土壤中微生物磷脂脂肪酸的提取与分析

本实验方案的总体目标是通过鉴定磷脂脂肪酸，提供有关土壤微生物群落结构的信息。该方法有助于回答科学领域的一些关键问题，例如表征土壤微生物对土地管理变化或自然干扰的响应。该技术的主要优势在于其操作简便、稳健可靠，可广泛应用于多种类型的土壤。

本实验方案将由我们研究团队的技术员 Katelyn Pretzlaff 演示。开始提取前，按照文本方案所述配制 5.0 摩尔的氢氧化钾和 0.15 摩尔的柠檬酸盐缓冲液。每天需将储备液 250 微升用 25 毫升氯仿稀释，配制 19:0 非十七烷酸酯替代标准品。

这可为23个样品的一批样本提供足够的替代标准品。向样品离心管中加入0.5毫升19:0替代标准溶液。对土壤样品进行Bligh和Dyer提取时，先加入2.0毫升柠檬酸盐缓冲液，然后加入2.5毫升氯仿，最后加入5.0毫升甲醇。

用聚四氟乙烯（PTFE）衬垫盖子密封样品，涡旋振荡30秒。然后将样品置于翻转摇床中孵育2小时。孵育结束后，保持盖子闭合，以226 × G离心15分钟。

用巴氏吸管将上清液吸出，并转移至已标记的45毫升玻璃小瓶中。向每个样品中加入第二轮Bligh和Dyer提取剂，重复振荡和离心步骤。再次用巴氏吸管吸出上清液，并转移至同一个已标记的45毫升玻璃小瓶中。

接下来，向含有上清液的已标记45毫升玻璃小瓶中加入5.0毫升氯仿和5.0毫升柠檬酸盐缓冲液。用带白色聚四氟乙烯（PTFE）衬垫的瓶盖密封小瓶，涡旋振荡30秒。小心地用真空法移除45毫升小瓶中的上层水相。

用移液器将下层有机相移入已标记的15毫升小瓶中。将一批15毫升小瓶置于室温下的压缩氮气环境中，以避免氧化。缓慢蒸发氯仿，调节氮气流速，使液面表面产生轻微扰动，但不沿小瓶壁上升。

拧上带聚四氟乙烯衬垫的盖子，用铝箔包裹样本后于零下20摄氏度冷冻保存。根据需要标记新的固相萃取（SPE）柱。将带有出口阀的固相萃取柱支架置于玻璃容器上，并将已标记的萃取柱插入出口阀中。

用移液管向每根层析柱中加入 5 毫升丙酮，使其流过以平衡层析柱。随后，分两次每次加入 5 毫升氯仿。待第二次氯仿洗涤液流出至距柱床约 1 毫升处时，关闭活塞。

向小瓶中加入0.5毫升氯仿，轻轻涡旋，使样品重新溶解。使用巴斯德移液管将重新溶解的样品转移至固相萃取柱中。将脂质样品直接加在柱子中心位置，并让溶剂完全流入收集罐中。

通过向每根柱中加入5毫升氯仿来洗脱中性脂质。让溶剂完全流入收集罐中。通过向每根柱中加入5毫升丙酮来洗脱糖脂，使溶剂完全流入收集罐中。

从储液罐中取出柱架，并使用真空装置排空储液罐。将装有洁净且已标记的离心管的试管架插入储液罐中，然后将柱架重新放回储液罐上。上方标记的柱位应与下方标记的离心管位置对齐。

通过向每根柱子加入5毫升甲醇，将磷脂洗脱至离心管中。在通风橱中等待固相萃取柱完全干燥后，再进行废弃处理。在室温下用压缩氮气将磷脂组分吹干。

用氮气吹扫管子后，拧紧带聚四氟乙烯衬垫的盖子，用铝箔包裹样品，并在零下20摄氏度的冰箱中保存。打开设定为37摄氏度的热水浴，将样品从冰箱中取出，使其恢复至室温。

向每个样品中加入 0.5 毫升氯仿和 0.5 毫升甲醇，随后加入 1.0 毫升甲醇氢氧化钾。用聚四氟乙烯衬垫盖子紧密封盖试管，并轻轻涡旋混匀。将密封的样品置于 37°C 水浴中反应 30 分钟。

确保水位至少高于样品液面一到两毫米。在样品置于水浴期间，用样品编号标记小型玻璃小瓶。30分钟后，取出样品并使其冷却。

接下来，向每个样品中加入 2.0 毫升正己烷并涡旋混匀。然后，向每个样品中加入 0.2 毫升 1.0 摩尔/升的乙酸，再次涡旋混匀。此时应可观察到相分离现象。

向每个样品中加入 2.0 毫升蒸馏水以破坏相分离。将样品涡旋振荡 30 秒后，在 226 ×g 条件下离心 2 分钟。使用短巴斯德吸管，将上层相转移至洁净、已标记的 10 毫升小瓶中。

注意不要转移任何下层水相。向每个样品离心管中加入 2.0 毫升己烷并轻轻涡旋。将样品涡旋振荡 30 秒，然后按之前步骤进行离心。

使用短巴斯德吸管，再次将上层相加入已标记的10毫升玻璃小瓶中。在室温下用氮气吹干已标记的10毫升玻璃小瓶中的溶剂。拧紧聚四氟乙烯（PTFE）衬垫盖，并用铝箔包裹样品。

将样品在-20摄氏度的冰箱中保存，直至按照文中所述实验方案进行气相色谱分析。下图显示的是采用火焰离子化检测器对样品进行毛细管气相色谱分析所获得的代表性色谱图。括号中以分钟为单位标出了各磷脂脂肪酸（PLFA）的保留时间。

可将所有磷脂脂肪酸（PLFA）的响应值相加，以获得每克土壤中总PLFA生物量（单位：纳摩尔）。还可以计算并比较不同土壤中各类PLFA的相对分布情况。结果表明，地点一（位于较老树木下方）的土壤总PLFA含量较高，其次是地点二（位于中龄树木下方）的土壤。

最后是第三采样点最年轻树木下方的土壤。相对而言，最年轻的样地含有较多的饱和磷脂脂肪酸（PLFA），而最老的样地则含有较多的不饱和磷脂脂肪酸。PLFA结果可进一步采用多元排序技术进行分析，例如此处所示的非度量多维尺度排序（non-metric multidimensional scaling ordination）。

最年轻的样地与另外两个较老的样地明显分离，而后两者在PLFA微生物群落组成上表现出重叠。括号内显示了每个轴所解释的PLFA群落数据变异量。掌握该技术后，一个人可在四天内处理20个样品。

在进行本实验方案时，需注意脂质特别容易发生氧化。因此，必须保护样品免受空气和光照的影响，例如将样品保存在避光且充有氮气的环境中。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过磷脂脂肪酸的鉴定来定量分析土壤微生物群落结构，该过程包括三个步骤：脂质提取、脂质分离和脂质甲基化。