养系统如何提供一种简单方法来评估分泌的可溶性因子所介导的变化有了深入理解。我们希望已使您认识到，在无细胞间直接接触的情况下，这种插入式共培养系统在多细胞旁分泌信号研究中具有很高的应用潜力。

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生物学

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