Name: 可再生生物燃料及生化生产的非常规酵母基因工程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 了解非常规酵母解脂耶氏酵母Po1g的高效基因工程方法。通过敲除KU70基因显著提高同源重组效率，结合Cre/LoxP标记拯救系统实现多轮基因敲除，为生物燃料和生化生产中的菌株优化提供可靠平台。

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我们衷心感谢新加坡国家环境局（National Environment Agency of Singapore，ETRP 1201102）、新加坡国家研究基金会竞争性研究计划（NRF-CRP5-2009-03）、新加坡科技研究局（Agency for Science, Technology and Research of Singapore，1324004108）以及全球研究计划&amp;韩国知识经济部 #38;D 项目计划（N0000677）、美国国防威胁降低局（DTRA，HDTRA1-13-1-0037）以及新加坡国立大学合成生物学计划（DPRT/943/09/14）

1. 构建Y. lipolytica KU70基因缺失菌株
<ol>
	<li>敲除盒的构建 
	注意：参见 表1 用于所有聚合酶链式反应（PCR）扩增中所用引物。
	<ol>
		<li>设计引物 20 PCR 扩增 LEU2 表达盒（参见 表1) 来自一个 解脂耶氏酵母 表达载体，并在目标基因的5'端和3'端引入LoxP位点 LEU2 带有长正向引物的表达盒（#1； 表1）以及一段长的反向引物（#2； 表1），分别用于在克隆过程的后续步骤中引入额外的限制性酶切位点。 Bam引物#1中的HI限制性位点。</li>
		<li>使用高保真DNA聚合酶进行PCR，具体步骤如下所述 表 2.</li>
		<li>使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化PCR产物LoxP-启动子-LEU2-终止子-LoxP片段。按照制造商说明书，为纯化的PCR产物添加3'-A突出端。 21使用T4 DNA连接酶将A尾PCR产物连接至TA克隆载体，以获得质粒T-LEU2。 表3.</li>
		<li>PCR 扩增 KU70 基因的 1 kb 5' 上游序列 KU70 使用引物#3/#4从该基因 解脂耶氏酵母 Po1g 基因组 DNA 22 按照 表 2使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化PCR产物。
		<ol>
			<li>用双酶切分别处理纯化的PCR产物和T-LEU2质粒 Sac二和 BamHI酶按照以下方式处理 表 4. 使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化消化后的混合物。利用T4 DNA连接酶将纯化并经消化的PCR产物与 SacII/BamT-LEU2 的 HI 位点以得到质粒 T-LEU2-5E 表3.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>PCR 扩增 KU70 基因 3' 下游 1 kb 序列 KU70 使用引物#5/#6从目标基因扩增 解脂耶氏酵母 Po1g 基因组 DNA 22 按照 表2使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化PCR产物。用限制性内切酶对纯化的PCR产物和T-LEU2-5E质粒进行双酶切消化。 否我与 NdeI 酶按照 表4.
		<ol>
			<li>使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化消化后的混合物。然后，将纯化并经消化的PCR产物连接至 否一/NdeT-LEU2-5E 的 I 位点，使用 T4 DNA 连接酶连接以获得质粒 T-KO 表3.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用限制性内切酶消化 T-KO 质粒 Sac二和 NdeI 酶按照 表4 以制备敲除盒（图1). 使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化消化后的DNA片段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感受态细胞制备与转化 解脂耶氏酵母 Po1g 菌株
	<ol>
		<li>感受态细胞制备
		<ol>
			<li>接种一环菌落 解脂耶氏酵母 从新鲜的酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）平板中挑取Po1g菌株，接种于100 ml三角瓶中的10 ml YPD培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖和50 mM柠檬酸缓冲液，pH 4.0）中。在30 °C下培养 &#176;C摇床培养箱中，225 rpm振荡培养20小时至饱和（OD600 约为15（使用分光光度计测定）。</li>
			<li>将细胞在室温下以 5,000 × g 离心 5 分钟，收集菌体。用 20 ml Tris-EDTA（TE）缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 7.5）洗涤细胞，并按照步骤 1.2.1.2 所述方法收集菌体。将细胞重悬于 1 ml 0.1 M 醋酸锂溶液（pH 6.0，用醋酸调节）中，在室温下孵育 10 分钟。</li>
			<li>分装感受态细胞（100 μL） &#181;l）分装至无菌的1.5 ml离心管中。立即进行下述转化步骤，或加入甘油至终浓度25%（v/v），于-80℃保存。 &#176;用于长期保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>转化
		<ol>
			<li>轻轻混匀10 &#181;10 毫克/毫升的变性鲑鱼精子 DNA 1-5 微升 &#181;纯化的破坏盒100微克及 &#181;l 感受态细胞，30 ℃孵育 &#176;15分钟，37°C</li>
			<li>加入700 &#181;40% 聚乙二醇（PEG）-4000（溶于 0.1 M 醋酸锂，pH 6.0）1 升，充分混匀，于 30 ℃孵育 &#176;225 rpm 条件下于摇床培养箱中振荡培养 60 分钟 
			注意：必须使用平均分子量为4000的聚乙二醇（PEG），而非常规酵母转化中常用的PEG-3350。</li>
			<li>将转化混合物置于39℃水浴中进行热激 &#176;C水浴60分钟。</li>
			<li>加入1 ml YPD培养基，30℃恢复培养2小时 &#176;C 和 225 rpm。在室温下以 9,000 x g 离心 1 分钟，弃上清液，将沉淀重悬于 1 ml TE 缓冲液中。</li>
			<li>通过在室温下以 9,000 x g 离心 1 分钟使细胞重新沉淀，弃去上清液。将沉淀重悬于 100 &#181;TE缓冲液，并涂布于选择性平板上（例如，亮氨酸缺陷平板），于30℃培养 &#176;2-3天，4°C</li>
			<li>挑取4到10个单菌落，分别接种于2 ml YPD培养基中，30℃过夜培养。 &#176;225 rpm 条件下于摇床培养箱中培养。通过 PCR 分析转化子的基因组 DNA 以鉴定阳性克隆 22 按照 表5 分别使用引物对 #55/#56 和 #56/#57。 
			注意： 否将线性化的 pYLEX1 载体转化入 解脂耶氏酵母 Po1g 感受态细胞，通过计数每单位形成菌落的菌落数（cfu）来确定转化效率 &#181;g 质粒 DNA 使用量 23.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 标记基因回收
<ol>
	<li>Cre表达质粒的构建
	<ol>
		<li>pYLEX1-CRE 和 pYLEX1-HPH 的构建
		<ol>
			<li>设计引物 20 扩增开放阅读框的PCR cre 和 hph在正向引物#82和#84的起始密码子上游添加一个额外的腺嘌呤核苷酸，并插入 Kpn在反向引物#83和#85的终止密码子下游引入I型限制性酶切位点。通过PCR扩增目标基因的开放阅读框。 Cre 和 hph 来自 pSH69（登录号 HQ412578） 24 按照 表 2.</li>
			<li>纯化两者 cre 和 hph 使用PCR纯化试剂盒按照制造商说明书纯化片段。将纯化后的两者进行消化 cre 和 hph 带有 KpnI 酶按照 表 4. 用双酶切消化 pYLEX1 质粒 Pml我与 KpnI 酶如上所述 表 4使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化消化产物。</li>
			<li>按照 T4 DNA 连接酶的使用说明进行操作 表3 连接纯化并消化的 Cre 和 hph 片段 Pml一/KpnI位点的 解脂耶氏酵母 表达载体，分别得到 pYLEX1-CRE 和 pYLEX1-HPH。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>pSL16-CRE-HPH 的构建
		<ol>
			<li>PCR 扩增启动子-基因-终止子片段 Cre 使用引物#86/#87从pYLEX1-CRE上扩增出两侧带有同源臂的片段 盐一/PstI 限制性酶切位点，按照 表 2使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化PCR产物。
			<ol>
				<li>用双酶切消化纯化的PCR产物和pSL16-CEN1-1 (227)质粒 25 与 盐我与 PstI 酶按照 表 4使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化消化后的混合物。随后，将纯化并消化的PCR产物在相应位点使用T4 DNA连接酶连接至pSL16-CEN1-1 (227)，构建pSL16-CRE。 表3.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>PCR 扩增启动子-基因-终止子片段 hph 使用引物#88/#89从pYLEX1-HPH中扩增，引物位于两侧 flank 区 Xho一/BglII型限制性酶切位点 表 2使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化PCR产物。
			<ol>
				<li>用双酶切分别处理纯化的PCR产物和pSL16-CRE质粒 Xho我与 BglII型酶按照 表 4使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化消化后的混合物。然后，将纯化并消化的PCR产物利用T4 DNA连接酶在相应位点连接至pSL16-CRE，以构建pSL16-CRE-HPH。 表3. 
				注意：所获得的 Cre 表达质粒 pSL16-CRE-HPH 携带可筛选的潮霉素 B 标记，是一种着丝粒型且可游离复制的载体图2).</li>
			</ol>
			</li>
			<li>使用适当的限制性内切酶对所有构建体进行酶切验证例如, 盐一/PstI，以从载体中切除插入片段）按照 表4.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cre重组酶介导的标记基因回收
	<ol>
		<li>将 pSL16-CRE-HPH 转化至感受态的 KU70 按照上述第1.2节所述转化方案，将转化后的细胞涂布于含潮霉素B的YPD平板（YPDH，含400 &#181;g/ml 潮霉素B），于30℃培养 &#176;2-3天，4℃</li>
		<li>按照以下步骤进行菌落PCR 表 5 使用引物#84/#85鉴定转化后含有pSL16-CRE-HPH质粒的阳性菌落。 
		注意：上游引物#84和下游引物#85位于编码区内部 hph 基因表1只有阳性克隆能在PCR反应中产生特异的PCR产物。</li>
		<li>挑选一个阳性克隆，接种于2 ml YPDH培养基中，在30 °C下振荡培养24小时。 &#176;C 摇床培养箱中，225 rpm 过夜培养至饱和。测定细胞 OD600 使用分光光度计测定。在 OD 值达到指定条件时收获细胞600 约15。在室温下以5,000 x g离心5分钟，并用2 ml无菌水洗涤一次。</li>
		<li>将细胞重新接种至 2 ml YPD 培养基中，初始 OD600 0.1，并在30℃下培养细胞 &#176;225 rpm 条件下于恒温摇床中过夜培养。将过夜培养的菌液涂布于 YPD 平板，以分离单菌落。 23将菌落复制到YPD、YPDH和缺乏亮氨酸的平板上 23. 
		注意：已丢失两个标记的菌落 LEU2 标记基因和pSL16-CRE-HPH质粒只能在YPD平板上生长（图3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 醇脱氢酶和醇氧化酶基因的敲除
<ol>
	<li>使用基本局部比对搜索工具（BLAST）在 Y. lipolytica 基因组数据库中进行搜索，以鉴定待删除的候选基因26。将 S. cerevisiae 酒精脱氢酶 I 的蛋白质序列输入 BLAST 搜索工具（http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&amp;#38;db=yli&amp;#38;seqid=aa）。 
	注意：BLAST 搜索工具将返回 Y. lipolytica 基因组数据库中序列最相似的蛋白质。</li>
	<li>使用引物 #7 至 #56（表 1）通过 PCR 构建删除盒，并采用与上述第 1.1 节所述相同的方法进行限制性内切酶消化和连接反应。</li>
	<li>制备 KU70 基因敲除菌株的感受态细胞，按照上述第 1.2 节所述方案进行转化，并使用引物 #55、#58 至 #81（表 1）通过 PCR 鉴定阳性克隆。 
	注意：以 YALI0E17787g 基因的删除为例，其操作流程见图 4和图 5。文中还报道了 1 kb 和 2 kb 长度同源区域对同源重组效率的影响。</li>
</ol>

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<li>Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yarrowia+lipolytica%2C+a+yeast+model+for+the+genetic+studies+of+hydroxy+fatty+acids+biotransformation+into+lactones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Catal.+B-Enzym%22%5BJournal%5D)">Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones.</a> J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究的目标是实现快速高效地生成特定基因敲除 Y. lipolytica Po1g 菌株. 要实现这一点，需要考虑几个因素。首先，需要具有较高的转化效率。因此，需要一种高效且便捷的化学转化方案，用于 Y. lipolytica 本研究描述了Po1g菌株。使用PEG-4000是该菌株成功转化的关键因素。当使用PEG-3350进行质粒转化时，未能获得转化子（用于转化的 S. cerevisiae）替代 PEG-4000。此外，为在该菌株中获得较高的转化效率，必须使用新鲜制备的感受态细胞。其次，为减少该菌株中通过优势性NHEJ途径发生的非同源重组和随机整合事件，随后采用了一种高效的转化方法来构建 KU70 敲除突变体。第三，为了提高通过同源重组实现基因替换的效率，在基因删除盒中使用了位于目标基因上下游的较长侧翼臂（1 kb）。这些破坏盒中较长的同源侧翼区域对于该菌株中高效的同源重组至关重要。当使用仅含50 bp同源区域的破坏盒时（该长度在其他菌株中足以实现高效的同源重组），未能获得阳性克隆。 S. cerevisiae）。综合运用所有这...

与……不同 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）, 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）， 一种非常规酵母，可根据环境条件的变化以酵母或菌丝形式生长 1,2因此，这种双相酵母可作为研究真菌分化、形态发生及分类学的理想模型。 3,4,5通常被认为是一种公认安全（GRAS）的酵母菌种，广泛用于生产多种食品添加剂，如有机酸、多元醇、芳香化合物、乳化剂和表面活性剂 6,7,8,9它是一种专性需氧菌，也是一种著名的产油酵母，能够自然积累大量脂质。 即，高达细胞干重的70% 10它还能利用多种碳源进行生长，包括废弃物资源中不同种类的残留物作为营养物质。 11,12,13所有这些独特特性使得 Y. lipolytica 非常适合多种生物技术应用。
尽管解脂耶氏酵母（Y. lipolytica）的全基因组序列已经公布14,15，但对该非常规酵母的遗传操作比其他酵母物种更为复杂。首先，由于缺乏稳定且高效的遗传转化系统，该酵母物种的转化效率显著较低16,17。其次，由于尚未发现该酵母中存在天然的游离型质粒系统，通常需通过繁琐的基因组整合线性表达盒来实现目的基因的表达18。第三，基因敲除和敲入的构建受到限制，因为该酵母中依赖精确同源重组的基因靶向效率较低，大多数整合事件通过非同源末端连接（NHEJ）发生19。
本研究报道了一种针对Y. lipolytica Po1g菌株优化的转化方案，该方法简便、快速、高效且可重复。为了提高精确同源重组的频率，我们删除了编码NHEJ通路关键酶的KU70基因。通过采用优化后的转化方案，并转化含有1 kb侧翼同源区域的线性敲除片段，成功实现了Y. lipolytica Po1g菌株中KU70基因的敲除。随后，通过靶向Po1g KU70Δ菌株中的醇脱氢酶和醇氧化酶基因，验证了该基因敲除方法的稳健性。结果表明，KU70基因缺失菌株在介导同源重组的基因靶向效率上显著高于野生型Po1g菌株。此外，我们构建了一个携带潮霉素B抗性标记的复制型Cre表达质粒，用于实现标记基因的回收。该标记回收系统可在获得的基因敲除突变体中实现多轮基因靶向操作。除了基因敲除外，本文所述的遗传转化与基因敲除方案还可用于将基因插入特定位点，以及在Y. lipolytica基因组中引入位点特异性突变。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂/材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>25 nmole DNA 寡核苷酸</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Y. lipolytica&lt;/em&gt; 菌株 Po1g</td><td>Yeastern Biotech</td><td></td><td>野生型菌株 W29 (ATCC 20460) 的亮氨酸营养缺陷型衍生物</td></tr><tr><td>载体 pYLEX1</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYY203-5MG</td><td>&lt;em&gt;Y. lipolytica&lt;/em&gt; 表达载体</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; TOP10</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>用于质粒的克隆与扩增</td></tr><tr><td>pGEM-T 载体&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td>TA 克隆载体</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>用于质粒提取</td></tr><tr><td>Wizard SV 凝胶与&lt;br/&gt; PCR 纯化系统</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>从琼脂糖凝胶中提取 DNA 片段&lt;br/&gt; 并纯化扩增反应中的 PCR 产物</td></tr><tr><td>iProof 高保真&lt;br/&gt; DNA 聚合酶</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5302</td><td>高保真 DNA 聚合酶</td></tr><tr><td>BamHI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>BglII&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144L</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>NdeI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189L</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>PmlI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0532S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>PstI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0140S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 聚合酶&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11593-027</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>潮霉素 B</td><td>PAA</td><td>P21-014</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA 标准品</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0312</td><td>1 kb DNA 标准品</td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Sigma</td><td>95904-F</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0729</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精 DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15-632-011</td><td></td></tr><tr><td>乙酸锂</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠 (425-600 &amp;micro;m)</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>DNA 上样染料</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 酵母提取物</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 蛋白胨</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>1st Base</td><td>BIO-1101</td><td></td></tr><tr><td>无氨基酸酵母氮源基础培养基 (YNB)</td><td>Sigma</td><td>Y0626</td><td></td></tr><tr><td>DO Supplement-Leu</td><td>Clontech</td><td>630414</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB 肉汤</td><td>BD</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB 琼脂</td><td>BD</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 琼脂</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Biorad</td><td>T100 Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Memmert</td><td>WNB 14</td><td></td></tr><tr><td>恒温/摇床培养箱</td><td>Yihder</td><td>LM-570RD</td><td></td></tr><tr><td>恒温振荡器</td><td>Allsheng</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>BioPhotometer plus</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>GE</td><td>Amersham Imager 600</td><td></td></tr></tbody></table>

非常规酵母的基因工程改造用于可再生生物燃料与生物化学品生产

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Yarrowia lipolytica 是一种非致病性、双相型且严格需氧的酵母菌种。由于其独特的生理特征和代谢特性，这种非常规酵母不仅是研究真菌分化基本特性的良好模型，而且是一种具有前景的微生物平台，可用于生化物质生产及多种需要广泛遗传操作的生物技术应用。然而，对该酵母的遗传操作 Y. lipolytica 由于缺乏高效且稳定的遗传转化系统，以及极高频率的非同源重组（这主要归因于） KU70 基因。本文报道了一种简便、快速的高效遗传转化及基因敲除实验方案 Y. lipolytica Po1g。首先，一种将外源DNA高效转化到 Y. lipolytica Po1g 已建立。其次，为了实现增强的双交换同源重组率，以进一步删除目标基因， KU70 基因通过转化携带1 kb同源臂的破坏盒被敲除。第三，为了证明在敲除后基因删除效率的提高 KU70 基因，我们采用相同的方法逐一敲除了编码醇脱氢酶和醇氧化酶的11个目标基因 KU70 敲除平台菌株。观察到精确同源重组率从删除突变时的不到0.5%显著提高 的 KU70 Po1g 中11个靶基因单基因缺失的基因比例为33%-71% KU70Δ. 构建了一种携带潮霉素B抗性标记和Cre/LoxP系统的复制型质粒，通过表达Cre重组酶切除酵母敲除菌株中的筛选标记基因，从而实现多轮靶向遗传操作。所获得的单基因敲除突变体在生物燃料和生物化学品生产中具有潜在应用价值。

线性化的 Y. lipolytica 表达载体被插入到基因组中的 pBR 拴系平台 Y. lipolytica 通过单次交换重组获得 Po1g 菌株 27通过本研究建立的快速化学转化方法，将线性化的 Y. lipolytica 表达载体已成功转化至野生型Po1g菌株，转化效率为 &gt;100 cfu/µg DNA。将两端带有1 kb同源序列的敲除盒转化至Po1g菌株中，并将 KU70 基因被成功敲除（图1。在此，正向引物#56退火至位于5'同源臂内的序列 KU70 基因。反向引物#55位于编码区内部 LEU2 标记。反向引物#57位于编码区内部 KU70 基因。然而，在超过200个菌落中，仅有一个为缺失突变的阳性菌落 KU70 基因被观察到，表明基因缺失率极低（&lt;0.5%）。随后，构建了一种携带潮霉素B抗性标记和Cre/LoxP系统的复制型质粒（图2<...

我们在此报告对分子遗传操作的方法 Yarrowia lipolytica Po1g菌株以提高基因敲除效率。所获得的基因工程菌株 Y. lipolytica 菌株在生物燃料和生物化学品生产中具有潜在应用价值。

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是一种非致病性、双相型且严格需氧的酵母菌种。由于其独特的生理特征和代谢特性……

本实验的总体目标是建立针对一种非常规酵母物种的有效基因工程方法，包括转化用DNA的构建、DNA转化、转化子筛选，以及通过同源重组实现的靶向基因敲除。我们已在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）PO1G菌株中建立了一种高效的基因敲除技术，该技术在生物燃料和生物化学品生产方面具有潜在应用价值。与现有的PCR介导基因破坏等方法相比，该技术的主要优势在于可获得大量基因敲除片段，并且可使用多种筛选标记。本研究报道了一种高效、简便、可靠且可重复的解脂耶氏酵母PO1G菌株遗传转化方案。本研究构建的解脂耶氏酵母PO1G KU70基因缺失菌株表现出极高的同源重组频率，从而能够更快、更简便地筛选靶向基因缺失菌株。该实验方案的第一步是通过PCR扩增自解脂耶氏酵母表达载体中的LEU2表达盒，并在LEU2表达盒的5'端和3'端引入LoxP位点。在引物一中还引入了一个 BamHI 限制性酶切位点，用于后续的克隆步骤。在纯化 LoxP 启动子-LEU2 终止子-LoxP 嵌合片段后，向纯化的 PCR 产物添加三个 3' 端 A 突出端。随后将带有 A 尾的 PCR 产物连接至 TA 克隆载体，以获得质粒 T-LEU2。第二步 PCR 是利用引物三和引物四，以解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）PO1G 基因组 DNA 为模板，扩增 KU70 基因上游 1 千碱基的 5' 序列。随后，用 SacII 和 BamHI 酶对纯化的 PCR 产物和 T-LEU2 质粒进行双酶切，并将纯化后的酶切 PCR 产物连接至 T-LEU2 质粒的 SacII 和 BamHI 位点，构建成质粒 T-LEU2-5E。第三步 PCR 是利用引物五和引物六，以解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）PO1G 基因组 DNA 为模板，扩增 KU70 基因下游 1 千碱基的 3' 序列。然后用NotI和NdeI酶对纯化的PCR产物和T-LEU2-53质粒进行双酶切，将纯化后的酶切PCR产物连接至T-LEU2-5E质粒的NotI和NdeI位点，构建T-KO质粒。最后，用SacII和NdeI酶酶切T-KO质粒，获得敲除盒。该操作的第一步是制备感受态的Y.lipolytica PO1G细胞。从新鲜的酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）平板中挑取一环解脂耶氏酵母（Y. lipolytica）PO1G菌株，接种于100毫升锥形瓶中的10毫升YPD培养基中。在30°C、225 RPM条件下于摇床中培养20小时，直至达到饱和。次日，在室温下以5000 × g离心5分钟，收集菌体沉淀。用20毫升TE缓冲液洗涤细胞，并再次离心收集细胞。去除上清液后，将细胞重悬于1毫升0.1摩尔的醋酸锂溶液中，在室温下孵育10分钟。将感受态细胞分装至无菌的1.5毫升离心管中，每管100微升。立即进行转化操作：将10微升变性的鲑鱼精子DNA与1至5微克纯化的破坏盒轻轻混合，并加入100微升感受态细胞中。在30摄氏度下孵育15分钟。加入700微升40%聚乙二醇1000。充分混匀后，于30 °C、225 RPM条件下在摇床培养箱中孵育60分钟。随后，将离心管置于39 °C水浴中60分钟，对转化混合物进行热激处理。60分钟后，向离心管中加入1毫升YPD培养基，并在30 °C、225 RPM条件下恢复培养2小时。在室温下以9000 × g离心1分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于1毫升TE缓冲液中。再次离心细胞，并弃去上清液。将沉淀重悬于100微升TE缓冲液中，并涂布于缺乏亮氨酸的平板上。在30摄氏度下培养平板2至3天。在进行CRE重组酶介导的标记拯救之前，需按照文本方案中所述方法构建CRE表达质粒。该附加体质粒的一些特征包括CRE重组酶基因、潮霉素B抗性标记以及氨苄青霉素抗性基因。开始本实验时，按照之前展示的转化方案，将CRE表达质粒转化至KU70基因敲除菌株的感受态细胞中。将转化后的细胞涂布于YPD加潮霉素B平板上，在30摄氏度下培养两到三天。按照文中所述进行菌落PCR以鉴定阳性克隆后，挑取一个阳性克隆接种于2毫升YPD培养基中，在30摄氏度、225转/分钟的摇床培养箱中过夜培养至饱和。次日，使用分光光度计测定培养物在600纳米处的光密度（OD 600）。当细胞OD 600值达到约15时，在室温下以5000 × g离心5分钟收集细胞。去除上清液，加入2 mL无菌水并再次离心。去除上清液后，将细胞重悬于YPD培养基中。将细胞重新接种至2 mL YPD培养基中，初始OD600为0.1，并在30 °C、225 rpm条件下过夜培养。次日，将过夜培养的细胞培养物划线接种于YPD平板上，以分离单菌落。在30摄氏度下培养至菌落出现。将菌落复制接种到YPD、YPDH和缺乏亮氨酸的平板上。将平板在30摄氏度下孵育两天。图示为KU70基因敲除质粒的示意图。用SacII和NdeI酶对质粒进行消化，可产生破坏型表达盒。凝胶电泳证实存在一条 4.3 千碱基的条带，该大小与预期的破坏盒一致。通过 PCR 确认了 Y.lipolytica PO1G 中 KU70 基因的缺失。泳道 1 至 10 含有从转化子基因组 DNA 扩增出的 PCR 产物，泳道 11 含有来自野生型菌株的 PCR 产物。第七泳道显示为阳性敲除，而第一泳道显示为假阳性。KU70 基因敲除菌株中的筛选标记基因最终通过表达 CRE 重组酶被移除。通过仅在 YPD 平板上生长的情况验证了无筛选标记的阳性转化子。为了验证基因删除率的提高，在敲除 KU70 基因后，利用相同的方法在 KU70 敲除菌株中分别对 11 个靶基因进行了敲除。每个基因的破坏均通过 PCR 确认，此处展示了一个代表性结果，其中第 1、2 和 4 泳道被鉴定为阳性敲除。解脂耶氏酵母 PO1G KU70 敲除铂金菌株为构建其他染色体缺失突变体时的通路工程和菌株优化提供了更高效的系统和更优的选择。观看本视频后，您应全面掌握通过同源重组在解脂耶氏酵母 PO1G 细胞中实现靶向单基因敲除的策略。

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科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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