流式荧光细胞分选（FACS）及对新鲜与冻存大鼠脑组织中Fos表达神经元的基因表达分析

本实验的总体目标是从新鲜或冷冻的成年大鼠脑组织中解离出表达 Fos 的神经元，用于后续的荧光激活细胞分选（FACS）。该方法可用于分离特定神经元细胞，以鉴定行为激活神经元所特有的分子神经适应性变化。该技术的主要优势在于可使用冷冻组织，便于在不同日期从多个脑区分离细胞。

为了处理这份新鲜的脑组织，将两片或多片预冷的刀片插入冰冻脑组织切片矩阵的槽中，切割出一到两毫米厚的冠状切片，使其包含目标脑区，并在切片过程中将切下的组织置于冰冷的玻璃板上。首先，分离出目标脑区，弃去其他区域，并去除白质。为冷冻组织，将样品转移至微量离心管中，然后将管子浸入零下40摄氏度的异戊烷中20秒，随后于零下80摄氏度保存，直至进一步处理。

为切碎组织，将样品置于冷玻璃板上解冻，时间不超过一分钟，然后在样品上覆盖一到两滴缓冲液A（Buffer A）。接着，将剃刀刀片完全垂直于玻璃板，分别在每个正交方向上切碎组织100次。为充分切碎组织，关键是要始终保持组织被缓冲液A润湿，并严格遵循规定的切碎次数和方向。

在组织解剖过程中，必须去除大部分白质，并始终保持组织浸没在缓冲液A中，以提高切碎效率并维持细胞活性。当组织充分处理后，使用刀片将组织碎片转移至含有1毫升冰冷缓冲液A的微量离心管中，轻轻颠倒管体3至5次，使所有切碎的组织完全浸入溶液中。为将组织碎片解离成单细胞悬液，需通过离心使样本形成沉淀。

弃去上清液。然后，沿微量离心管内壁缓慢加入1毫升冰冷的、 freshly-thawed 酶溶液。立即使用大口径吸头通过移液器将每个沉淀物上下吹打4次，以充分分散剪碎的组织块。

接下来，迅速倒置微量离心管，防止沉淀物粘附在管底，并在4摄氏度下以头尾翻转的方式混匀孵育30分钟。消化结束后，再次离心样品，向细胞中加入0.6毫升预冷的缓冲液A。使用同一枪头立即对沉淀进行5次吸打操作。

然后，选择一支1.3毫米玻璃移液管，轻轻吹打样本10次。将样本置于冰上2分钟，使碎片和未解离的细胞沉降到管底。随后，将上清液转移至新的15毫升离心管中。

接着，向剩余的沉淀中加入 600 微升缓冲液 A 溶液，使用直径为 0.8 毫米的移液枪将样品再吹打 10 次。待组织如上所述沉降后，将上清液与第一次的细胞悬液合并，并向沉淀中再加入 600 微升缓冲液。然后，使用直径为 0.4 毫米的移液枪吹打样品，将离心管置于冰上静置 2 分钟，使组织充分沉降。

按照方案中的机械吹打步骤操作对于成功分选至关重要。随后，将上清液与解离的细胞合并。然后，向样品中加入 600 微升缓冲液 A，并使用 0.4 毫米移液器再进行三次吹打。

将离心管置于冰上两分钟，使细胞沉淀。然后，将上清液收集到另一个15毫升离心管中。使用最小的玻璃移液管再重复吹打三次，可显著提高后续分选所需的细胞产量。

收集完所有上清液后，将 800 微升预冷至负 20 摄氏度的 100% 乙醇加入置于冰上的四支微量离心管中。随后，将第一管收集的上清液中的 800 微升细胞转移至前两管乙醇中，再将第二管上清液中的 800 微升细胞分别转移至后两管乙醇中。轻轻颠倒离心管以混匀样品。

然后将样品置于冰上孵育15分钟，每5分钟轻轻颠倒混匀一次。孵育结束后，离心细胞。随后仅接触微量离心管管壁，用微量移液器缓慢吸除上清液，每管保留最后50 µL。

使用两对不同的细胞筛分别过滤两种细胞悬液。随后，细胞即可用于针对目的细胞标志物的抗体标记，并通过流式细胞术进行分选。对新鲜及冷冻脑组织样本的分析显示，存在少量均一的神经元细胞群体，其大小和颗粒度相似。

可通过设门排除细胞聚集体，选择出小而均一的细胞群，并根据NeuN和DAPI阳性信号鉴定神经元。在新鲜和冷冻组织样本中，NeuN阳性细胞群的NeuN mRNA水平均显著高于NeuN阴性细胞群。相反，胶质细胞和少突胶质细胞标志物的mRNA水平在NeuN阴性细胞群中高于NeuN阳性细胞群。

在 NeuN 阴性细胞群中也观察到小胶质细胞标志物 mRNA 水平升高的类似趋势，尽管该差异未达到统计学显著性。此外，Fos 阳性神经元中的 Fos mRNA 水平高于 Fos 阴性神经元，在新鲜组织来源的 Fos 阳性神经元中 Fos mRNA 增加了三倍，在冷冻组织来源的 Fos 阳性神经元中则增加了十一倍，从而证实了该方法在新鲜和冷冻组织条件下均可有效鉴定流式分选细胞中特定目的基因的可靠性。在进行该操作时，务必牢记遵循关键的细胞裂解预防步骤。

完成此操作后，可进一步采用其他方法（如荧光激活细胞分选）来分离感兴趣的细胞亚群，用于后续的分子分析。使用冷冻组织可使样本在不同日期进行分选，这对于涉及耗时且复杂的组织收获与制备流程的实验至关重要。该技术还可用于制备已储存数月或数年的尸源性冷冻人脑样本，以便通过流式细胞术进行分选。

该技术为神经科学领域的研究人员探索表达Fos的神经元或其他免疫标记的野生型目标细胞行为背后的分子机制铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从新鲜或冷冻的大鼠脑组织中分离细胞，以进行目标神经元或特定细胞类型的荧光激活细胞分选。