Name: 使用电动和一维和二维文化磁场神经元的外部激励 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学习使用电场和磁场刺激一维和二维神经元培养物的方法，测量神经兴奋参数如chronaxie和rheobase，比较不同刺激方式对神经元的影响，为脑疾病诊断和治疗提供重要见解。

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作者感谢 Ofer Feinerman、Fred Wolf、Menahem Segal、Andreas Neef 和 Eitan Reuveny 在讨论中提供的宝贵意见。作者感谢 Ilan Breskin 和 Jordi Soriano 在技术早期版本开发中的贡献。作者感谢 Tsvi Tlusty 和 Jean-Pierre Eckmann 在理论概念方面提供的帮助。本研究得到了德国马普学会（Minerva Foundation）、以色列科学与技术部、以色列科学基金会（资助号 1320/09）以及美国-以色列双边科学基金会（资助号 2008331）的支持。

伦理声明：涉及动物操作的实验程序均依照以色列魏茨曼科学研究所机构动物护理与使用委员会（IACUC）的指南及相应的以色列法律进行。魏茨曼研究所已获得国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证。本研究经魏茨曼研究所机构动物护理与使用委员会批准，实验对象为海马神经元。
1. 二维（2D）和一维（1D）海马神经元培养的制备
<ol>
	<li>2D培养用盖玻片的制备
	<ol>
		<li>制备铺板培养基（PM），其成分为：0.9 mL 最小必需培养基（MEM）+3G、0.05 mL 胎牛血清（FCS）、0.05 mL 热灭活马血清（HI HS）以及 1 µL B27添加剂。注意：MEM+3G每500 mL MEM 1×中含1 mL庆大霉素和5 mL 100×稳定型L-谷氨酰胺（参见 材料/试剂清单) 和 5 mL 60% D-(+)-葡萄糖。</li>
		<li>制备硼酸盐缓冲液，成分为：1.9 g 硼砂（十水合四硼酸钠）溶于 200 mL 双蒸水（DDW）中（混合于 60 °C) 和 1.24 g 硼酸溶于 200 mL DDW 中，用 1 M HCl 将终溶液滴定至 pH 8.5。注意：终溶液为 400 mL 0.1 M 硼酸盐缓冲液。</li>
		<li>将玻璃盖玻片浸入65%硝酸中2小时。用双蒸水（DDW）冲洗三次，再用绝对分析纯乙醇（ABS AR）冲洗三次。</li>
		<li>将每个盖玻片在本生灯火焰上快速通过两到三次，每次持续1 - 2秒，随后置于含有1 mL多聚-L-赖氨酸0.01%溶液（用硼酸盐缓冲液（0.1 M，pH 8.4）按1:5稀释）的24孔板中，于室温孵育过夜。然后用去离子水（DDW）清洗盖玻片三次，并在每个孔中加入1 mL PM，置于标准培养条件下 37 °C，5% CO2 孵育器中孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>一维培养用盖玻片的制备
	<ol>
		<li>将玻璃盖玻片浸入碱性食人鱼溶液中进行清洗，该溶液由75 mL去离子水、25 mL 25%氨溶液和25 mL 30%过氧化氢组成。将含有玻璃盖玻片的溶液置于加热板上，温度约为 50 °C 孵育30分钟，然后用氮气吹干玻璃盖玻片。</li>
		<li>先使用蒸镀或溅射沉积法，在盖玻片上覆盖一层6 Å厚的高纯铬膜（99.999%），再覆盖一层30 Å厚的高纯金膜（99.999%）。
		<ol>
			<li>为实现0.05–1 Å/s的溅射速率，使用配备两束电子束、抽速为260 l/s的真空系统以及2英寸和4英寸靶材的溅射设备。采用转速可在0–100转/分钟（RPM）范围内调节的旋转样品台。使用0–750瓦的直流（DC）溅射功率。</li>
			<li>以 30 rpm 的转速旋转，并通入 99.999% 的氩气，使腔室内气压达到 10 mTorr 以产生等离子体。</li>
			<li>以40 W直流溅射功率操作铬溅射枪的电源，得到约0.12 Å/s的镀膜速率；以10 W直流溅射功率操作金溅射枪的电源，得到约0.28 Å/s的镀膜速率。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将0.1 g 1-十八烷硫醇溶于100 mL ABS AR级乙醇中，超声处理30 min。将镀有Cr-Au的盖玻片置于该溶液中2 h，随后用ABS AR级乙醇清洗，并用氮气吹干。</li>
		<li>配制 100 mL 的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）与 3.5 g 三嵌段共聚物的溶液（见 材料/试剂表) 在600 - 700 rpm条件下搅拌1 - 2小时。将盖玻片置于该溶液中1小时。用氮气吹干盖玻片。</li>
		<li>通过刮擦抗生物污染层，机械刻蚀出所需的图案22使用绘图仪进行操作，将绘图笔替换为刻蚀针。通过刻蚀针在金属层上刮擦出图案，直至暴露下方的玻璃基底。通过计算机控制该过程，以实现所需图案的重复制备。此方法所形成的图案如图所示。 图2 和 图3.</li>
		<li>制备100 mL D-PBS溶液，加入3.5 g三嵌段共聚物，形成生物相容性涂层， 35.7 µL/mL 纤连蛋白和 29 µl/mL 层粘连蛋白
		<ol>
			<li>将盖玻片用紫外光灭菌至少10分钟。将盖玻片在制备好的生物相容性溶液中孵育过夜。 
			注意：生物相容层仅在上一步中已将生物排斥层蚀刻去除的区域形成。</li>
			<li>次日用 P-DBS 洗涤盖玻片两次。将盖玻片在 PM 中孵育过夜。盖玻片现可用于细胞接种。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照先前已广泛发表的标准操作程序进行解剖23,24.
	<ol>
		<li>简而言之，从小鼠胚胎（通常在E17天）或大鼠胚胎（通常在E19天）中分离海马体或皮层组织23,24.</li>
		<li>先在木瓜蛋白酶溶液中消化细胞 20 - 30 分钟，随后进行机械吹打24 使用尖端经过火焰抛光的玻璃移液管。 
		注意：如果细胞来自基因修饰小鼠，则每个胚胎的组织在整个过程中应分别保存在独立的1.5 mL塑料管中。</li>
		<li>用台盼蓝染色法在接种前对细胞进行计数。 
		注意：对于转基因动物，应针对每个胚胎分别进行计数。</li>
		<li>对于二维培养，每孔接种750,000个鼠神经元和850,000个大鼠神经元。对于一维培养，每孔接种650,000个细胞。接种后立即轻轻摇动培养板，以确保盖玻片表面细胞分布均匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>神经元培养物的维持
	<ol>
		<li>制备更换培养基（CM），其成分为（每毫升）：0.9 mL MEM+3G，0.1 mL HI HS， 10 µL 5-氟-2′-脱氧尿苷（FUDR）与尿苷 100 倍浓度混合液</li>
		<li>配制终末培养基（FM），每毫升成分为：0.9 mL MEM+3G 和 0.1 mL HI HS。</li>
		<li>4天后，用1-1.5 mL CM替换PM 体外 （体外培养天数，DIV）。在培养第6天（6 DIV）时，更换50%的条件培养基（CM）为新鲜CM。在第8天（DIV 8），将培养基更换为1.5 mL完全培养基（FM），之后每2天更换50%的FM。约一周后，出现自发的同步化电活动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用荧光染料对神经元培养物中的自发或诱发活动进行成像
	<ol>
		<li>配制溶液 50 µg 钙敏感荧光染料（参见 材料/试剂清单) 在 50 µL DMSO（二甲基亚砜）。</li>
		<li>配制细胞外记录液（EM），其中含有（单位：mM）10 HEPES、4 KCl、2 CaCl₂2，1 MgCl2139 NaCl, 10 D-葡萄糖, 45 蔗糖（pH 7.4）。</li>
		<li>在 2 mL EM 中孵育神经元培养物 8 µL 钙敏感荧光染料溶液孵育1小时。避光并轻轻旋转，以确保染料均匀分布至细胞。</li>
		<li>成像前用新鲜的 EM 溶液替换。荧光成像在下文中展示 图 4.</li>
		<li>使用相机和软件在荧光显微镜下进行钙荧光成像（激发峰位于488 nm，发射峰位于520 nm），该软件可对显微镜视野内任意感兴趣区域（ROI）的荧光强度进行定量分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 培养物的电刺激
注意：电刺激的基本设置如图1所示。将培养约14天的神经元细胞的盖玻片置于培养皿中，并放置在荧光显微镜下。通过钙离子敏感性染料对神经元的电活动进行成像，同时通过位于培养区域外侧的两对浴电极施加电压。电极由信号发生器驱动，其输出信号经双通道放大器放大。相较于更常用的电流控制，推荐使用电压控制25,26，因为可直接确定电场矢量，从而实现简单的矢量叠加与组合。但这需要仔细检查电场的均匀性，在电压控制条件下可对整个样品进行均匀性检测。使用电压控制时，应注意避免接地回路，并应验证电场的均一性（见下文2.2节）。
<ol>
	<li>使用一对平行电极丝进行均匀电场的电刺激。
	<ol>
		<li>使用厚度约为 0.005'' 的铂电极127 µm）。使用13 mm盖玻片时，确保两个电极之间的距离约为11 mm，并将电极置于培养物上方1 mm处。 
		注意：为了制作电极架（图5A 和 6A使用聚四氟乙烯（PTFE）材料。在PTFE上钻出细小孔洞以插入电极。装置的高度应高于细胞外溶液，确保电极暴露的顶端部分不会与溶液接触。为实现绝缘，需在电极引线可能暴露的任何部分使用环氧树脂胶密封。</li>
		<li>使用占空比为50%的方波脉冲，且不含直流分量，以避免发生电解。调节脉冲持续时间在 10 µs 以及4毫秒，以实现有效刺激且不灼伤培养物。确保振幅在±22 V左右（参见 图5方波脉冲可通过与电极并联连接的示波器观察到。 
		注意：为便于编程任意所需波形，建议使用商用波形编辑软件（参见 材料清单）。在图形界面中输入所需的波形，并将其发送至波形发生器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用探针电极检测电场均匀性。采用至少1 mm × 1 mm的网格，使探针可在电极间区域移动，并测量电势。
	<ol>
		<li>测量电势。使用 <img alt="电场梯度的公式；偏导数；用于科研与物理的方程。" src="/files/ftp_upload/54357/54357equation1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 1"> 用于计算电场。使用其中一个电极作为参考电极。通过改变脉冲持续时间来测量电场 100 µs 至 4 毫秒（参见 图 5B 例如 100 µs 脉冲持续时间）以验证在刺激持续时间范围内电场的均匀性。 
		注意：参见 图5D 脉冲持续时间为1 ms时测得的电场均匀性示例。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用两对相互垂直的浴槽电极以产生更复杂的电场形状，并能够使电场朝向不同方向（参见 图 6B将使用带有两对电极的装置，并在两台独立的示波器上分别观察每对电极上的信号。
	<ol>
		<li>将电极置于培养物上方 1 mm 处，电极间距为 10 - 11 mm。确保两对电极均处于悬浮状态（无接地连接），并通过测量任意电极对之间的电阻，确认电极之间不存在共用接地或短路。验证所有连接电极的设备（如示波器、放大器、信号发生器） 等等。) 通过检查所有设备是否均处于浮置状态，并确认没有任何参比电极接触接地设备，来判断其相对于地面是否浮置。</li>
		<li>要改变电场方向，需调节施加到两对电极上的电压幅值的相对大小（参见 图7A例如，对于 0° 在与图案垂直的电极对上使用 ±22 V，另一电极使用 0 V。对于 45°，对两对电极均使用 ±15.6 V 电压，无相位延迟，振幅矢量和为 15.62+15.62=222.</li>
		<li>施加旋转电场时，将一个正弦电压脉冲波形和一个余弦电压脉冲波形分别施加于两对电极，以产生固定振幅的旋转电场（参见 图6B). 
		注意：如图所示，可观察到 图6B当一个电极使用一个周期的正弦波（±22 V），另一个电极使用一个周期的余弦波（±22 V）时，其矢量和形成一个旋转电场，该电场的周期与正弦波和余弦波相同，幅度为±22 V。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为测量并计算神经元培养物中轴突的时值与基强度，并与同一培养物中的树突进行比较，请执行以下步骤。
	<ol>
		<li>使用钙离子敏感性荧光染料进行钙成像，具体方法如所述 材料/试剂表 以及在1.5中，采用薄层（170 µm），长线（10 mm）。将向培养物中加入钙离子敏感性染料，并孵育45分钟。随后用新鲜的记录液置换染料以进行清洗。</li>
		<li>断开神经网络，以获得神经元对电刺激直接反应的群体统计结果，排除突触传递的影响。为此，应用以下组合： 40 µM 荷包牡丹碱（bicuculline），可阻断γ-氨基丁酸A型（GABA）的抑制作用A）受体， 10 µM 6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮（CNQX）以阻断α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA）受体和海人藻酸受体 20 µM (2R)-氨基-5-磷酸戊酸（APV），可阻断N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体。阻断剂将被加入记录液中。</li>
		<li>施加一个方波脉冲，具体如 2.1 和 2.3 所述，改变脉冲之间的时间间隔 100 µs 以及4毫秒。该信号可在示波器上观察到。</li>
		<li>使用配备图像采集程序（见1.5）的荧光显微镜，监测多个感兴趣区域（ROI）内钙瞬变的强度，每个区域包含数百个神经元。采用高灵敏度EMCCD相机（见材料列表）进行图像采集，其成像速率至少达到每秒20帧。光强度的变化与被刺激的神经元数量成正比。根据光强度的相对变化，估算被刺激神经元的比例。</li>
		<li>对于每个脉冲持续时间（100 µs 至4毫秒），从观察不到强度变化的电压（几伏特）开始，逐步改变施加在电极上的电压幅值，直至因外加电压引起的强度变化达到饱和（最高达±22 V）。 
		注意：强度变化将呈累积高斯分布5 针对每次电压脉冲持续时间，刺激所施加电压的情况。</li>
		<li>对每个持续时间下的强度与施加电压关系拟合累积高斯分布，并从该拟合中提取高斯均值。 
		注：该均值为神经元产生反应的代表性电压。</li>
		<li>在此过程结束时，获得每个刺激持续时间下神经元响应的平均电压。利用这些持续时间与强度的配对数据绘制强度-持续时间曲线（参见 图7).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 培养物的磁刺激
注意：磁刺激基本装置如图2所示。右上方为用于成像神经元中钙敏感染料的倒置荧光显微镜。磁线圈（蓝色圆圈）同心地置于神经元环形培养物（蓝色轮廓）上方约5 mm处。位于培养皿边缘的探测线圈（红色圆圈）用于监测磁脉冲诱导的电压。左上方显示了磁刺激器（MS）线圈在电容器电压负载为5,000 kV时，由探测线圈积分得到的实测动力学曲线。绿色曲线表示诱导电场（按14 mm环半径计算），蓝色曲线表示磁场。下方为神经元培养物的图像。左下角为24 mm盖玻片上图案化结构的明场图像，白色区域为神经元。所拍摄的图案由不同半径的同心环形培养物组成。右下角为环形结构局部区域的放大图像，显示单个神经元。作为比例参考，环的宽度约为200 µm。
<ol>
	<li>将神经元培养在环形图案（如1.2.5节所述蚀刻而成）中，用于一维培养刺激。使用钙离子敏感性荧光染料进行钙成像（如1.5节所述），并在薄（170 µm）、长（10 mm）的线性图案化一维培养上进行。
	<ol>
		<li>使用一个环形磁线圈，并将培养皿置于线圈下方约5 mm处，且与线圈同心。使用自制线圈，其内径约为30 mm（外径46 mm），电感为 L = 90 mH，由自制或商用磁刺激器（MS）驱动，最大电压为5 kV。</li>
		<li>通过高电流高电压开关，将高电压和大电流放电至导电线圈，以对神经元培养物进行磁刺激。磁刺激器（MS）可按照文献21所述方式构建，使用容量约为100 mF的大电容器，以获得1–5 kV的高电压。或者使用市售的MS（见材料/试剂表）。 
		注意：使用厚度为0.254 mm、宽度为6.35 mm的聚酯涂层矩形铜线制作自制线圈21。将导线绕制在定制框架上，用玻璃纤维绝缘并用环氧树脂封装（见材料/试剂表）。或者使用市售线圈（见材料/试剂表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用旋转磁场刺激二维培养物。</li>
	<li>现在，使用旋转磁场刺激二维培养物。在培养皿中不放置细胞的情况下，以不同强度发射经颅磁刺激（TMS），以显示线圈读数与刺激强度之间的线性相关性。</li>
	<li>接下来，在记录神经元培养物的钙瞬变信号的同时，逐步增加TMS刺激强度，并同步记录钙瞬变信号和线圈信号。初始阶段，作为大钙瞬变信号出现的网络簇发放电不应与拾取线圈记录的TMS脉冲同步。继续增加刺激强度，当达到某一阈值时，钙瞬变信号开始与TMS脉冲同步。或者，在获得同步反应后，逐步降低刺激强度直至同步消失，以确定TMS的阈值。 
	注意：每次实验设置的条件必须严格保持一致，包括每次使用的精确体积、相同的容器以及线圈位置和方向的精确控制。
	<ol>
		<li>将拾取线圈安装在记录培养皿底部，使其平面与神经元培养层平行，并相对于培养物保持固定位置。 
		注意：这可确保拾取线圈相对于磁体的位置依赖关系真实反映培养物的位置，且任何位置偏差对拾取线圈读数的影响均可忽略不计。
		<ol>
			<li>使用两个相互垂直放置的独立线圈（图8B），以产生旋转磁场和感应电场。将每个线圈连接至独立的磁刺激器（MS）。确保两个刺激器以90度相位差释放相似电流（图10A），从而产生一个在实空间扫描270度的旋转磁场，最大场强约为270 V/m（图10B）。</li>
			<li>将神经元培养物置于充满外部记录液（EM）的球形玻璃容器内。</li>
			<li>如步骤2.4.4所述，通过相机监测刺激反应（神经元荧光强度的变化）。</li>
			<li>对于交叉线圈（图8B），将拾取线圈平行放置于神经元培养物下方特定距离处，并在整个实验过程中仔细维持该构型。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过公式 Emax=k1Br 解析计算一维构型下的电场，其中 Emax 为感应电场的最大振幅，方向沿半径为 r 的环形切线方向；B 为磁脉冲的振幅，k1 为一个可测量的比例常数（量纲系数），可通过拾取线圈测得（图8A）。</li>
	<li>使用数值模拟软件包（见材料列表）对电场进行数值模拟21。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

一维图案化是一种可用于多种应用的重要工具。例如，我们曾利用一维图案化技术从神经元培养物中构建逻辑门29，最近还用于测量大鼠海马神经元的时值和基强度5，以及与野生型（WT）海马神经元相比，唐氏综合征海马神经元放电活动信号传播速度的减慢27。建议的一维图案化实验方案具有良好的稳健性，且易于形成任意所需图案。我们建议在进行测量前观察一维培养物，以注意网络中是否存在任何可能影响其功能的连接中断情况。
化学图案化神经元构型具有悠久的历史30,31,32。我们发现，我们的方法可获得与化学图案化类似的结果，但其结果更稳定且更容易实现。最近，微流控图案化神经元的方法已成为我们所提出方法的一种有趣替代方案，其具有相当的简便性和易用性33<...

神经元与外加电场之间的相互作用具有重要的基础意义和实际应用价值。尽管自伏打时代以来人们已知晓外加电场能够激发组织，但关于电场在神经元中引发动作电位的具体机制，直到最近才开始逐步被揭示1,2,3,4。这包括阐明导致膜电位去极化的机制、细胞膜特性及离子通道的作用，甚至确定神经元中响应电场的具体区域2,5。治疗性神经刺激6,7,8,9,10技术尤其依赖于这些信息，这些知识对于精确定位病变区域以及理解治疗效果至关重要。此类理解还有助于制定治疗方案，并为大脑不同区域的刺激开发新的策略和方法。
测量相互作用 体内 脑部研究为这一理解增添了重要组成部分，但受限于颅内测量的不精确性和可控性较低。相比之下，体外培养中的测量可轻松实现高通量、高精度，具有优异的信噪比以及高度的可重复性和可控性。利用培养系统，可阐明集体神经网络行为的多种神经元特性 11,12,13,14,15,16同样，这一高度可控的系统有望高效阐明其他刺激方法的作用机制，例如光遗传学活性神经元在光刺激过程中通道开放的机制 17,18,19 负责产生动作电位。
本文重点在于描述通过外部电场高效激发神经元的工具的开发与理解。我们介绍了二维和一维图案化海马神经元培养物的制备方法，利用浴槽电极施加不同构型和方向的直接电场进行刺激，最后通过时变磁场对二维及一维图案化培养物进行刺激，该磁场可诱导产生电场5,20,21。

<table><tbody><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8054</td><td>断开网络。见第 2.4.2 节</td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>铺板培养基。见第 1.1.1 节</td></tr><tr><td>荷包牡丹碱（bicuculline）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14343</td><td>断开网络。见第 2.4.2 节</td></tr><tr><td>硼砂（十水合四硼酸钠）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9640</td><td>硼酸盐缓冲液。见第 1.1.2 节</td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Frutarom LTD</td><td>5550710</td><td>硼酸盐缓冲液。见第 1.1.2 节</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ，1 M</td><td>Fluka&amp;nbsp;</td><td>21098</td><td>细胞外记录液。见第 1.5.2 节</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C239</td><td>断开网络。见第 2.4.2 节</td></tr><tr><td>COMSOL</td><td>COMSOL Inc</td><td>Multiphysics 3.5</td><td>数值模拟。见第 3.5.2 节</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖，1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>65146</td><td>铺板培养基、细胞外记录液。见第 1.1.1 和 1.5.2 节</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>细胞培养。见第 1.2.4 和 1.2.6 节</td></tr><tr><td>FCS（FBS）</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td>铺板培养基。见第 1.1.1 节</td></tr><tr><td>纤连蛋白（Fibronectin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td>生物涂层。见第 1.2.6 节</td></tr><tr><td>Fluo4AM</td><td>Life technologies</td><td>F14201</td><td>自发或诱发活动成像。见第 1.5.1、1.5.3 和 1.5.5 节</td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td>更换培养基。见第 1.4.1 节</td></tr><tr><td>庆大霉素（Gentamycin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1272</td><td>铺板培养基、更换培养基、终末培养基。见第 1.1.1 节</td></tr><tr><td>GlutaMAX 100x</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>铺板培养基、更换培养基、终末培养基。见第 1.1.1 节</td></tr><tr><td>Hepes，1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>细胞外记录液。见第 1.5.2 节</td></tr><tr><td>HI HS</td><td>BI</td><td>04-124-1A</td><td>铺板培养基、更换培养基、终末培养基。见第 1.1.1、1.4.1 和 1.4.2 节</td></tr><tr><td>KCl，&amp;nbsp;3 M</td><td>Merck</td><td>1049361000</td><td>细胞外记录液。见第 1.5.2 节</td></tr><tr><td>层粘连蛋白（Laminin）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>生物涂层。见第 1.2.6 节</td></tr><tr><td>MEM ×1</td><td>Gibco</td><td>21090-022</td><td>铺板培养基、更换培养基、终末培养基。见第 1.4.1&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;和 1.4.2 节</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ，1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>细胞外记录液。见第 1.5.2 节</td></tr><tr><td>NaCl，4 M</td><td>Bio-Lab</td><td>19030591</td><td>细胞外记录液。见第 1.5.2 节</td></tr><tr><td>十八烷硫醇（Octadecanethiol）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01858</td><td>清洗铬-金镀膜盖玻片（一维培养）。见第 1.2.3 节</td></tr><tr><td>Pluracare F108 NF Prill</td><td>BASF Corparation&amp;nbsp;</td><td>50475278</td><td>生物抗粘附涂层、生物涂层。见第 1.2.4 和 1.2.6 节</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸 0.01% 溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;P47075</td><td>促进细胞分裂。见第 1.1.4 节</td></tr><tr><td>蔗糖，1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1888</td><td>细胞外记录液。见第 1.5.2 节</td></tr><tr><td>硫醇（Thiol）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1858</td><td>生物抗粘附涂层。见第 1.2.3 节</td></tr><tr><td>尿苷（URIDINE）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td>更换培养基。见第 1.4.1 节</td></tr><tr><td>溅射仪</td><td>AJA International, Inc</td><td>ATC Orion-5Series&amp;nbsp;</td><td>在玻璃上镀金属薄膜。见第 1.2.2 节</td></tr><tr><td>笔式绘图仪&amp;nbsp;</td><td>Hewlett Packard&amp;nbsp;</td><td>HP 7475A</td><td>在镀膜盖玻片上蚀刻图案。见第 1.2.5 节</td></tr><tr><td>电极导线&amp;nbsp;</td><td>A-M Systems, Carlsborg WA</td><td>767000</td><td>神经元培养的电刺激。见第 2.1、2.2、2.3 和 2.4.5 节</td></tr><tr><td>信号发生器</td><td>BKPrecision</td><td>4079</td><td>电信号整形。见第 2.3 节</td></tr><tr><td>放大器</td><td>自制</td><td></td><td>将信号发生器输出的电压信号放大后传递至电极。见第 2.3 节</td></tr><tr><td>电源</td><td>Matrix&amp;nbsp;</td><td>MPS-3005 LK-3&amp;nbsp;</td><td>为溅射仪供电。见第 1.2.2.3 节</td></tr><tr><td>经颅磁刺激仪</td><td>Magstim, Spring Gardens, UK</td><td>Rapid 2</td><td>对神经元培养进行磁刺激。见第 3.1、3.3 和 3.4 节</td></tr><tr><td>环氧树脂</td><td>Cognis</td><td>Versamid 140</td><td>用于自制线圈的浇铸。见第 3.4 节</td></tr><tr><td>环氧树脂</td><td>Shell</td><td>EPON 815&amp;nbsp;</td><td>用于自制线圈的浇铸。见第 3.4 节</td></tr><tr><td>直径 0.005 英寸的铂丝；A-M Systems,&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Carlsborg WA</td><td>&amp;nbsp;767000</td><td>神经元培养的电刺激。见第 2.1 节</td></tr><tr><td>圆形磁刺激线圈</td><td>自制</td><td></td><td>对神经元培养进行磁刺激。见第 3.3 节</td></tr><tr><td>WaveXpress 软件</td><td>B&amp;K Precision&amp;nbsp;</td><td></td><td>波形编辑软件。见第 2.1.32 节</td></tr><tr><td>Xion Ultra 897</td><td>Andor</td><td></td><td>高灵敏度 EMCCD 相机。见第 2.4.4 节</td></tr></tbody></table>

使用电场和磁场对外部刺激一维和二维培养神经元

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

当神经元的膜电位超过某一特定阈值时，便会触发动作电位。在大脑的正常活动中，这种情况通常由突触接收到的化学信号输入引起。然而，神经元也可通过施加的外电场被激活。特别是近年来的临床应用中，通过在体外建立电场来激活神经元。因此，研究神经元如何响应外电场以及动作电位产生的机制具有重要意义。幸运的是，对于经分离、解离并在培养基中生长的胚胎神经元细胞，可以实现对外电场的精确且可控的施加。这使得相关问题能够在高度可重复的实验系统中进行研究。
本文综述了在神经元培养中用于施加可控外电场的一些技术。这些网络可以是一维的， 即 以线性图案排列或在整个基底平面上生长，呈二维结构。此外，可通过浸入液体中的电极（浴槽电极）直接施加电场，或通过远程产生磁脉冲诱导电场来实现刺激。

本方案可实现神经元培养的简便图案化。当该方法与我们开发的多种刺激技术相结合时，能够测量神经元的某些内在特性，例如时值（Chronaxie）和基强度（Rheobase）5，比较健康神经元与病变神经元的特性差异27，探索根据培养物结构刺激神经元的最佳方式，以及开展更多新颖的研究。下文图示中展示了部分示例。
图3 显示了刻蚀在抗生物污染层中的 一维图案化构型。通常刻写宽度约为 170 µm 的细线，例如具有不同半径的同心环（图3A）或长度通常约为 11 mm 的平行线（图3B）。
上方面板的 图...

神经元培养是研究新兴脑刺激技术的良好模型，可通过这些技术对单个神经元或神经元群体的影响进行分析。本文介绍了利用浴电极直接产生的电场或随时间变化的磁场诱导产生的电场，对模式化神经元培养物进行刺激的不同方法。

当神经元的膜电位超过某一特定阈值时，便会触发动作电位。在大脑的正常活动中，这一现象是由于……

本方案针对一维和二维培养物进行电刺激和磁刺激的总体目标，是高效利用神经元培养作为脑刺激的简化模型，从中获取深入认识和关键参数。通过在一维培养物中应用我们的电刺激方案，可测量与神经元兴奋相关的特定参数，例如神经元不同区室的时值和基强度。磁刺激技术则使我们能够比较磁场与电场对神经元培养物的作用效果。该模型还有助于我们更准确地诊断和治疗脑部疾病。我们提出了一种高效且简便的方法，可用于培养任意设计图案的神经元网络，包括一维网络。随后，我们可以针对这些网络施加定向的电场和随时间变化的磁场，以分离并观察神经元不同区室的贡献。该技术的主要优势在于无需使用人类受试者或动物模型，即可对神经元刺激的合适参数进行广泛而详尽的探索。演示该实验步骤的是来自本实验室的技术员 Yuri Burnishev 以及实验室的博士生 Ami Eisen。首先，通过将神经细胞接种到部分预先涂有生物排斥层的玻璃盖玻片上，制备图案化神经元培养物。为此，先清洗 25 毫米的盖玻片。然后使用溅射仪在盖玻片上镀一层抗生物污染的涂层。调节沉积过程的参数，形成一层由 6 至 10 埃厚的铬薄膜和 30 埃厚的金层组成的复合涂层，其中铬薄膜可确保涂层的稳定性，金层则赋予涂层与硫醇反应的活性。过程完成后，从溅射仪上取下盖玻片，检查所获得的涂层。接下来，通过将绘图笔的墨水尖端替换为锋利的金属刻蚀针，组装一个改进的笔式绘图仪系统。将粘附在硬质板上的橡胶片放入绘图仪中，以确保刻蚀过程中具有稳固且高摩擦力的表面。然后，通过绘图仪上提供的按钮调节橡胶片的位置。橡胶片就位后，用移液器在其表面滴加一滴水，并将预先包被的盖玻片置于水滴之上。接着，使用绘图仪通过反复刮擦在金属层上刻蚀，形成200微米宽的线条，以制备所需图案。在施加电刺激之前，将接种有细胞的盖玻片放入成像腔室中。为使用恒定方向的电场刺激细胞，采用两个平行电极，二者相距11毫米，并分别位于接种于13毫米盖玻片上的培养物的相对两侧。然后组装培养物成像腔室及匹配的电极支架，使导线电极浸入细胞外培养基中，并位于培养物上方1毫米处。然后，将单对电极连接至运算放大器，以放大来自信号发生器的信号。施加一个占空比为50%、幅度为22伏的双极性方波单脉冲。使用无直流分量的双极性波形，以避免电极处发生可能的电解反应。施加持续时间为10微秒至4毫秒的脉冲，以确保有效刺激并防止细胞损伤。若需使用方向变化的电场刺激细胞，请使用两组相互垂直的电极。确保这两组电极及其电源和监测端子彼此之间完全电隔离，并且与大地接地浮空。要改变电场方向，需调节施加在两对电极上的电压幅值，然后通过矢量叠加确定合成电场的强度和方向。要产生固定幅值的旋转电场，需向一对电极施加正弦波，同时向另一对电极输入余弦波。开始磁刺激时，将呈圆形图案生长的神经元培养物置于显微镜下。使用市售的标准圆形磁刺激线圈及配套刺激器对培养物进行刺激。若需以非标准磁感应强度刺激培养物，可将自制的磁刺激线圈连接至自行搭建的刺激器上进行操作。然后，借助激光指示器，将培养物的中心与线圈的中心对齐，以确保刺激成功。调整线圈位置，使其保持在培养物中心上方约五毫米处。一旦刺激线圈准确定位，将刺激器充电至最高五千伏的电位。然后，使用高电流、高电压开关，将高电压电流通过刺激线圈放电，产生磁脉冲以刺激培养神经元的活动。最后，将拾取线圈置于与神经元培养相同的位置，测量所产生磁场的强度。该示意图表明，通过向两对电极施加不同幅度的电压脉冲，可使电场朝向任意角度，而无需手动旋转培养样本。以下是使用不同施加电压进行电刺激时钙瞬变的示例记录。当施加恒定持续时间的电场时，发放并响应电场的神经元数量随电压幅度呈累积高斯分布。这是采用该方案获得的强度-持续时间曲线的一个示例。对于响应磁场的环形培养物，刺激的成功率随培养环半径的增大而增加。该图描述了环形尺寸与磁场强度之间的关系。大多数成功的培养物兴奋事件位于实验可达到的相位空间与高概率区域的重叠部分。一旦掌握，一维培养物的制备可在三到四小时内完成。在进行电刺激和磁刺激时，需注意让培养物在刺激步骤后充分恢复，并确保所有设备相对于电学地处于浮置状态。通过遵循本实验方案，还可进一步探讨其他科学问题，例如培养来自大脑不同区域的神经元，或测量皮层神经元等细胞的统计学参数。另一种可能性是测量任何疾病模型神经元的参数。该技术发展成熟后，将有助于优化有效且安全的脑刺激所需的强度和持续时间。观看本视频后，您应能够充分理解如何构建任意所需的神经元培养模式，并能够对这些神经元进行电刺激或磁刺激，以研究神经元与电磁场之间的相互作用。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

使用电动和一维和二维文化磁场神经元的外部激励

本方案展示了在定制设计的电趋化室中建立二维和三维环境的方法，可用于追踪细胞 体内/离体 利用单细胞水平的时间延时记录，以研究趋电性（galvanotaxis/electrotaxis）及其他细胞对直流电场（DC...

电场控制下神经前体细胞在二维和三维环境中的定向迁移

在本实验方案中，我们演示了如何构建定制腔室，以施加直流电场，从而实现对成年脑源性神经前体细胞在电趋化过程中细胞体迁移的延时成像观察。...

一种用于分析神经前体细胞在体外施加直流电场中迁移动力学的电趋性实验方法

本视频展示了利用海马神经元构建三维神经元培养物并与平面微电极阵列耦合的方法。分离的神经元在微电极阵列的活性区域上形成二维网络，并附着于带有膜插件的多孔板中的玻璃微珠上。当将这些带有神经元的微珠转移至电极上时，它们会自组织成相互连接的三维神经网络。...

构建耦合微电极阵列的三维神经元网络

本视频演示了一种利用均匀、单向电场刺激条纹状神经元培养物的技术。...

一维图案化神经元培养物的外部激发

本视频演示了一种利用时变磁场刺激生长在盖玻片上环形图案化区域的神经元培养物的方法。...

磁刺激模式化神经元培养物

该视频展示了通过电生理记录来评估iPSC来源的神经元与大鼠皮层神经元之间的神经连接，通过激活光敏离子通道并检测突触后电流，在共培养体系中证实了突触接触的存在。...

利用电生理记录评估共培养体系中的神经连接形成

我们介绍一种在多电极阵列上培养原代小鼠螺旋神经节神经元外植体的方案，用于研究神经元的反应特性并优化刺激参数。此类研究旨在改善人工耳蜗植入体的神经元-电极界面，从而提高患者的听力效果，并降低设备的能量消耗。...

螺旋神经节神经元外植体培养及多电极阵列电生理记录

在多电极阵列上培养的小鼠神经元细胞在接受电刺激后表现出反应增强。本方案演示了如何培养神经元、如何记录其活动，以及如何建立一种训练网络以响应特定刺激模式的实验方案。...

微电极阵列上神经元细胞培养物对刺激反应的时程依赖性增强

本方案介绍了一种利用硅纳米线对细胞进行细胞内光学生物调控的简单且易于操作的方法。该技术具有高度的适应性，可适用于多种细胞类型，并可用于体外以及体内应用。...

硅纳米线与光刺激用于细胞内及细胞间电耦合的研究

本研究中，我们介绍了一种仅通过微流控系统中直流脉冲刺激诱导神经干细胞和前体细胞（NPCs）分化的实验方案。...

微流控装置中电场诱导的神经前体细胞分化

本方案详细描述了构建用于刺激生物组织的电刺激器和磁刺激器的逐步过程。该方案包括电场和磁场的计算机模拟指南以及刺激装置的制造方法。...

用于生物组织刺激的电场与磁场装置

学习使用电场和磁场刺激一维和二维神经元培养物的方法，测量神经兴奋参数如chronaxie和rheobase，比较不同刺激方式对神经元的影响，为脑疾病诊断和治疗提供重要见解。

使用电场和磁场对外部刺激一维和二维培养神经元

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