Name: 荧光活化细胞分选（FACS）和新鲜和冷冻大鼠脑组织的Fos表达神经元基因表达分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学习荧光活化细胞分选技术，用于从大鼠新鲜或冷冻脑组织中分离Fos表达神经元并进行基因表达分析。该方法可高效分离特定神经元群体，助力神经科学研究。

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本研究工作得到了美国国家药物滥用研究所（NIDA）院内研究计划（Bruce T. Hope，Yavin Shaham）的支持。F.J.R. 获得了由美国国立卫生研究院（NIH）资助、橡树岭科学与教育研究所管理的 NIDA 研究参与计划的资助，同时还获得了由智利国家科技创新委员会（CONICYT）和智利圣地亚哥安第斯大学管理的智利奖学金（Becas-Chile）提供的额外资金支持。约翰斯·霍普金斯大学 FACS 核心设施获得了美国国立卫生研究院国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所授予的 P30AR053503 项目资助。

所有实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的机构动物护理和使用委员会（IACUC）规定进行16。
注意：以下所有步骤均使用低吸附离心管，并在未特别说明的情况下保持在冰上。
1. 组织采集前的准备
<ol>
	<li>将离心机设定为 4 oC。</li>
	<li>将三根玻璃巴斯德移液管烧制成拉细口，其直径依次约为 1.3、0.8 和 0.4 mm，每个样品使用一套。</li>
	<li>准备若干标记好的 1.7 ml 离心管，每管中加入 1 ml 冷的缓冲液 A，并将离心管置于冰上保存。</li>
	<li>准备一个冰盒，内放脑组织切片矩阵、刮勺和玻璃板（或倒置的玻璃培养皿），用于进行解剖操作。将两片或多片刀片预先放在玻璃板上冷却，并用纸巾擦干所有接触组织的器械。</li>
	<li>在室温（RT）下解冻酶溶液 30 分钟，然后再进行组织采集。</li>
</ol>
2. 组织采集与解剖
<ol>
	<li>在组织采集前90分钟开始行为学或药理学处理。 
	注意：此处所示结果基于在新环境中的大鼠（测试条件）进行5 mg/kg剂量的甲基苯丙胺急性腹腔注射，并以保留在饲养笼中的未处理大鼠（对照条件）作为对照。</li>
	<li>将大鼠置于盛有饱和异氟烷的玻璃干燥器中麻醉，30至60秒后使用断头器断头处死。 
	使用剪刀去除头部的皮肤和肌肉，暴露颅骨。使用咬骨钳切割颅骨，打开枕骨大孔并移除颅骨后部。使用咬骨钳沿颅骨顶部边缘剪开，以暴露脑组织。注意避免损伤脑组织。使用小型刮勺轻轻插入脑组织下方并缓缓抬起脑组织。将脑组织抬起，剪断神经，直至脑组织完全游离。 17.</li>
	<li>使用剃刀片解剖组织。 
	注意：可通过以下任一方法获取组织样本：（2.3.1）新鲜解剖的组织；（2.3.2）解剖后冷冻的组织；或（2.3.3）从冷冻完整脑组织中解剖获得的组织。在整个解剖和切碎过程中，保持脑切片模具、刀片和玻璃板干燥，因为冷凝水可能导致细胞低渗裂解。使用放大镜以确保解剖操作准确。
	<ol>
		<li>对于新鲜解剖的组织，将刚取出的大脑置于已预冷的脑切片模具中（一种带有1 mm间隔刀片槽的金属模具，形状为大鼠脑形），并将模具放置在冰上。将两片或更多预冷的刀片插入槽中，以切割包含目标脑区的冠状切片。将切好的脑片放置在预冷的玻璃板上。 
		注意：在冰冷的玻璃板上解剖感兴趣的脑区。</li>
		<li>对于解剖后的冷冻组织，从新提取的脑组织切片中解剖出目标脑区，操作方法同2.3.1节所述。将解剖得到的组织放入微量离心管中，通过将微量离心管浸入-40 ºC异戊烷中20秒迅速冷冻组织。在后续处理前，始终将解剖组织保存在-80 ºC冰箱中保持冷冻状态。</li>
		<li>对于冷冻组织，立即将新鲜提取的脑组织置于 -40 ºC 的异戊烷中速冻，并装入密封袋中于 -80 ºC 保存，最长可保存 6 个月。
		<ol>
			<li>解剖当天，将冷冻脑组织置于约 -20 ºC（不高于 -18 ºC）的冷冻切片机中，平衡温度约 2 小时。 
			注意：在此温度下脑组织较易切割，而温度过低时脑组织会变得过于脆硬，难以安全切片。</li>
			<li>使用剃须刀片在冷冻切片机中将冷冻脑组织切成1 - 2 mm的冠状切片。在冷冻条件下，使用钝化的12至16号针头从这些切片中获取组织穿孔样本。在进一步处理之前，始终保持分离的组织处于冷冻状态。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在剪切组织前，加入1-2滴缓冲液A以覆盖已解剖的组织。使用两把剃须刀片去除组织中的大部分白质，以防止在后续吹打过程中神经元丢失。若起始材料为冷冻组织，则在冷玻璃板上解冻不超过1分钟，随后立即加入缓冲液A溶液。</li>
	<li>在预冷的玻璃板上，用剃刀刀片在每个正交方向上各切碎组织100次。切碎时，保持剃刀刀片垂直于玻璃板。 
	注意：彻底剪碎组织对所有实验步骤均至关重要。</li>
	<li>使用剃须刀片将剪碎的组织转移至含有1 ml冷Buffer A的微量离心管中。轻轻颠倒管体3–5次，使剪碎的组织全部浸入溶液中。</li>
</ol>
3. 细胞解离
注意：以下所有步骤均需轻柔地进行上下颠倒混匀。请勿使用涡旋混合器，并避免产生气泡，以免造成细胞损伤。
<ol>
	<li>在 4 ºC 条件下，以 110 × g 离心样品管 2 分钟。弃去上清液。沿微量离心管内壁缓慢加入 1 ml 冷的、 freshly thawed 酶溶液（含有蛋白水解酶混合物）。立即用中等较大口径的吸头将整个沉淀完全吸起，并轻柔吹打 4 次，以分散剪碎的组织沉淀。</li>
	<li>立即倒置微量离心管，防止沉淀粘附管底，并在 4 oC 条件下以翻转混匀方式孵育 30 分钟。</li>
	<li>酶解组织后，在 4 ºC 条件下以 960 × g 离心 2 分钟。弃去上清液，加入 0.6 ml 冷的 Buffer A。加入 Buffer A 后立即使用同一吸头将整个沉淀完全吸起，并轻柔吹打 5 次以分散沉淀。</li>
	<li>通过以下步骤对消化后的组织进行机械吹打并收集至 15 ml 管中。每个样品使用一套独立的 3 支火焰抛光的玻璃巴斯德吸管，其直径依次约为 1.3、0.8 和 0.4 mm，并连接乳胶球。
	<ol>
		<li>用 1.3 mm 玻璃吸管轻柔吹打每个样品 10 次。将样品置于冰上静置 2 分钟（碎片和未解离细胞将沉至底部）。收集上清液（约 0.6 ml）并转移至一个 15 ml 圆锥管（管 #1）。</li>
		<li>向剩余沉淀中加入 0.6 ml Buffer A 溶液。用 0.8 mm 玻璃吸管吹打样品 10 次。将样品置于冰上静置 2 分钟。收集上清液（约 0.6 ml）并转移至同一 15 ml 圆锥管 #1。</li>
		<li>向剩余沉淀中加入 0.6 ml Buffer A 溶液。用 0.4 mm 玻璃吸管吹打样品 10 次。将样品置于冰上静置 2 分钟。收集上清液（约 0.6 ml；避免触碰含有未解离细胞的沉淀），并转移至同一 15 ml 圆锥管 #1。 
		注意：在后续吹打步骤中，将 0.4 mm 直径吸管保留在管 #1 中。</li>
		<li>使用最小的玻璃吸管（约 0.4 mm 直径）重复步骤 3.4.3 三次，每次收集的上清液转移至另一个独立的 15 ml 圆锥管（管 #2）。</li>
		<li>用 0.4 mm 玻璃吸管对管 #1 和管 #2 中收集的细胞悬液再吹打 10 次，并保持在冰上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞固定与通透化
<ol>
	<li>每份样本准备4个微量离心管（其中两个用于来自1号管的细胞，另两个用于来自2号管的细胞），向每个管中加入800 µl预冷至-20 oC的100%冷乙醇，并将这些管置于冰上保存。注意：最终乙醇浓度为50%。</li>
	<li>将约800 µl的细胞悬液（分别来自1号管和2号管）移入上述4个含有冷乙醇的微量离心管中，轻轻颠倒混匀。</li>
	<li>在4℃冰上孵育15分钟，期间每隔5分钟轻轻颠倒混匀一次。</li>
	<li>固定/透化完成后，在4 ºC下以1,700 × g离心4分钟，弃去上清液，保留约50 µl溶液以防止细胞丢失。 
	注意：此步骤中的沉淀呈白色，且比透化前更不易黏附于管壁。因此，吸取上清液时应小心操作，将移液器吸头接触无沉淀的管壁区域，并缓慢吸取上清液。</li>
</ol>
5. 细胞过滤
<ol>
	<li>按照以下步骤用冷PBS重悬第4.4步的沉淀：
	<ol>
		<li>向来自#1管的两个微量离心管中的一个加入550 μl冷PBS，使用直径适中的移液枪头轻轻吹打细胞悬液5次。对来自#2管的一个微量离心管重复相同操作。</li>
		<li>对于1号管中的细胞，使用同一支移液器将第一次的细胞悬液转移至第二次的细胞沉淀中。通过轻轻吹打混合后的细胞悬液上下5次，重新悬浮第二次的细胞沉淀。</li>
		<li>对于2号管中的细胞，重悬并合并沉淀物（即， 第三和第四微量离心管）的操作步骤见5.1.2节。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分别使用两组不同的细胞筛网（孔径分别为100 µm和40 µm），对步骤5.1.2和5.1.3中的两种细胞悬液进行过滤，具体如下：
	<ol>
		<li>使用移液管向细胞筛内部加入 PBS 以预先润湿每个细胞筛，然后用移液管将细胞筛外部多余的 PBS 吸除。</li>
		<li>将第5.1.2步的细胞悬液均匀地移液至第一个孔径为100 µm的细胞筛上。用预冷的50 ml离心管收集滤过液。使用移液器收集附着在细胞筛外侧底部的滤过液。</li>
		<li>使用同一支移液管将100 μm细胞滤筛的滤过液转移至40 μm细胞滤筛。将此滤过液收集到另一支50 ml离心管中，并置于冰上。当从40 μm细胞滤筛转移滤过液时，更换新的移液管头，以避免来自100 μm细胞滤筛的污染。</li>
		<li>使用一组新的滤膜，对步骤 5.1.3 中的细胞悬液重复上述步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将每个样本的两份穿流液合并，最终体积约为每样本1 ml。</li>
</ol>
6. 抗体孵育
注意：使用脑细胞悬液的小份 aliquot 制备多个对照样本，以便在运行主要样本前设置合适的流式细胞仪参数。针对每种抗体标记，需制备包括无抗体、仅加入二抗（或其他荧光标记物）、以及同时加入一抗和二抗（或其他荧光标记物）的对照样本。利用这些对照设置流式细胞仪中区分特异性与非特异性标记的设门。在可能的情况下，使用无需补偿的荧光染料。在加入一抗前，通过添加 PBS 将设门对照样本的终体积增加至 700 µl。
<ol>
	<li>将100 µl过滤后的细胞样品转移至1.7 ml微量离心管中，制备光散射及DAPI对照样品。加入600 µl含1 µg/ml DAPI的冷PBS用于细胞核染色。在旋转混合仪上颠倒混匀孵育10分钟，随后按照步骤6.4.2至6.4.5进行洗涤，再进行流式细胞术检测。 
	注意：此样本仅用于在FACS仪器中分选剩余细胞前设定细胞/细胞核门。</li>
	<li>将100 µl过滤后的细胞转移至1.7 ml微量离心管中，制备单免疫标记对照样品。加入600 µl含一种抗体的冷PBS例如， NeuN 抗体）。向另一含有抗体的微量离心管中加入 600 µl 冷 PBS。例如， Fos 抗体）。如果一抗不是直接标记的，则加入相应的二抗。 
	注意：这些样本用于确定合适的光电倍增管（PMT）电压，并在必要时评估两种荧光信号的重叠情况。抗体浓度应进行滴定，以在所有通道中获得最佳的信噪比。若荧光信号存在重叠，也可通过流式细胞仪内不同荧光通道的内部校准进行补偿。</li>
	<li>通过将100 µl过滤后的细胞转移至1.7 ml微量离心管中，制备双荧光标记的阴性对照样品。加入600 µl含单独的二抗或直接偶联的一抗IgG的冷PBS。 
	注意：每次分选前均可使用此对照样品，以确定每种荧光染料的背景荧光水平。</li>
	<li>制备待分选的主要样本。
	<ol>
		<li>将700 μl过滤后的细胞转移至1.7 ml微量离心管中。加入7 µl（1:100）直接偶联Alexa Fluor 647的Fos一抗（anti-Fos-AF647）和1.4 µl（1:500）直接偶联藻红蛋白（Phycoerythrin）的NeuN一抗（anti-NeuN-PE）。在4 ºC条件下，以翻转混匀方式孵育30分钟。</li>
		<li>孵育结束时，向每个微量离心管（包括主样本和对照样本）中加入800 µl冷的PBS，倒置混匀。</li>
		<li>在 4 ºC 条件下，以 1,300 x g 离心 3 分钟。弃去上清液，保留约 50 µl 上清液以防止细胞丢失。</li>
		<li>向沉淀中加入1 ml冷的PBS，使用具有适度较大尖端直径的移液器重悬细胞。</li>
		<li>在 4 ºC 条件下以 1,300 x g 离心 3 分钟。弃去上清液。</li>
		<li>将沉淀重悬于500 µl预冷的PBS中（根据沉淀的大小调整最终体积）。</li>
		<li>将悬液转移至带有40 µm细胞滤网帽的圆底FACS样品管中，并通过滤网过滤。将免疫标记的细胞置于冰上保存，并立即进行FACS分析。注意：过滤时，将移液器吸头垂直轻触滤网帽，推动细胞悬液穿过滤网。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用对照样品设置流式细胞仪门控。
	<ol>
		<li>使用光散射和 DAPI 对照样本，从总事件和细胞碎片中鉴定出神经元细胞群体。 
		注意：在此样本中，细胞体仅占总事件的1%–2%（其余为碎片和断裂的细胞突起）。根据DAPI荧光信号（指示细胞核）和前向散射光信号（细胞大小），可定位细胞体，并依据细胞的前向散射光和侧向散射光特性进行反向设门（如图所示） 图1 A,B).</li>
		<li>使用单标免疫标记对照样本确定光电倍增管（PMT）电压设置，并分析一种特定荧光染料的发射光溢出到另一滤光片/通道的情况例如， Alexa Fluor 488/FITC 或藻红蛋白）。若荧光信号发生重叠，需通过手动调整补偿值来校正重叠。</li>
		<li>使用双荧光标记的阴性对照设定阳性群体的阈值。 
		注意：此样本中的信号被认为源于自发荧光，位于该阈值以上的主样本细胞可被视为阳性。通常，分选的阈值参数更为严格，实际分选的是标记细胞中高于阴性对照的约前2/3细胞群体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用FACS将主样本中的神经元分选至1.7 ml微量离心管中。将细胞收集到50 µl RNA提取缓冲液中。分选完成后，涡旋振荡并离心试管，然后用移液器上下吹打10次，以充分混匀悬液并回收管壁上附着的所有分选细胞。</li>
	<li>将分选后的细胞悬液在 42 ºC 下孵育 30 分钟，以确保在 RNA 提取前所有细胞均已裂解，随后在 4 ºC 下以 2,800 x g 离心 2 分钟。</li>
	<li>将上清液转移至无RNase的离心管中，用于-80 °C长期保存，或立即进行RNA提取、cDNA合成、目的基因预扩增和qPCR分析，具体步骤如前所述。 13-15.</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

FACS 可用于从新鲜或冷冻的成年脑组织中分选神经元及其他细胞类型。如引言中所述，使用冷冻组织的能力使得经过复杂且耗时较长的行为学实验（例如成瘾研究中的自我给药和复吸实验）的动物样本能够得到最佳利用。这些行为学实验通常持续 1 - 2 小时或更长时间，并要求所有动物（总共 10 - 20 只）在同一天内完成测试13,18。处理 4 份新鲜解剖的脑组织样本大约需要 4 小时，包括脑组织解剖、细胞解离、通透化和免疫标记。处理完成后，每份样本通过 FACS 分选需时 20 - 30 分钟。最后一步将分选后的细胞在裂解缓冲液中加热，还需 30 分钟。总体而言，从脑组织解剖到最终获得含 RNA 的细胞裂解液，共需约 7 小时。然而，目前可以在动物完成实验后立即冷冻整个脑组织或新鲜解剖的脑区，随后再进行处理。这种方法大大简化了实验流程，并允许在不同日期对多个脑区进行分选。在 FACS 前对组织进行冷冻还可能提高分选效果。从冷冻组织样本中可获得更多的 NeuN 阳性神经元。这一现象部分可能归因于冷冻和后续解冻过程中细胞膜的破坏，导致抗体更容易进入细胞内，从而增强对 NeuN 和 Fos 等胞内蛋白的标记。类似效应已在成纤维细胞、...

学习过程中，动物会在一系列高度特异的复杂刺激之间形成关联。这种高分辨率信息被认为是由稀疏分布的特定神经元群（称为神经元集群）内的特定模式改变所编码。近期，研究人员通过检测在行为或线索暴露期间被强烈激活的神经元中即早基因（IEGs）如Fos、Arc和Zif268及其蛋白产物的表达，识别出了这些神经元集群。尤其是表达Fos的神经元，已被证实对情境和线索特异性的学习行为具有因果作用1-4。因此，这些被激活的Fos表达神经元内部独特的分子神经适应性改变，是编码正常学习以及成瘾和创伤后应激障碍（PTSD）等异常学习障碍过程中所形成学习关联的神经机制的首要候选因素5。
荧光激活细胞分选（FACS）最近使得能够分析在表达 Fos 的神经元中独特的分子神经适应性。流式细胞术和细胞分选技术于20世纪60年代开发6,7，用于根据细胞的光散射和免疫荧光特性对其进行表征和分离，长期以来已广泛应用于免疫学和癌症研究。然而，流式细胞术和FACS需要单细胞悬液，而这类样本很难从成年脑组织中获得。FACS首次被用于从转基因小鼠中分离和分析表达绿色荧光蛋白（GFP）的纹状体神经元，该方法无需抗体标记8,9。我们开发了一种基于抗体的FACS方法10，用于分离并评估在野生型动物中由药物和/或提示激活的表达Fos的神经元中的分子改变11-15。在该方法中，使用针对通用神经元标志物NeuN的抗体标记神经元，而高度激活的神经元则使用抗Fos抗体进行标记。尽管我们最初的方法需要将每份样本最多10只大鼠的新鲜组织合并使用，但后续对实验方案的改进使得可以从单只大鼠的特定脑区实现表达Fos的神经元的FACS分离，并进行定量聚合酶链式反应（qPCR）分析13-15。总体而言，在成瘾研究中多种情境和提示诱发的行为过程中被激活的表达Fos的神经元中，发现了独特的分子改变12,14,15。
对新鲜组织进行流式细胞分选（FACS）存在一个主要的后勤问题，即组织解离和FACS处理需要一整天时间。此外，每天仅能处理约四个样本。这通常意味着每只动物的大脑只能分析一个脑区，其余脑区则不得不丢弃。对于需要手术及数周密集训练的低通量行为学实验（例如自我给药和消退训练）而言，这是一个重大问题。此外，在测试当天进行耗时且复杂的行为学操作，使得在同一天内完成FACS变得困难。如果能够在行为学测试结束后立即冷冻动物大脑，随后在研究者选择的不同时间点从一个或多个脑区分离表达Fos的神经元，将具有显著优势。
在此，我们证明了我们的FACS方案可用于从新鲜和冷冻的脑组织中分离出表达Fos的神经元（以及其他细胞类型）。例如，我们在急性注射甲基苯丙胺后，从大鼠纹状体中分离出表达Fos的神经元，同时也从未注射药物的大鼠（对照条件）中进行了分离。然而，该FACS方案可适用于任何行为学或药理学处理后的样本。对样本进行的后续qPCR分析表明，无论使用新鲜还是冷冻组织，这些细胞类型的基因表达均可实现相似的检测效率。

<table><tbody><tr><td>脑组织基质</td><td>CellPoint Scientific</td><td>69-2160-1</td><td>用于获取冠状面脑切片</td></tr><tr><td>Hibernate A 低荧光培养基</td><td>Brain Bits</td><td>HA-lf</td><td>方案中的缓冲液 A 用于从组织解离到固定步骤的组织和细胞处理</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td>方案中的酶溶液，用于在吹打前对组织进行酶消化</td></tr><tr><td>Protein LoBind 1.5 ml PCR 洁净离心管</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>防止实验过程中细胞丢失</td></tr><tr><td>细胞筛网，40 &amp;micro;m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>用于过滤细胞悬液</td></tr><tr><td>细胞筛网，100 &amp;micro;m</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>用于过滤细胞悬液</td></tr><tr><td>带筛网帽的 5 ml 圆底聚苯乙烯试管（Falcon）</td><td>BD Bioscience</td><td>352235</td><td>在细胞通过流式细胞仪前过滤细胞悬液</td></tr><tr><td>巴斯德吸管，玻璃材质</td><td>NIH 供应</td><td>6640-00-782-6008</td><td>用于组织吹打</td></tr><tr><td>Milli-Mark Anti-NeuN-PE 单克隆抗体（克隆 A60，小鼠来源）</td><td>EMD Millipore</td><td>FCMAB317PE</td><td>用于检测神经元的抗体</td></tr><tr><td>Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP 兔单克隆抗体（Alexa Fluor 647 标记）&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology&amp;nbsp;</td><td>8677</td><td>用于检测表达 Fos 的细胞的抗体</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D8417</td><td>用于细胞核染色</td></tr><tr><td>PicoPure RNA 提取试剂盒</td><td>Applied Biosystems.</td><td>KIT0204</td><td>该试剂盒包含第 6.14 步所需的 RNA 提取缓冲液，用于收集分选后的细胞</td></tr><tr><td>Superscript III 第一链 cDNA 合成系统</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td>用于从 RNA 合成 cDNA</td></tr><tr><td>TaqMan 靶向预扩增主混合液</td><td>Applied Biosystems.</td><td>4391128</td><td>用于对 cDNA 进行靶向预扩增</td></tr><tr><td>TaqMan Advance Fast Master&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems.</td><td>4444963</td><td>用于使用 TaqMan 探针进行 PCR 扩增</td></tr><tr><td>Fos TaqMan 探针</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Rn00487426_g1</td><td>TaqMan 探针/引物</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;NeuN&lt;/em&gt; TaqMan 探针</td><td>Applied Biosystems.</td><td>CACTCCAACAGCGTGAC</td><td>神经元基因标志物的核苷酸序列</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;NeuN&lt;/em&gt; 正向引物</td><td>Applied Biosystems.</td><td>GGCCCCTGGCAGAAAGTAG</td><td>神经元基因标志物的核苷酸序列</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;NeuN&lt;/em&gt; 反向引物</td><td>Applied Biosystems.</td><td>TTCCCCCTGGTCCTTCTGA</td><td>神经元基因标志物的核苷酸序列</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Gfap&lt;/em&gt; TaqMan 探针</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Rn00566603_m1</td><td>星形胶质细胞基因标志物的 TaqMan 探针/引物</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;iba-1&lt;/em&gt; TaqMan 探针</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Rn00574125_g1</td><td>小胶质细胞基因标志物的 TaqMan 探针/引物</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Gapdh&lt;/em&gt; TaqMan 探针</td><td>Applied Biosystems.</td><td>CTCATGACCACAGTCCA</td><td>内参/管家基因的核苷酸序列</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Gapdh&lt;/em&gt; 正向引物</td><td>Applied Biosystems.</td><td>GACAACTTTGGCATCGTGGAA</td><td>内参/管家基因的核苷酸序列</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Gapdh&lt;/em&gt; 反向引物</td><td>Applied Biosystems.</td><td>CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA</td><td>内参/管家基因的核苷酸序列</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Oligo2&lt;/em&gt; TaqMan 探针</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Rn01767116_m1&amp;nbsp;</td><td>少突胶质细胞基因标志物的 TaqMan 探针/引物</td></tr><tr><td>P1000 移液器</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td>在步骤 3.1 和 3.3 中指代带有大口径吸头的移液器，用于轻柔组织吹打；在步骤 6.7 中用于重悬细胞</td></tr><tr><td>7500 快速实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Applied Biosystems.</td><td>446985</td><td>用于定量 PCR</td></tr><tr><td>FACSAria I 细胞分选仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>用于流式细胞分选（FACS）</td></tr></tbody></table>

流式荧光细胞分选（facs）及对新鲜与冻存大鼠脑组织中fos表达神经元的基因表达分析

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

对学习行为中神经可塑性及分子改变的研究，正从全脑区域的分析转向研究介导学习关联的特定稀疏分布激活神经元群，即神经元集合。近期，荧光激活细胞分选技术（FACS）已针对成年大鼠脑组织进行了优化，可通过针对神经元标志物NeuN和Fos蛋白（强激活神经元的标志物）的抗体，实现对激活神经元的分离。迄今为止，表达Fos的神经元及其他细胞类型均需从新鲜组织中分离，这一过程耗时较长，且在经历漫长而复杂的行为学实验后，仅能评估极少量的脑样本。本文中，我们发现背侧纹状体中表达Fos的神经元及Fos mRNA的得率，在新鲜解剖组织与在-80 ºC下冷冻保存3至21天的组织之间无显著差异。此外，我们通过检测神经元（NeuN）、星形胶质细胞（GFAP）、少突胶质细胞（Oligo2）和小胶质细胞（Iba1）标志物的基因表达，验证了NeuN阳性与NeuN阴性分选细胞的表型，表明冷冻组织也可用于胶质细胞类型的FACS分离。总体而言，可对脑组织进行采集、解剖并冷冻保存，以用于多次FACS实验。这最大限度地提高了从经历长期复杂行为学实验的珍贵动物个体中获取的数据量。

在单只大鼠急性注射甲基苯丙胺后，从新鲜及冷冻的背侧纹状体组织中分选 Fos 阳性与 Fos 阴性神经元。
上述方案用于在大鼠腹腔注射甲基苯丙胺（5 mg/kg）后 90 分钟，从单侧大鼠背侧纹状体中分选 Fos 阳性与 Fos 阴性神经元。以饲养在普通笼具中的未经处理大鼠作为对照。背侧纹状体组织在采集后立即进行处理（新鲜组织），或在 -80 ºC 冻存 1、7 或 21 天后进行处理。这些不同冻存时间点的结果之间无显著差异，因此数据被合并分析。
为在仪器上设置分选条件，使用来自家庭笼对照组或安非他明注射组的对照样本（如上所述）。当这些样本中的每个粒子或事件通过流式细胞仪的流动池时，系统会为每个事件分配一个识别编号，该编号与事件的光散射和荧光特性相关联，并记录在电子表格中。随后可根据这些特性将表格中的事件整理成散点图或密度图（<str...

本文介绍一种荧光激活细胞分选（FACS）方案，用于研究来自新鲜和冷冻脑组织中表达 Fos 的神经元群体的分子改变。使用冷冻组织可实现跨多个实验批次对多个脑区进行 FACS 分离，从而最大限度地利用珍贵的实验动物资源。

流式荧光细胞分选（FACS）及对新鲜与冻存大鼠脑组织中Fos表达神经元的基因表达分析

从对整个脑区的研究转向对特定神经元群体的研究，神经可塑性及学习行为中分子变化的研究正在发生转变。

本实验的主要目标是从新鲜或冷冻的成年大鼠脑组织中分离出表达 Fos 的神经元，用于后续的荧光激活细胞分选（FACS）。该方法可用于分离特定神经元细胞，以鉴定行为激活神经元所特有的分子神经适应性变化。该技术的主要优势在于可使用冷冻组织，便于在不同日期从多个脑区分离细胞。为了处理这份新鲜脑组织，将两片或更多预冷的剃须刀片插入冰冷的脑切片模具的槽中，切割出包含目标脑区的1至2毫米厚的冠状切片，并在切片过程中将其放置于预冷的玻璃板上。首先，分离出目标脑区，弃去其他区域，并去除白质。为冷冻组织，将样品转移至微量离心管中，将管子浸入零下40摄氏度的异戊烷中20秒，随后于零下80摄氏度保存，直至进一步处理。为切碎组织，将样品置于冷玻璃板上解冻，时间不超过一分钟，随后在样品上覆盖一至两滴缓冲液A（Buffer A）。接着，将剃刀刀片完全垂直于玻璃板，分别在每个正交方向上切碎组织100次。为充分切碎组织，关键是要始终保持组织被缓冲液A润湿，并严格遵循规定的切碎次数和方向。在组织解剖过程中，必须去除大部分白质，并始终保持组织浸没于缓冲液A中，以提高切碎效率并维持细胞活性。当组织充分处理后，使用刀片将组织碎片转移至含有1毫升冷缓冲液A的微量离心管中，轻轻颠倒管体3至5次，使所有切碎的组织完全浸入溶液。为将组织碎片解离成单细胞悬液，通过离心使样本形成沉淀。弃去上清液。然后，沿微量离心管内壁缓慢加入1毫升冰冷且 freshly-thawed 的酶溶液。使用大口径吸头的移液器立即吸取并吹打每个沉淀物四次，以充分分散剪碎的组织块。接下来，迅速倒置微量离心管，防止沉淀物粘附在管底，并在4摄氏度下以翻转混匀的方式孵育样品30分钟。消化结束后，再次离心试管，向细胞中加入0.6毫升冰冷的缓冲液A。使用同一枪头，立即对沉淀进行5次吸打操作。然后，选择一支1.3毫米玻璃移液管，轻轻吹打样品10次。将样品置于冰上2分钟，使碎片和未解离的细胞沉降到管底。随后，将上清液转移至新的15毫升离心管中。接下来，向剩余的沉淀中加入 600 微升缓冲液 A 溶液，使用直径为 0.8 毫米的移液枪将样品再吹打 10 次。待组织如上所述沉降后，将上清液与第一次的细胞悬液合并，并向沉淀中再加入 600 微升缓冲液。然后，使用直径为 0.4 毫米的移液枪吹打样品，将离心管置于冰上静置 2 分钟，使组织充分沉降。按照本方案中的机械吹打步骤操作，对成功分选至关重要。随后，将上清液与解离的细胞合并。然后，向样品中加入 600 微升缓冲液 A，并使用 0.4 毫米移液器再进行三次吹打。将试管置于冰上两分钟，使细胞沉淀。然后将上清液收集到另一个15毫升离心管中。使用最小的玻璃移液管再重复吹打三次，可显著提高后续分选所需的细胞产量。收集完所有上清液后，将 800 微升预冷至负 20 摄氏度的 100% 乙醇加入冰上的四个微量离心管中。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

荧光活化细胞分选（FACS）和新鲜和冷冻大鼠脑组织的Fos表达神经元基因表达分析

本方案涉及一种非放射性方法 原位...

双荧光 原位 新鲜脑切片中的杂交反应

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本研究的目的是通过建立一种可靠的免疫组织化学技术，利用细胞c-fos激活来检测大鼠首次摄入脂肪和糖后多巴胺通路及其终末位点的同步变化，从而鉴定与奖赏相关的分布式脑网络。...

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使用手动分选与双细胞剔除法对荧光标记小鼠神经元进行单细胞RNA测序 体外 具有绝对计数测序的转录组分析（DIVA-Seq）

本文介绍一种利用近红外染料结合免疫组织化学与高分辨率扫描，检测脑区蛋白质的实验方案。...

利用近红外荧光与高分辨率扫描检测啮齿类动物脑组织中的蛋白质表达

本方案描述了一种结合荧光的方法 原位...

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荧光激活细胞分选-放射性配体处理组织（FACS-RTT）是一种强大的工具，用于研究18 kDa转位蛋白或5-羟色胺5HT受体在特定组织中表达细胞的功能。2A阿尔茨海默病中受体表达的细胞尺度研究。本方案描述了 离体 FACS-RTT 在 TgF344-AD...

荧光激活细胞分选-放射性配体处理组织法（FACS-RTT）用于确定放射性信号的细胞来源

学习荧光活化细胞分选技术，用于从大鼠新鲜或冷冻脑组织中分离Fos表达神经元并进行基因表达分析。该方法可高效分离特定神经元群体，助力神经科学研究。

流式荧光细胞分选（FACS）及对新鲜与冻存大鼠脑组织中Fos表达神经元的基因表达分析

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