Name: 对于益生菌发酵食品的小规模生产新生产协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学习使用基础设备和小规模发酵技术生产益生菌发酵乳饮料的方法。该方案采用干细菌发酵剂培养物，通过巴氏杀菌和pH监测，为资源匮乏地区提供可持续的营养改善方案。

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作者感谢东非乳品发展项目（EADD）在乌干达农村地区为乳品合作社提供发酵乳制品生产培训所给予的实地实践支持。感谢CSK食品强化公司负责发酵剂的生产、质量控制及发酵能力评估。感谢奥地利Lactosan GmbH &amp;#38; Co提供生产协助。作者感谢荷兰Zeist市TNO微生物学与系统生物学研究所的Karin Overkamp进行高效液相色谱（HPLC）分析，以及乌干达工业研究所（UIRI）的Derrick Assimwe在乌干达录制作者声明。这些录制工作是在2016年5月于乌干达恩德培举行的“为生命而发酵食品”项目（CIFSRF第二阶段）启动会议期间进行的，该会议由国际发展研究中心（IDRC）资助。感谢阿姆斯特丹自由大学（VU University Amsterdam）和Micropia博物馆提供资金支持及实验室设施，用于制作本文所述视频。作者感谢Wim van Egmond对酸奶细菌进行显微镜观察。

1. 新鲜启动剂的制备
为制备新鲜发酵剂，取1 L超高温（UHT）处理的牛奶或新鲜牛乳。若使用UHT牛奶，请进行步骤1.3；若使用新鲜牛乳，请进行步骤1.1。
<ol>
	<li>鲜牛奶的检测
	<ol>
		<li>进行感官检测以判断牛奶是否存在异常或变质情况，需观察牛奶的外观并嗅闻其气味。</li>
		<li>进行煮沸滤布试验时，取少量牛奶置于汤匙中。将汤匙置于热源上方，直至牛奶开始沸腾。将汤匙移离热源，观察牛奶中是否出现凝块，凝块的出现表明牛奶质量不佳。</li>
		<li>进行乳稠度计检测时，将牛奶倒入高度至少为15 cm的量筒、烧杯或其他中空容器中。将乳稠度计放入牛奶中。在30 °C时，乳稠度计读数为28或更高，表明牛奶密度足够，未掺水。</li>
		<li>进行乙醇试验时，用蒸馏水配制80%的乙醇溶液。取等量的牛奶与等量的80%乙醇混合，例如在杯中将一茶匙牛奶与一茶匙80%乙醇混合。观察混合液中是否出现凝块，凝块的出现表明牛奶质量不佳。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若使用鲜牛奶，需用筛子或滤布（孔径0.1 - 0.5 mm）进行过滤，滤布应事先在沸水中巴氏消毒15分钟。</li>
	<li>巴氏消毒
	<ol>
		<li>将牛奶倒入一个小锅中，并盖上锅盖。将小锅放入一个稍大的锅中，在大锅中加水，水位至小锅边缘下方约2 cm处。</li>
		<li>使用适当的热源（e.g., 电加热、燃气灶、炭炉、柴火）加热该装置，直至牛奶温度达到85 °C，使用实验室温度计进行测量。</li>
		<li>将热源调至低温，维持牛奶温度在85 °C持续30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将盛有牛奶的小锅从热水中取出，静置冷却。可选择将小锅放入盛有冷水的容器中以加快冷却速度。除测量温度外，不得打开锅盖。</li>
	<li>待牛奶冷却至45 °C（使用实验室或厨房温度计测量）。此时，将牛奶转移至保温瓶中，并通过加入一份发酵剂（1 g）进行接种。</li>
	<li>将接种后的牛奶在保温瓶中静置16小时，使其完成发酵过程。检测发酵后牛奶的最终pH值，应为4.4或更低，使用pH计或pH试纸进行测量。</li>
	<li>发酵完成后，搅拌或摇动产物约5 - 10分钟，以获得均匀细腻的质地。</li>
	<li>储存至下一步操作。
	<ol>
		<li>家庭生产时，将新鲜发酵剂倒入冰格中，制成10 ml的冰块。将冰块放入深冷冰箱（-18 °C）中冷冻，并在3个月内进行第2节操作。</li>
		<li>在资源有限条件下进行最大100 L规模的生产时，进行第3节操作，确保在完成步骤1.5后16小时开始步骤3.5。或者，在步骤1.6完成后将新鲜发酵剂放入冰箱（7 °C）冷藏，并在5天内进行第3节操作。</li>
		<li>若需生产多种非乳基发酵食品，请进行第4节操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 家庭水平小批量生产
<ol>
	<li>使用任意方便量的牛奶（建议 1 - 10 L）。</li>
	<li>执行步骤 1.1。</li>
	<li>执行步骤 1.2。</li>
	<li>巴氏杀菌
	<ol>
		<li>将牛奶倒入一个小锅中，并用盖子盖紧。将小锅放入一个稍大的锅中。向大锅中加水，水位至小锅边缘下方约 2 cm 处。</li>
		<li>使用适当的热源（e.g.，电加热、燃气炉、炭炉、柴火）加热该装置，直至牛奶温度达到 60 °C，使用实验室或厨房温度计测量。</li>
		<li>可选：此时可加入糖，建议浓度为 5%（w/v），使用天平称量。用已通过浸入沸水中 15 分钟进行过巴氏杀菌的搅拌勺充分搅拌。继续加热，直至牛奶温度达到 85 °C，使用实验室或厨房温度计测量。</li>
		<li>将热源调至低温，维持 85 °C 温度 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>执行步骤 1.4。</li>
	<li>让牛奶冷却至 45 °C，使用实验室或厨房温度计测量。此时，每升牛奶加入一个冰块（按第 1 节方法制备），并将牛奶转移至真空保温瓶中。</li>
	<li>将接种后的牛奶置于真空保温瓶中，使其发酵，直至 pH 达到 4.4，使用 pH 计或 pH 试纸测量。预计发酵时间为 12 小时。</li>
	<li>执行步骤 1.7。</li>
	<li>将发酵后的牛奶转移至冰箱（7 °C）中，冷藏至少 3 小时后方可食用。在适当冷藏条件下储存时，产品最好在一个月内食用完毕。</li>
</ol>
3. 资源匮乏国家农村地区的生产
注意：每1升新鲜启动剂最多使用100 L牛奶。
<ol>
	<li>执行步骤 1.1。</li>
	<li>执行步骤 1.2。</li>
	<li>巴氏杀菌：
	<ol>
		<li>将牛奶转移至合适大小的牛奶罐中，并用盖子密封罐子。将罐子放入一个较大的盆中。向盆中加水，直至水位达到尽可能高的水平。</li>
		<li>使用适当的热源加热该装置（木火加热速度最快，通常也最具成本效益），直至牛奶温度达到 60 °C，使用实验室或厨房温度计进行测量。</li>
		<li>可选：根据口味偏好，按每升 50 g 的比例加入糖。使用先前通过在沸水中浸泡 15 分钟进行巴氏杀菌的搅拌勺充分搅拌。继续加热，直至牛奶温度达到 85 °C，使用实验室或厨房温度计进行测量。</li>
		<li>降低加热强度，将温度维持在 85 °C 持续 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将盛有牛奶的罐子从水盆中取出，使其冷却。为加快冷却过程，可将罐子转移至装有冷水的盆中。除测量温度外，不得打开罐盖。</li>
	<li>让牛奶冷却至 45 °C，使用实验室或厨房温度计进行测量。将罐子从冷水盆中取出。此时，通过加入完整的鲜制发酵剂对牛奶进行接种（此步骤不会过量）。</li>
	<li>用毯子包裹牛奶罐，以达到隔热和防止温度快速下降的目的（理想情况下，温度应保持在 45 至 35 °C 之间）。将接种后的牛奶留在罐中，使其发酵，直至 pH 值达到 4.4。该过程大约需要 12 小时。</li>
	<li>从罐子上取下毯子并打开罐子。
	<ol>
		<li>可选：去除发酵牛奶表面的水状上层液体，以获得质地更顺滑的益生菌发酵牛奶（酸奶）。</li>
		<li>可选：添加食品级人工香精（例如草莓或香草），例如以 0.1% (v/v) 的浓度添加，使用 10 ml 量杯或勺子计量（根据香精浓度和客户偏好调整）。</li>
		<li>可选：添加防腐剂。一种经济且安全的选择是使用山梨酸钾，最大浓度为 0.12 g/L（来源：http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/4144 建议每日摄入量为 3 mg/kg 体重）。 
		注意：体重低于 10 kg 的幼儿在摄入 250 ml 发酵牛奶时，摄入的山梨酸钾不应超过 30 mg，相当于每 50 L 发酵牛奶中添加约 2 汤匙的剂量。</li>
		<li>使用先前通过在沸水中浸泡 15 分钟进行灭菌的金属勺充分搅拌发酵牛奶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选：将发酵牛奶分装，转移至冰箱（7 °C）中，至少冷却 3 小时后再食用。 
	注意：若在低于 7 °C 的适当冷藏条件下储存，产品最好在两周内食用完毕。若在适当冷藏条件下储存，并按 3.7.3 所述添加防腐剂，则产品最好在四周内食用完毕。</li>
</ol>
4. 其他发酵食品的生产
本部分介绍除发酵乳以外、最大体积约为50 L的发酵食品的制备方法。
<ol>
	<li>将纱布浸入沸水中至少15分钟以进行巴氏消毒。用绳子或橡皮筋将纱布松松地绑在一个容量约为2 L的碗或盆上。</li>
	<li>将新鲜的发酵剂倒在纱布上，避免溢出，并确保碗底与纱布之间留有足够的空间。</li>
	<li>将碗放入约7 °C的冰箱中静置8–12小时，直至约有0.5 L乳清从酸奶中滤出并流入碗中。</li>
	<li>利用滤出的乳清制作不同类型的发酵食品。示例如下： 
	注意：所获得的发酵食品将含有乳清（牛奶）。牛奶及其衍生物被公认为最常见的引发食物过敏和不耐受的成分之一。
	<ol>
		<li>制作以高粱或小米为基础的乌干达饮品Obushera，请遵循Mukisa et al.22所述的实验方案。</li>
		<li>制作以玉米或高粱或两者混合制成的肯尼亚粥品Uji，请遵循肯尼亚乔莫·肯雅塔农业技术大学所采用并由Kort et al.15描述的实验方案。</li>
		<li>制作以高粱为基础的布基纳法索饮品Zomkom，请遵循Christèle et al.23和Kort et al.15所述的实验方案。</li>
		<li>制作广泛流行于非洲南部的猴面包树果实与牛奶制品Mutandabota，请遵循Mpofu et al.24所述的步骤。注意：对于此产品，可直接使用第1节中获得的新鲜发酵剂，无需先执行步骤4.1–4.3。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Wilbert Sybesma 和 Remco Kort 是 Yoba for Life 基金会的创始人。Yoba for Life 是一家非营利组织，已获荷兰税务机关认证为公共慈善机构（PBI），旨在促进非洲地区发酵产品的本地化生产与消费。该基金会本身并不以商业形式销售使用 Yoba 菌种发酵剂制成的发酵产品（包括酸奶、zomkom、obushera 和 mutandabota），而是致力于推动本地化生产和本地所有权，为非洲食品行业的创业者创造增收机会。Yoba for Life 基金会通过合作伙伴与志愿者网络，分发和销售含有干燥细菌发酵剂的即用型小袋，以支持非洲本地通过可控的细菌发酵方式生产乳制品和谷物类食品。

本文所述的简易生产方案利用基本设备和一种新型发酵食品菌种，有助于在资源匮乏国家的家庭和农村环境中生产高质量的益生菌发酵乳。对乳品进行至少30分钟的巴氏杀菌至关重要，以实现腐败微生物及潜在致病微生物的充分减少或消除。此外，充分加热会导致乳清蛋白17变性，随后与酪蛋白胶束25结合，从而在发酵乳中形成交联结构26。因此，与加热程度较低的乳品相比，最终产品的黏度得以提高27。同时必须注意避免在高于45 °C的温度下接种，因为温度过高会导致细菌失活。
同样，如果条件允许且成本效益较高，建议使用超高温灭菌（UHT）牛奶，尤其是在制备新鲜发酵剂时。首先，UHT 牛奶几乎不含不需要的微生物。其次，UHT 牛奶中的乳清蛋白已发生广泛变性，使其更易于被细菌蛋白酶作用，促进蛋白降解及酸奶菌种的后续生长。在冷却过程中，部分蛋白质会重新折叠至其天然构象，因此在接种前重新加热有利于酸奶的生产。长时间发酵会导致发酵乳的 pH &#60; 4.4，这通常是不理想的。可通过将发酵乳及时放入冰箱中来终止发酵过程。
非洲本地生产的酸奶已被发现含有较高水平的乳球菌28，例如L. lactis，这类菌可产生具有苦味的肽29–32，而这种味道通常是不受欢迎的31。因此，发酵过程必须在45至35 °C之间的温度下进行15,28。由于在半控环境中发酵时温度会逐渐下降，接种操作需在允许的最高温度45 °C下进行。发酵过程中必须提供充分的保温，以避免温度降至35 °C以下。
在农村环境下手工制作酸奶，存在较高的微生物污染风险，尤其是腐败微生物的污染。酵母菌能够在酸奶的酸性条件下生长繁殖。酵母污染可能导致在培养阶段或储存期间产生过量气体，从而立即导致酸奶变质，或显著缩短其保质期33,34。每次与牛奶或酸奶接触前，对所有器具和设备进行热力灭菌和/或使用次氯酸钠清洗，可将酵母污染水平降至最低。特别是在发生酵母腐败后，必须进行严格而彻底的灭菌和清洁，以彻底消除污染。
上述列出的风险清楚表明，该生产方案在资源匮乏国家的应用成功程度受限于其手工操作特性，以及由此导致的更高的腐败变质率。在缺乏冷藏设施或电力供应极不稳定的社区，腐败变质率甚至更高。此外，无法获得价格合理的高质量包装材料也可能限制该方案的推广使用。所需设备虽基本且通用，但实验室或厨房用温度计必不可少。最后，目前仅有少数国家具备生产冻干发酵剂的能力。大多数资源匮乏的国家缺乏此类设施，因而依赖进口来获取该产品。
在各类食品中，发酵乳制品（包括酸奶）是益生菌最常用的载体。生产发酵乳制品除了需要温度计外，无需特殊设备。因此，将上述第一代通用益生菌 starter culture13 与简单的生产工艺相结合，几乎可在任何地点由任何人安全、可控且可重复地生产益生菌发酵乳制品，包括在资源匮乏国家的农村地区进行家庭或小作坊式生产。传统自然发酵工艺无法保证益生菌含量的稳定性9。以1克小袋包装的自稳定型 starter culture 可使小规模生产者以较低成本生产发酵食品，无需购买大量 starter culture，避免因包装开启后菌种活力下降（尤其是在室温及高相对湿度条件下储存时）造成浪费——据我们所知，目前市面上所有其他酸奶 starter culture 均存在此类问题。此外，由于本方案中描述的预培养方法可在本地大量扩增菌种，所需进口的干燥菌体量极低，不足最终产品中益生菌浓度的0.1%。
本文详细描述了发酵乳的生产过程，这是掌握益生菌发酵食品制作工艺的第一步，随后可将该技术应用于发酵多种其他类型的食品（如本文所述）。为进一步提升基础发酵乳的品质，下一步可尝试生产真果发酵乳。这需要制备无菌的水果果酱（由水果、糖及可选的某些添加剂混合而成），或购买现成的水果果酱，在发酵完成后与发酵乳混合35,36。

本文介绍了一种生产方案，该方案利用已证实具有健康益处的发酵剂培养物，可制备营养丰富且含益生菌的发酵乳及其他益生菌发酵食品。该方案稳定可靠，操作简便，适用于任何地点的人员操作，包括资源匮乏的国家。
在撒哈拉以南非洲，21%的儿童死亡 &#60; 5年齡段的死亡原因中，腹瀉是致死因素1，其中29%特别由轮状病毒病因引起2已证明，每天食用含有推荐剂量为1 x 10⁹ CFU的发酵食品10 菌落形成单位（CFU）的 L. rhamnosus GG促进肠道健康并降低轮状病毒相关性腹泻的发生率和严重程度3-7.
有益细菌广泛存在于撒哈拉以南非洲地区的各种传统发酵食品中8-10。然而，这些食品几乎完全由家庭自制，保质期相对较短，并且由于发酵过程缺乏控制，存在较高的安全风险11。此外，由于城市化进程以及非洲地区饮食结构普遍趋向西方化，传统发酵食品的消费量正在下降10,12。
在L. rhamnosus GG的原始专利过期后14，引入了一种通用的益生菌L. rhamnosus yoba 201213，其与L. rhamnosus GG完全相同。干燥的种子培养物的水分活度（Aw）约为0.1，在室温下储存至少一年后仍能保持较高的存活率（数据未显示）。
种子培养物以每份1 g进行分装，可用于生产最多100 L发酵乳。若每天生产一至两批次，使用该发酵剂培养物可利用每日新鲜牛奶实现每周最高1,000 L的生产能力。
使用 L. rhamnosus yoba 2012 与 S. thermophilus C106 作为辅助培养物，可使益生菌 Lactobacillus 得以增殖15，这种独特的细菌组合此前未见其他研究者报道。该生产工艺包括将一包冻干发酵剂（1 g，即种子培养物）重新悬浮于 1 L 牛奶中，在 16 小时的培养后形成所谓的“新鲜发酵剂”。随后，该新鲜发酵剂可用于接种最多 100 L 的牛奶。这种预培养方法减少了冻干菌种的使用量，从而相较于直接培养法（例如 Goff 所描述的方法16）降低了生产成本。本文所述方案所采用的制剂方式保留了冻干发酵剂的优点，如良好的储存稳定性、便于保存和操作，从而实现高度可重复的发酵过程。
此外，本文所述的生产方案不需要高科技设备，而发达国家常用的标准化生产方法则需要17。
最后，这种新鲜发酵剂可用于接种其他（非乳制品）原材料，以生产多种发酵食品，这一点已成功应用于乌干达（前两种）、肯尼亚和布基纳法索的传统谷物发酵食品Obushera、Kwete、Uji和Zomkom15。这仅是非洲开发的大量发酵食品中的一小部分18。
发酵是指通过酶和/或微生物的作用，将淀粉、糖类和蛋白质等大分子物质分解为更易消化产物的过程。在撒哈拉以南非洲地区，发酵是一种广泛应用的技术，与干燥和盐渍相结合，可在缺乏冷藏设施或罐装等工业技术的条件下实现食品保藏9,19。传统发酵常采用回接法（back-slopping），即在新一批原料中加入前一批发酵产物的一小部分，以促进发酵进程并降低发酵失败的风险11。Harrison 和 Tomkins20 描述了多种以玉米、高粱或小米为基础的传统非洲发酵食品，并指出这些食品在婴幼儿断奶过程中具有积极作用，例如可减少儿童腹泻及其相关死亡率。Nout 和 Sarkar19 介绍了在西非广泛食用的一种发酵木薯食品的传统制作方法。Franz 等.9 对非洲传统发酵食品进行了系统分类和详尽描述，将其分为谷物和蔬菜类食品、富含淀粉的根茎类作物食品以及动物蛋白类食品。此外，Narvhus 和 Gadaga21 特别描述了非洲传统发酵乳制品的生产过程。
对于益生菌发酵乳（或其他发酵食品）的生产，尤其是在家庭生产的情况下，拥有冰箱有利于将新鲜发酵剂分装冷冻保存。在资源匮乏的国家，产奶社区可以很好地开展发酵乳的生产。目前在乌干达当地社区的实践经验表明，奶业合作社是利用自有奶源开展酸奶生产的合适主体。拥有奶罐较为有利，尽管也可使用较大的锅具来制备大批量发酵乳，但效果稍差。此外，在资源匮乏国家，电力供应以及由此带来的当地商店和摊点具备冷藏设施，有助于扩大业务规模并减少因腐败造成的损失。然而，正如本实验方案中将讨论的，通过添加山梨酸钾，可在室温下将酸奶保存数天，从而在电力供应不稳定的情况下减少腐败变质。

<table><tbody><tr><td>Yoba 起始发酵剂</td><td>Yoba for Life 基金会</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>牛奶</td><td>从当地奶牛获取</td><td>-</td><td>新鲜全脂牛奶，不含抗生素，来自健康奶牛</td></tr><tr><td>可选添加糖</td><td>在当地超市购买</td><td>-</td><td>使用了蔗糖，但甜菜糖也可用，需无杂质</td></tr><tr><td>实验室温度计</td><td>Narang Scientific Industries</td><td>TM-01</td><td></td></tr><tr><td>乳脂计</td><td>Narang Scientific Industries</td><td>LM-01</td><td></td></tr><tr><td>96% 乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>476226</td><td></td></tr><tr><td>pH 试纸</td><td>Macherey-Nagel GmbH &amp; Co</td><td>90206</td><td></td></tr><tr><td>纱布</td><td>Beyond Gourmet</td><td>-</td><td>任何高质量食品级纱布均可使用</td></tr><tr><td>筛子/滤网</td><td>Cuisinart</td><td>CTG-00-3MS</td><td>任何细网筛子均可使用，但推荐不锈钢材质</td></tr><tr><td>1 L 保温瓶</td><td>在当地仓库购买</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>1 L 锅具 + 盖子</td><td>在当地仓库购买</td><td>-</td><td>不锈钢材质</td></tr><tr><td>2 L 锅具</td><td>在当地仓库购买</td><td>-</td><td>任何耐热且防水的材料均可使用</td></tr><tr><td>50 L 锅具</td><td>在当地仓库购买</td><td>-</td><td>任何耐热且防水的材料均可使用</td></tr><tr><td>牛奶桶</td><td>Narang Scientific Industries</td><td>MC-SS-30</td><td>任何不锈钢牛奶桶均可使用</td></tr><tr><td>毯子</td><td>在当地仓库购买</td><td>-</td><td>毯子越厚，保温效果越好</td></tr></tbody></table>

新型小规模益生菌发酵食品生产方案

Novel Production Protocol for Small-scale Manufacture of Probiotic Fermented Foods 

将一种新型的干燥细菌复合物——Lactobacillus rhamnosus yoba 2012 与 Streptococcus thermophilus C106，在1 L牛奶中进行培养。这种新鲜发酵剂可用于家庭或资源有限的农村地区小规模生产发酵乳及其他发酵食品。制备新鲜发酵剂时，将1 L牛奶置于一个可放入较大水浴锅中的容器内，加热。在水浴中将牛奶加热至85 °C，并在此温度下保温30分钟。随后将牛奶冷却至45 °C，转移至保温瓶中，接入干燥菌种，并在30 °C至45 °C条件下静置至少16小时。为便于家庭频繁使用，可将新鲜发酵剂冷冻成冰块，用于制备最多2 L的发酵乳。在资源匮乏国家进行小规模生产时，可将最多100 L牛奶置于奶罐中，再将奶罐放入盛水的大锅内，通过明火加热水浴，使牛奶在85 °C下巴氏杀菌30分钟，之后冷却至45 °C。接着，向该100 L牛奶中接种前述新制备的1 L发酵剂。为确保在30 °C至45 °C之间有效发酵，需将奶罐用毛毯包裹保温12小时。若用于生产非乳基发酵食品，可将新鲜发酵剂置于 cheesecloth（纱布）中静置12小时，收集滤出的乳清，随后可用于接种多种食品原料，包括蔬菜和谷物类食品。

表1左侧展示了方案第1部分的示意图，右侧则为第2和第3部分的通用组合示意图。
采用本文所述的生产方案，对接种了种子培养物的牛奶的发酵过程进行了记录。图1展示了新鲜发酵剂的发酵过程（如第1节所述）。图2展示了发酵乳（终产品，如第2和第3节所述）的发酵过程。由于在农村地区实际操作中严格控制温度较为困难，因此实验在37 °C和45 °C条件下进行了测定。
在37 °C条件下进行发酵时，两种试样小袋的酸化曲线在指数级酸化开始时间上显示出约30分钟的微小差异，该差异在新鲜发酵剂和最终产品的生产过程中均存在。经过16小时后，两种培养物的最终pH值相同。
典型pH值和扩增后的滴度 L. rhamnosus 和 S. thermophilus 菌株 可在以下所述不同发酵食品的生产流程中找到 表2细胞计数用于 L. rhamnosus 和 S. thermophilus 分别采用常用的微生物平板计数法，在MRS琼脂培养基和LM17上测定。最终的菌体计数结果 L. rhamnosus yoba 2012 年为 1.7 x 107，3.7 × 109 和 3.3 × 109 CFU/ml-1 分别为发酵乳、kwete 和 uji。发酵乳和 kwete 的最终 pH 值分别为 4.3 和 4.2。初步结果表明，发酵前添加山梨酸钾不会产生负面影响，反而会增加活菌数量 L. rhamnosus yoba 2012 细菌在酸奶生产两周后的含量（数据未显示）。
图3展示了非发酵牛奶与发酵牛奶经高效液相色谱（HPLC）结合示差折光（RI）检测器分析的结果。结果显示，牛奶中的乳糖含量降低，而乳酸和半乳糖含量升高，这是接种菌种代谢活性的结果。
<img alt="pH 随时间变化曲线；显示 16 小时内 pH 下降；生化反应分析；数据趋势。" src="/files/ftp_upload/54365/54365fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 
图 1. 由半脱脂牛奶（1.5% 脂肪，3.5% 蛋白质）制备的新鲜发酵剂的发酵曲线。 1 升牛奶接种一袋（1 g）发酵剂菌种后，在 37 °C（••••，重复实验）和 45 °C（- - - -，重复实验）下培养 16 小时。图中插入的直线（----）位于 pH 4.4，用于指示发酵终点的判定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54365/54365fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="pH 随时间变化的曲线图，显示酸化过程，科研数据分析趋势趋近于 pH 4.5。" src="/files/ftp_upload/54365/54365fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 由半脱脂乳（1.5% 脂肪，3.5% 蛋白质）制成的发酵乳（终产物）的发酵曲线。 1 升牛奶接种 20 克新鲜发酵剂后，在 37 °C（••••，重复实验）和 45 °C（- - - -，重复实验）下发酵 16 小时。在 pH 4.4 处绘制的直线（----）用于指示发酵终点。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54365/54365fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="色谱图，折射率 vs. 时间，显示乳糖、半乳糖、乳酸峰。" src="/files/ftp_upload/54365/54365fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 未发酵牛奶（黑色）与使用种子培养物发酵16小时后的牛奶（蓝色）的HPLC洗脱图谱。 洗脱图谱显示乳糖被消耗，同时生成半乳糖和乳酸。糖类和弱酸根据紫外吸收和折射率的保留时间以及峰面积比进行鉴定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54365/54365fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="发酵乳制品生产流程图；方法包括质量检测、巴氏杀菌和发酵剂培养物的应用。" src="/files/ftp_upload/54365/54365tbl1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表 1"> 
表 1. 发酵剂培养物应用方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54365/54365tbl1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本表的放大版本。</a>
<img alt="发酵过程表；细菌在牛奶和谷物基质中的生长数据，pH值，温度分析" src="/files/ftp_upload/54365/54365tbl2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表 2"> 
表2. 扩增 鼠李糖乳杆菌 yoba 2012 在多种发酵食品中 数据来自 Kort 等15. 发酵在以下条件下进行 37 °C 除非另有说明。细胞计数的 L. rhamnosuss yoba 2012 和 S. thermophilus 接种后C106的数值在1 x 10之间均有变化6 和 1 × 107 CFU/ml-1. 功能性突变体bota使用仅含特定起始物的培养基制备 L. rhamnosus yoba 2012，由 Mpofu 报道 等24；ND，未测定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54365/54365tbl2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此表格的放大版本。</a>
补充文件。 非洲农村地区益生菌酸奶的本地生产与销售。镜头和图片摄于乌干达巴拉沃利和纳马盖拉，2016年5月。该视频展示了从原料奶接收、加工、包装、销售直至最终消费一批50 L益生菌酸奶的完整价值链，整个生产过程仅使用基本设备完成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54365/yoba_production_in_Uganda_suppl_material.mp4" target="_blank">请点击此处下载。</a>

本文描述了一种利用新型细菌发酵剂进行小规模生产益生菌发酵乳饮料的制备方案。

一种由干粉状细菌组合物构成的新配方，包含鼠李糖乳杆菌 yoba 2012 和嗜热链球菌 C106，在 1 L 牛奶中进行培养。该新鲜启动剂……

本方案的总体目标是利用非常基础的设备和技术，通过使用发酵剂培养物来生产营养丰富且含有益生菌的发酵乳及其他益生菌发酵食品。在东非地区，一克干燥的细菌发酵剂培养物可用于将一升已冷却至45摄氏度并转移至保温瓶中的巴氏杀菌乳，转化为一升益生菌饮用型酸奶。随后，该酸奶可作为发酵剂用于在牛奶罐中生产100升益生菌酸奶，相当于400杯每杯250毫升的塑料杯装饮用酸奶。该方法是一种极具突破性的创新，可为资源匮乏国家营养不良人群的营养与健康状况带来可持续改善。这些人群可能暴露于多种环境风险因素之下，易患具有严重后果的传染性疾病。该技术的主要优势在于操作简便，普适性强，便于所有人应用，尤其有利于资源匮乏国家的人群，他们将是该技术的最大受益者。此外，与牛奶相比，发酵过程使酸奶具有更高的附加值。该技术的应用之一在于对腹泻的预防、缓解和治疗，而腹泻仍是五岁以下儿童死亡的主要原因之一。事实上，这种发酵剂中存在的益生菌鼠李糖乳杆菌菌株已在多项独立的临床试验中显示出对腹泻具有防治效果。该方法可用于生产益生菌饮品酸奶，也可用于生产其他类型的发酵食品，例如谷物、蔬菜和水果类制品，如我们传统的奥布舍拉（obushera）、乌吉（uji）、克韦特（kwete）和穆坦达博塔（mutandabota）。对该方法进行可视化演示具有巨大优势，因为它使我们能够高效地向目标群体——主要是资源匮乏国家偏远地区的人群——教授并展示如何应用该技术。由Micropia实验室的技术员Justyne Laba演示牛奶的质量检测以及yoba酸奶的显微镜检查。通过感官检测判断牛奶是否存在异常或变质，需检查牛奶样品的外观和气味。进行煮沸凝固试验时，取一汤匙牛奶置于热源上加热，直至牛奶开始沸腾。然后将勺子从热源移开，观察样品是否凝固。对于乳稠度测试，将容器中装入至少15厘米高的30摄氏度牛奶，再将乳稠计放入牛奶中。若读数为28或更高，则表明牛奶密度足够，未掺水。进行乙醇试验时，将等体积的牛奶与80%乙醇的蒸馏水溶液混合。若牛奶出现凝块，则表明其质量不佳，不应使用。对新鲜牛奶进行巴氏消毒时，首先将牛奶通过已用沸水灭菌的孔径为0.1至0.5毫米的仪器过滤至小锅中。盖上锅盖，将锅放入一个稍大的锅中。向较大的锅中加水，水位至较小锅边缘下方约两厘米处，加热牛奶直至其温度达到85摄氏度（使用实验室温度计测量）。随后，将热源调至低温，保持85摄氏度恒温持续30分钟。巴氏消毒结束后，将盛有牛奶的容器从水中取出，但不要打开盖子。当牛奶冷却至45摄氏度时，将样品转移至真空瓶中，并加入一克相应的发酵剂进行接种。在真空瓶中发酵16小时后，确认发酵乳的pH值为4.4或更低。作为对照，首先检测牛奶的 pH 值，其值显示为 5.8 或更高。接着检测酸奶的 pH 值，显示为 4.3。将牛奶搅拌 5 至 10 分钟，以获得均匀的质地。然后，将10毫升新鲜的发酵剂转移至冰格盘的每个孔中，并将发酵剂在零下18摄氏度下保存长达三个月。冷冻的发酵剂现在可用于生产新鲜的益生菌酸奶。按照演示的方法，使用双层锅对牛奶进行巴氏灭菌。当牛奶温度达到60摄氏度时，按建议浓度5%（重量/体积）加入糖。使用经沸水灭菌的搅拌勺充分搅拌。随后继续加热牛奶，直至温度达到85摄氏度，温度测定可使用实验室或厨房温度计。当牛奶冷却至45摄氏度时，每升加入一粒冷冻的发酵剂进行接种，并将牛奶转移至相应数量的真空瓶中。让牛奶发酵至pH达到4.3或更低。然后搅动发酵后的牛奶以获得均匀细腻的质地，并在7摄氏度下冷藏至少3小时后再食用，或可冷藏保存长达一个月。在37摄氏度条件下进行发酵时，新鲜发酵剂与发酵后样品的酸化曲线在约30分钟时进入指数酸化阶段，其起始时间存在轻微差异。尽管如此，经过16小时后，两种培养物的最终pH值非常接近。此处展示了不同发酵食品中传代培养的L.Rhamnosus和S.thermophilus菌株的典型pH值和滴定度。高效液相色谱结合折光指数检测器对发酵和未发酵牛奶的分析表明，由于发酵剂菌种的代谢活性，牛奶中的乳糖含量降低，而乳酸和半乳糖含量增加。在本视频中，可以观察到发酵乳中存在乳杆菌和链球菌。一旦掌握了该过程，人们只需使用基本材料（如发酵剂、牛奶、锅和热源）即可轻松在一夜之间制作酸奶。完成该操作步骤后，重要的是要记得在第二天享用所制备的产物。通过本方案，您可以制备益生菌发酵食品，例如以谷物为基础的kwete。当然，具体实施取决于当地食材的可获得性、饮食习惯以及您的个人偏好。该技术使资源匮乏国家的民众能够通过本地生产与销售益生菌酸奶饮品来改善健康状况并增加收入。观看本视频后，您应充分了解如何利用发酵剂及极为基础的设备来生产营养丰富且富含益生菌的发酵乳制品。请注意，由于涉及巴氏杀菌步骤，实验过程中需使用明火并接触高温牛奶。因此，注意不要烫伤自己。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

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