Name: 从人黑色素瘤肿瘤浸润淋巴细胞诱导多能干细胞的产生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 了解从人黑色素瘤肿瘤浸润淋巴细胞诱导多能干细胞的方法，用于肿瘤免疫学与癌症免疫治疗研究。该技术可产生无限数量的肿瘤特异性T细胞，为转移性黑色素瘤治疗提供新策略。

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感谢密歇根大学组织获取核心实验室的 Deborah Postiff 女士和 Jackline Barikdar 女士，以及多能干细胞核心实验室的 Cindy DeLong 博士在技术方面提供的帮助。本研究得到了密歇根大学启动资金，以及中央外科协会、美国外科医师学会、黑色素瘤研究联盟和美国国立卫生研究院国家癌症研究所（1K08CA197966-01）向 F. Ito 提供的资助。

注意：患者应签署知情同意书，以参与经机构审查委员会和人类多能干细胞委员会批准的研究。
1. 肿瘤浸润淋巴细胞的分离与培养
<ol>
	<li>从病理科/组织采集中心获取无需用于组织病理学诊断的肿瘤组织材料。将 20–100 g 肿瘤标本置于含 30 ml 肿瘤收集液（表 1）的 50 ml 离心管中。</li>
	<li>使用剪刀将肿瘤标本中坚实、致密的正常组织与脆弱和/或出血性坏死区域分离。去除坏死组织后，继续用剪刀尽可能将标本剪碎。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用组织解离仪及肿瘤解离试剂盒（人源）将剪碎的组织解离为单细胞悬液。将悬液通过置于 50 ml 离心管上的 70 µm 细胞筛过滤，并用 2 ml RPMI 1640 培养基洗涤筛网 2 次。</li>
	<li>在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 10 ml T 细胞培养基（表 1）中。</li>
	<li>在 50 ml 离心管中配制双层梯度溶液（如 Ficoll 梯度液），下层为 10 ml 100% 梯度液，中层为 30 ml 用无钙、无镁的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS(-)）稀释的 75% 梯度液。</li>
	<li>将细胞悬液（步骤 1.4 所得）小心铺加在梯度液（步骤 1.5 所得）上层。在 20 °C 下以 400 × g 离心 45 分钟。</li>
	<li>收集位于 100% 与 75% 梯度液界面处富含肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的细胞层，转移至 50 ml 离心管中。加入 20–30 ml D-PBS(-) 稀释富含 TIL 的细胞层。</li>
	<li>在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将富含 TIL 的细胞组分重悬于 10 ml T 细胞培养基中。</li>
	<li>将该细胞组分（步骤 1.8 所得）与 2 ml T 细胞培养基及 6,000 IU/ml 重组人源（rh）IL-2 加入 6 孔板中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养。</li>
	<li>自培养开始后第 5 天更换一半培养基，此后每 2–3 天更换一次。</li>
	<li>当细胞融合度达到 80–90% 时，轻柔吹打悬浮细胞，按 1:2 比例传代（无需胰酶消化），同时将培养孔数加倍。加入半量（1 ml）新鲜 T 细胞培养基及 6,000 IU/ml rhIL-2。</li>
</ol>
2. 丝裂霉素C处理的SNL饲养细胞板的制备
<ol>
	<li>在经0.1%明胶包被的10 cm培养皿中，加入10 ml SNL饲养层细胞培养基（表1），培养SNL饲养层细胞至80–90%融合度（3–4 × 106 个细胞）。</li>
	<li>向SNL饲养层细胞培养皿中直接加入310 µl 0.4 mg/ml丝裂霉素C溶液，在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时15分钟。吸除培养基，用5 ml D-PBS(-)洗涤细胞两次。</li>
	<li>加入0.5 ml 0.25%胰蛋白酶/1 mM EDTA，在室温下孵育1分钟以使细胞解离。加入4.5 ml SNL饲养层细胞培养基以中和并重悬细胞，形成单细胞悬液。</li>
	<li>将细胞转移至15 ml离心管中，在200 × g下离心5分钟。吸除上清液，用10 ml SNL饲养层细胞培养基重悬细胞后，使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>将1.5 × 106 个SNL饲养层细胞接种至每个10 cm培养皿中，在37 °C、5% CO2条件下培养。SNL饲养层细胞需在3天内使用。</li>
</ol>
3. 使用仙台病毒（SeV）载体生成诱导多能干细胞（iPSCs）
<ol>
	<li>收获TILs（来自步骤1.11），并激活5 x 105 使用6孔板，在37 °C、5% CO₂条件下，将TIL细胞与包被的鼠抗人CD3抗体（1 µg/ml）和可溶性鼠抗人CD28抗体（5 µg/ml）共同孵育，并加入rhIL-2（6,000 IU/ml），总体积为2 ml T细胞培养基2 5天。</li>
	<li>使用移液器将TILs（来自步骤3.1）收集至15 ml离心管中，并用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>重悬 1 x 105 使用板结合的小鼠抗人CD3（1 µg/ml）和可溶性小鼠抗人CD28（5 µg/ml）刺激TIL细胞，同时加入rhIL-2（60 IU/ml），置于500 µl重编程培养基中表124孔板中每孔在37 °C、5% CO₂条件下培养2 孵育24小时。准备3个孔用于SeV感染：OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC（1孔）；SeV感染（GFP：绿色荧光蛋白）（1孔）；细胞计数（1孔）。</li>
	<li>24 小时后（从步骤 3.3 开始），使用血细胞计数板计数细胞数量，并确定每种不同（3-20）感染复数（MOI）所需的病毒体积。从 -80 °C 保存处取出一组仙台病毒载体管，迅速在水浴（37 °C）中解冻，然后置于冰上。 
	病毒体积（µl）= MOI（CIU/细胞）× 细胞数量 / 病毒滴度（CIU/ml）× 10⁻³（µl/ml）</li>
	<li>将分别携带 OCT3/4、SOX2、KLF4 和 c-MYC 的四种仙台病毒载体按计算体积加入，使病毒混合物在含活化TILs的培养基中的感染复数（MOI）达到10-20。</li>
	<li>为确定转导效率，将计算好的SeV-GFP体积加入活化TILs的孔中。</li>
	<li>将培养皿（来自步骤 3.5 和步骤 3.6）置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中2 孵育24小时。24小时后，在荧光显微镜下观察经SeV-GFP感染的TILs，评估感染效率。</li>
	<li>将细胞（来自步骤 3.5）收集至 15 ml 离心管中，在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于0.5 ml含基本成纤维细胞生长因子（bFGF，4 ng/ml）的灵长类胚胎干细胞培养基（Primate ES Cell Medium）中。</li>
	<li>将细胞悬液转移至一个10 cm培养皿中，该培养皿内含有经丝裂霉素C处理的SNL饲养层细胞，并加入10 ml hESC培养基。每隔一天更换一次hESC培养基，直至细胞集落生长形成。</li>
	<li>在第18至21天左右，在超净台中使用10 µl枪头在显微镜下移除集落周围的SNL饲养层细胞。</li>
	<li>使用10 µl枪头刮取菌落，并用200 µl枪头将其转移至96孔组织培养板每孔中含100 µl iPSC培养基的孔内。上下吹打2-3次，使菌落分散为平均大小为50-100 µm的小团块。</li>
	<li>将小细胞团块转移至6孔组织培养板中，每孔加入2 ml含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，4 ng/ml）的iPSC培养基，培养板中已预先铺有经丝裂霉素C处理的SNL饲养层细胞（来自步骤2）。每天更换iPSC培养基。</li>
	<li>将iPSCs每5-6天传代至含新鲜丝裂霉素C处理的SNL饲养层细胞的6孔组织培养板中，每孔加入1 mg/ml IV型胶原酶。每个克隆每块板准备2个孔用于免疫染色。</li>
	<li>通过多能性标志物（SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81 和 OCT3/4）的免疫组织化学染色，确定每个克隆的完全重编程状态1. 
	注意：为了进一步评估多能性潜能，需通过拟胚体形成与分化实验或畸胎瘤形成实验，确认完全重编程的iPSC细胞系能够分化为三个胚层。16.</li>
	<li>通过细胞遗传学分析，确认完全重编程的iPSC细胞系具有正常的核型。</li>
	<li>为进行畸胎瘤形成实验，注射未分化的TIL来源的iPSC（1 × 10⁶）6将100 µl含10%胎牛血清的DMEM中的细胞悬液注射至6-8周龄雌性NOD/SCID小鼠的皮下组织。用苏木精和伊红染色畸胎瘤切片。</li>
</ol>
4. 人诱导多能干细胞中 SSEA3、SSEA4、TRA1-60 和 TRA1-81 的免疫荧光染色
<ol>
	<li>用 1 ml PBS 清洗诱导多能干细胞（iPSCs），加入 1 ml 4% 多聚甲醛溶液固定 10 分钟。去除 4% 多聚甲醛溶液，再用 1 ml PBS 清洗 iPSCs 3 次。 
	注意：使用多聚甲醛时需谨慎，因其具有毒性。</li>
	<li>用封闭缓冲液（表 1）对 iPSCs 进行 30 分钟的预处理。同时，将一抗（大鼠抗人 SSEA3、小鼠抗人 SSEA4、小鼠抗人 TRA1-60 和小鼠抗人 TRA1-81）用含 1.5% 山羊血清的 PBS-TritonX-100 溶液按 1:50 比例稀释（总体积：1 ml）。</li>
	<li>去除封闭缓冲液（表 1），加入稀释后的一抗溶液，室温孵育 1 小时。同时，将二抗（抗小鼠 IgG 和 IgM 或抗大鼠 IgM）用 1.5% 山羊血清溶液按 1:50 比例稀释。</li>
	<li>去除稀释后的一抗溶液，用 1 ml PBS 清洗 iPSCs 3 次，每次 5 分钟。加入稀释后的二抗溶液，在避光条件下室温孵育 45 分钟。</li>
	<li>去除稀释后的二抗溶液，用 1 ml PBS 清洗 iPSCs 3 次，每次 5 分钟。使用免疫荧光显微镜观察 iPSCs。</li>
</ol>
5. iPSCs 中 Oct3/4 的免疫荧光染色
<ol>
	<li>用 1 ml PBS 洗涤 iPSCs，并加入 1 ml 4% 多聚甲醛溶液固定 10 分钟。移除 4% 多聚甲醛溶液，用 PBS 洗涤 iPSCs 3 次。</li>
	<li>加入透化缓冲液（表 1），室温孵育 10 分钟。移除透化缓冲液，加入封闭缓冲液（表 1）。</li>
	<li>室温孵育 30 分钟。同时，用封闭缓冲液将一抗（小鼠抗人 Oct3/4）按 1:50 稀释。</li>
	<li>加入稀释后的一抗溶液，4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>移除稀释后的一抗溶液，用 1 ml PBS 洗涤 iPSCs 3 次，每次 5 分钟。同时，用封闭缓冲液将二抗（山羊抗小鼠 IgG/IgM）按 1:100 稀释。</li>
	<li>加入稀释后的二抗溶液，避光室温孵育 45 分钟。</li>
	<li>移除稀释后的二抗溶液，用 1 ml PBS 洗涤 iPSCs 3 次，每次 5 分钟。在免疫荧光显微镜下观察 iPSCs。</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li>
<li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li>
<li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Human+Tumor+Antigen-Specific+T+Cells+from+iPSCs+Derived+from+Mature+CD8%28%2B%29+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).</li>
<li>Wakao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+functional+human+mucosal-associated+invariant+T+cells+via+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).</li>
<li>Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor-infiltrating+lymphocyte+cultures+for+use+in+adoptive+transfer+therapy+for+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients.</a> J Immunother. 26, 332-342 (2003).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+identifies+the+patient-specific+CD8%28%2B%29+tumor-reactive+repertoire+infiltrating+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors.</a> J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).</li>
<li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+Complete+Responses+in+Heavily+Pretreated+Patients+with+Metastatic+Melanoma+Using+T-Cell+Transfer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).</li>
<li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+for+cancer%3A+harnessing+the+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).</li>
<li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+Melanoma+Tumor-Infiltrating+Lymphocytes+to+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 11(2016).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Fujie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Type+of+Sendai+Virus+Vector+Provides+Transgene-Free+iPS+Cells+Derived+from+Chimpanzee+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood.</a> PLoS One. 9, e113052(2014).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文展示了一种通过SeV介导的四种转录因子OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC转导，将黑色素瘤肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）的实验方案。该方法利用SeV系统对T细胞进行重编程，具有非整合性技术的优势7。
先前的一项研究表明，SeV重编程系统不仅能够高效且可靠地重编程成纤维细胞，还能重编程外周血T细胞7,17。此外，我们最近发现，与外周血T细胞相比，分化程度更高且表达更高水平抑制性受体（如PD-1）的黑色素瘤肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）也可通过SeV载体实现重编程16。使用抗CD3/CD28刺激与SeV载体感染的时间点对于TILs的重编程至关重要。外周血T细胞在从供体采集后可立即使用抗CD3和IL-2进行刺激以启动重编程7，而TILs则需要在IL-2存在下培养3至4周后才能进行刺激。
尽管在使用IL-2培养3-4周并以抗CD3/CD28活化后，超过99%的TIL为CD8 T细胞16</su...

通过过表达一组特定的转录因子来生成诱导性多能干细胞（iPSCs）的细胞重编程技术，在细胞治疗领域具有广阔的应用前景1,2。这些iPSCs在转录和表观遗传特征方面与胚胎干细胞（ESCs）相似，同样具备自我更新能力和多能性3-5。过去十年中，重编程技术取得了显著进展，使我们甚至能够从终末分化的细胞（如T细胞）中生成人源iPSCs6-8。由T细胞衍生的iPSCs（TiPSCs）保留了原始T细胞T细胞受体（TCR）链基因相同的重排构型，从而可从TiPSCs再生出抗原特异性的T细胞9-11。
近80%的来自患者肿瘤的黑色素瘤浸润性淋巴细胞（TILs）能够特异性识别肿瘤相关抗原，并对原始癌细胞保持细胞毒性12值得注意的是，肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）上程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）的表达可识别出自体肿瘤反应性T细胞库，其中包括针对突变新抗原特异性的CD8⁺ T细胞+ 淋巴细胞13体外扩增的自体肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）经过过继性转移，联合预处理性淋巴清除方案及系统性给予白细胞介素-2（IL-2），可在部分患者中引起转移性黑色素瘤的显著消退14尽管在临床前模型和患者中取得了令人鼓舞的成果，输注T细胞的存活率低以及免疫抑制通路的存在似乎限制了过继性T细胞治疗的全部潜力。目前的临床方案需要大量扩增T细胞 离体 通过操控自体T细胞以获得大量细胞，这会导致终末分化的T细胞产生，此类细胞存活能力差、增殖能力降低，并且PD-1表达水平较高15.
理论上，可通过使用诱导多能干细胞（iPSCs）来克服过继性T细胞治疗的这一局限性，因为iPSCs可为免疫治疗提供无限来源的自体T细胞。我们近期报道了利用仙台病毒（SeV）介导的四种转录因子OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC的转导，将表达高水平PD-1的黑色素瘤肿瘤浸润T细胞（TILs）重编程为iPSCs16。与逆转录病毒载体需要整合至宿主染色体以表达重编程基因不同，SeV载体不整合入基因组，且最终会从细胞质中被清除。相较于慢病毒或逆转录病毒载体，SeV系统的重编程效率显著更高6-8。此外，SeV能够特异性地对人外周血单个核细胞（PBMCs）中的T细胞进行重编程，而使用慢病毒或逆转录病毒载体产生的部分iPSC克隆可能来源于非淋巴系细胞6-8。本文详细描述了人黑色素瘤TILs的分离与活化，以及利用SeV重编程系统生成TIL来源iPSCs的具体操作步骤。

<table><tbody><tr><td>gentle MACS C 管</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentle MACS 组织解离仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>人肿瘤组织解离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 µm 细胞滤筛</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50 ml 圆锥形离心管</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>人 AB 血清</td><td>Life technologies</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Life technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇（1000×，55 mM）</td><td>Life technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Life technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-)</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>重组人（rh）IL-2</td><td>Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纯化无添加剂/低内毒素小鼠抗人 CD3 抗体</td><td>BD</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>纯化无添加剂/低内毒素小鼠抗人 CD28 抗体</td><td>BD</td><td>555725</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Cumberland Pharmaceuticals Inc.</td><td>NDC 66220-207-30</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 组织培养板（6 孔）</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 组织培养板（24 孔）</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>仙台病毒载体</td><td>DNAVEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SNL 饲养层细胞</td><td>Cell Biolabs, Inc</td><td>CBA-316</td><td></td></tr><tr><td>丝裂霉素 C</td><td>SIGMA</td><td>M4287</td><td>可溶于水（0.5 mg/ml）</td></tr><tr><td>明胶</td><td>SIGMA</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）</td><td>Life technologies</td><td>PHG0264</td><td></td></tr></tbody></table>

由人黑色素瘤肿瘤浸润性淋巴细胞生成诱导性多能干细胞

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

过继性转移 离体 扩增的自体肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）可在部分转移性黑色素瘤患者中诱导持久且完全的应答。该疗法的主要障碍包括因端粒缩短导致的过继性T细胞活力下降，以及从患者体内获取的TILs数量有限。具有较长端粒的低分化T细胞是过继性T细胞治疗的理想T细胞亚群；然而，大量获得此类低分化T细胞仍存在困难。理论上，可通过使用诱导性多能干细胞（iPSCs）克服过继性T细胞治疗的这一局限，因为iPSCs具有自我更新能力、维持多能性、端粒较长，并可为免疫治疗提供无限来源的自体T细胞。本文介绍一种利用仙台病毒载体将重编程因子导入TILs以生成iPSCs的实验方案。该方案可获得完全重编程且无载体整合的克隆。这些源自TILs的iPSCs可能能够生成低分化的、患者特异性和肿瘤特异性的T细胞，用于过继性T细胞治疗。

图1展示了实验流程的总体概述，包括首先使用重组人IL-2（rhIL-2）扩增黑色素瘤肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），随后用抗CD3/CD28抗体激活TILs，并将OCT3/4、KLF4、SOX2和c-MYC基因导入TILs以诱导生成诱导多能干细胞（iPSCs）。通常情况下，TILs在含rhIL-2的培养体系中培养21至28天后开始形成细胞球。此时，TILs已准备好接受抗CD3/CD28抗体的激活。图2A显示了培养21天后、处于rhIL-2培养条件下、准备进行抗CD3/CD28激活的TILs。图2B显示了以20 MOI感染剂量转染仙台病毒（SeV）介导的GFP导入效果。图2C显示了在SNL饲养层细胞上、仙台病毒感染后18至21天出现的一个典型多能性克隆。图2D显示所获得的TIL来源的iPSCs具有正常的核型。图3展示了免疫荧光染色结果，用于确认iPSCs表达多能性标志物（SS...

本实验方案的目的是展示将黑色素瘤肿瘤浸润性淋巴细胞重编程为诱导性多能干细胞的实验方法。

过继性转移体外扩增的自体肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）可在部分患者中介导持久且完全的应答

本实验的总体目标是从黑色素瘤浸润性淋巴细胞中生成诱导性多能干细胞（iPSCs）。该方法有助于解答肿瘤免疫学领域中的关键问题，特别是在癌症免疫治疗方面。该技术的主要优势在于，能够从肿瘤浸润性淋巴细胞中生成人源iPS细胞，从而为免疫治疗提供数量无限的、分化程度较低的肿瘤特异性T细胞。该技术可能适用于转移性黑色素瘤的治疗，因为目前T细胞在临床环境中的存活率较低，一直是过继性T细胞治疗的主要限制因素。该方法还可用于研究肿瘤微环境中的T细胞受体库。本实验操作将由我实验室的博士后研究员Kumiko Iwabuchi博士进行演示。获取肿瘤组织后，选取五至二十克肿瘤标本，使用剪刀将正常、实性且质地坚韧的组织从肿瘤样本中脆弱或出血性坏死区域分离出来。将分离出的标本尽可能切碎，然后使用组织解离仪和人肿瘤组织解离试剂盒，按照制造商说明书将切碎的肿瘤组织分散成单细胞悬液。解离结束后，将细胞通过70微米细胞筛过滤至50毫升离心管中，并用2毫升RPMI 1640培养基洗涤细胞筛两次。然后通过离心收集细胞，并将细胞重悬于10毫升新鲜T细胞培养基中。为通过密度梯度分离细胞，先在不含钙和镁的DPBS中，于一个新的50毫升离心管内依次加入30毫升75%梯度溶液和10毫升100%梯度溶液。然后小心地将细胞悬液铺加在梯度溶液上层，注意避免破坏液层，随后离心样品。分离结束后，将梯度液界面处富集的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）转移至新的50毫升锥形管中，用20至30毫升新鲜DPBS洗涤细胞。将细胞沉淀重悬于10毫升新鲜T细胞培养基中，随后每孔加入2毫升TIL悬液至6孔板中的5个孔，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，补充重组人IL-2培养5天。第5天时更换每孔一半培养基，之后每2至3天更换一次。当细胞培养物达到80%至90%融合度时，使用移液器将每个孔中的细胞轻轻重悬，并以1:2的比例在1毫升新鲜T细胞培养基中传代，培养基中需添加重组人IL-2。为制备丝裂霉素C处理的SNL饲养层平板，首先将SNL饲养细胞在10毫升SNL饲养细胞培养基中接种于经0.1%明胶包被的10厘米培养皿中进行培养。当细胞融合度达到80%至90%时，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，用丝裂霉素C处理饲养细胞2小时15分钟。孵育结束后，用5毫升DPBS洗涤细胞两次。随后用室温的胰蛋白酶-EDTA消化去除饲养层细胞。1分钟后，加入4.5毫升新鲜SNL饲养层培养基中和消化反应，将单细胞悬液转移至15毫升锥形离心管中进行离心。将沉淀重悬于10毫升新鲜的SNL饲养细胞培养基中进行计数。然后每10厘米培养皿中接种1.5 × 10⁶个SNL饲养细胞至每孔，并在37°C、5% CO₂条件下培养最多三天。为利用仙台病毒生成诱导性多能干细胞（iPSCs），将5 × 10⁵个TILs加入已包被小鼠抗人CD3抗体的六孔板的新孔中，每孔加入2毫升新鲜T细胞培养基，培养基中添加重组人IL-2和可溶性小鼠抗人CD28抗体。在细胞培养孵育箱中激活TIL细胞5天。然后使用移液器将培养物收集至15毫升锥形管中进行细胞计数。随后，将每孔1×10⁵个TIL细胞转移至已包被抗人CD3抗体的24孔板中，每孔加入500微升重编程培养基，并补充可溶性小鼠抗人CD28抗体和重组人IL-2。在细胞培养箱中培养24小时后，对每个孔中的细胞进行计数，并制备适当感染复数的多种体积病毒。然后将仙台病毒载体以10至20 MOI加入适量培养基中，再将含病毒的培养基加入TIL的各孔中。为测定转导效率，将计算好体积的仙台病毒GFP加入活化TIL的一个孔中，随后将培养物放回培养箱继续培养24小时。第二天，通过荧光显微镜观察仙台病毒GFP感染的细胞，以评估转导的感染效率。将每孔中病毒感染的细胞收集至15毫升离心管中，离心后用0.5毫升添加了灵长类胚胎干细胞培养基和碱性成纤维细胞生长因子的人类胚胎干细胞培养基重悬细胞沉淀。随后向细胞中加入9.5毫升新鲜的人类胚胎干细胞培养基，将细胞悬液转移至经丝裂霉素C处理的SNL饲养层细胞培养板中。本图显示了在重组人IL-2培养第21天、准备用抗CD3和CD28激活的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）。可使用感染复数（MOI）为20的仙台病毒对TILs进行转染。此处展示的是仙台病毒感染后18至21天，在SNL饲养层细胞上形成的典型多能性克隆。如本代表性核型图所示，来源于TIL的iPSC表现出正常的核型。对来源于TIL的iPSC进行免疫荧光染色以确认多能性标志物的表达，结果显示这些细胞表达典型多能性标志物的水平符合预期。此外，来源于黑色素瘤TIL的iPSC能够形成包含三个胚层多种细胞类型的畸胎瘤。此外，通过毛细管电泳评估，源自肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的诱导多能干细胞（iPSCs）保留了其T细胞受体重排。作为首次开发的技术，该方法为肿瘤学领域的研究人员探索针对转移性黑色素瘤患者更有效的癌症免疫疗法铺平了道路。在实施该操作过程中，需注意在仙台病毒感染前检测T细胞的增殖能力与存活率，并通过观察轮廓清晰的绿色荧光蛋白（GFP）表达来评估感染效率。观看本视频后，您应能充分了解如何从黑色素瘤TILs中制备人源TIL细胞。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

从人黑色素瘤肿瘤浸润淋巴细胞诱导多能干细胞的产生

由诱导性多能干细胞（iPS细胞）生成T淋巴细胞，为T细胞免疫治疗提供了一种替代使用胚胎干细胞的新途径。该方法表明，通过利用以下任一方式 体外 或 体内...

诱导多能干细胞向T淋巴细胞的定向分化

本文展示了一种简单且高效的方案，使用单一慢病毒重编程载体，从3-4...

使用STEMCCA慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞

本视频展示了一种用于生成肿瘤抗原特异性的诱导性多能干细胞（iPSC）来源的CD8αβ+ T细胞的实验方法。将肿瘤抗原特异性的iPSC在基质细胞单层上培养，并分化为造血祖细胞（HPCs）。随后，利用分化培养基将HPCs分化为CD4+ CD8+...

由诱导性多能干细胞生成单阳性CD8 T细胞

本文介绍了如何将新鲜获取的黑色素瘤组织制备成原代细胞培养物，以及如何去除肿瘤细胞中红细胞和成纤维细胞的污染。最后，我们描述了如何利用磁性激活细胞分选技术（MACS）从CD133-主体细胞中分选出CD133+的黑色素瘤干细胞样细胞。...

患者来源的细胞培养及从黑色素瘤中分离CD133+潜在肿瘤干细胞

本论文提供了从拔取的毛发中分离和培养人角质形成细胞，并通过附加体型载体进一步生成无整合的人诱导性多能干细胞（hiPSCs）的逐步操作流程。...

利用毛发来源的角质形成细胞生成无整合的人诱导性多能干细胞

本方案描述了如何在无饲养层条件下，利用含重编程因子的基质胶和仙台病毒载体，从人外周血T细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）。...

利用仙台病毒在无饲养层条件下由人外周血T细胞生成诱导性多能干细胞

无饲养层条件下由人多能干细胞分化获得黑色素细胞

本文介绍了一种利用三维（3D）胸腺培养系统生成肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的胸腺移行细胞（iTE）的新方法。iTE...

一种用于产生小鼠诱导性多能干细胞来源的肿瘤抗原特异性胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统

本文介绍了一种利用OP9/DLL1共培养系统生成功能性肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的CD8αβ+单阳性T细胞的方法。...

利用人诱导性多能干细胞生成肿瘤抗原特异性T细胞

本文介绍了一种优化的黑色素细胞直接重编程系统，以及一种高效、高浓度的病毒包装系统，可确保直接重编程过程顺利进行。...

小鼠成纤维细胞直接重编程为黑色素细胞

在此，我们介绍一种通过培养新鲜黑色素瘤组织解离后的细胞悬液来生成黑色素瘤患者来源类器官的实验方案。这些类器官能够真实地再现患者特异性的肿瘤特征 体外 为研究肿瘤免疫抑制机制、药物筛选、耐药机制及癌症监测方法提供了创新途径。...

利用黑色素瘤患者来源类器官模型揭示治疗新机遇

了解从人黑色素瘤肿瘤浸润淋巴细胞诱导多能干细胞的方法，用于肿瘤免疫学与癌症免疫治疗研究。该技术可产生无限数量的肿瘤特异性T细胞，为转移性黑色素瘤治疗提供新策略。

由人黑色素瘤肿瘤浸润性淋巴细胞生成诱导性多能干细胞

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