使用电场和磁场对外部刺激一维和二维培养神经元

本方案针对一维和二维培养物进行电刺激和磁刺激的总体目标，是高效利用神经元培养作为脑刺激的简化模型，从中获取深入认识和关键参数。通过在一维培养物中应用我们的电刺激方案，可测量与神经元兴奋相关的特定参数，例如神经元不同区室的时值和基强度。磁刺激技术则使我们能够比较磁场与电场对神经元培养物的作用效果。

该模型还有助于我们更准确地诊断和治疗脑部疾病。我们提出了一种高效且简便的方法，可用于培养任意设计图案的神经元网络，包括一维网络。随后，我们可以针对这些网络施加定向的电场和随时间变化的磁场，以分离并观察神经元不同区室的贡献。

该技术的主要优势在于无需使用人类受试者或动物模型，即可对神经元刺激的合适参数进行广泛而详尽的探索。演示该实验步骤的是来自本实验室的技术员 Yuri Burnishev 以及实验室的博士生 Ami Eisen。首先，通过将神经细胞接种到部分预先涂有生物排斥层的玻璃盖玻片上，制备图案化神经元培养物。

为此，先清洗 25 毫米的盖玻片。然后使用溅射仪在盖玻片上镀一层抗生物污染的涂层。调节沉积过程的参数，形成一层由 6 至 10 埃厚的铬薄膜和 30 埃厚的金层组成的复合涂层，其中铬薄膜可确保涂层的稳定性，金层则赋予涂层与硫醇反应的活性。

过程完成后，从溅射仪上取下盖玻片，检查所获得的涂层。接下来，通过将绘图笔的墨水尖端替换为锋利的金属刻蚀针，组装一个改进的笔式绘图仪系统。将粘附在硬质板上的橡胶片放入绘图仪中，以确保刻蚀过程中具有稳固且高摩擦力的表面。

然后，通过绘图仪上提供的按钮调节橡胶片的位置。橡胶片就位后，用移液器在其表面滴加一滴水，并将预先包被的盖玻片置于水滴之上。接着，使用绘图仪通过反复刮擦在金属层上刻蚀，形成200微米宽的线条，以制备所需图案。

在施加电刺激之前，将接种有细胞的盖玻片放入成像腔室中。为使用恒定方向的电场刺激细胞，采用两个平行电极，二者相距11毫米，并分别位于接种于13毫米盖玻片上的培养物的相对两侧。然后组装培养物成像腔室及匹配的电极支架，使导线电极浸入细胞外培养基中，并位于培养物上方1毫米处。

然后，将单对电极连接至运算放大器，以放大来自信号发生器的信号。施加一个占空比为50%、幅度为22伏的双极性方波单脉冲。使用无直流分量的双极性波形，以避免电极处发生可能的电解反应。

施加持续时间为10微秒至4毫秒的脉冲，以确保有效刺激并防止细胞损伤。若需使用方向变化的电场刺激细胞，请使用两组相互垂直的电极。确保这两组电极及其电源和监测端子彼此之间完全电隔离，并且与大地接地浮空。

要改变电场方向，需调节施加在两对电极上的电压幅值，然后通过矢量叠加确定合成电场的强度和方向。要产生固定幅值的旋转电场，需向一对电极施加正弦波，同时向另一对电极输入余弦波。

开始磁刺激时，将呈圆形图案生长的神经元培养物置于显微镜下。使用市售的标准圆形磁刺激线圈及配套刺激器对培养物进行刺激。若需以非标准磁感应强度刺激培养物，可将自制的磁刺激线圈连接至自行搭建的刺激器上进行操作。

然后，借助激光指示器，将培养物的中心与线圈的中心对齐，以确保刺激成功。调整线圈位置，使其保持在培养物中心上方约五毫米处。一旦刺激线圈准确定位，将刺激器充电至最高五千伏的电位。

然后，使用高电流、高电压开关，将高电压电流通过刺激线圈放电，产生磁脉冲以刺激培养神经元的活动。最后，将拾取线圈置于与神经元培养相同的位置，测量所产生磁场的强度。该示意图表明，通过向两对电极施加不同幅度的电压脉冲，可使电场朝向任意角度，而无需手动旋转培养样本。

以下是使用不同施加电压进行电刺激时钙瞬变的示例记录。当施加恒定持续时间的电场时，发放并响应电场的神经元数量随电压幅度呈累积高斯分布。这是采用该方案获得的强度-持续时间曲线的一个示例。

对于响应磁场的环形培养物，刺激的成功率随培养环半径的增大而增加。该图描述了环形尺寸与磁场强度之间的关系。大多数成功的培养物兴奋事件位于实验可达到的相位空间与高概率区域的重叠部分。

一旦掌握，一维培养物的制备可在三到四小时内完成。在进行电刺激和磁刺激时，需注意让培养物在刺激步骤后充分恢复，并确保所有设备相对于电学地处于浮置状态。通过遵循本实验方案，还可进一步探讨其他科学问题，例如培养来自大脑不同区域的神经元，或测量皮层神经元等细胞的统计学参数。

另一种可能性是测量任何疾病模型神经元的参数。该技术发展成熟后，将有助于优化有效且安全的脑刺激所需的强度和持续时间。观看本视频后，您应能够充分理解如何构建任意所需的神经元培养模式，并能够对这些神经元进行电刺激或磁刺激，以研究神经元与电磁场之间的相互作用。