分层海藻酸盐构建体：异质细胞群体共培养平台

本实验的主要目标是可重复地制备双层海藻酸盐水凝胶圆盘，用于研究三维共培养条件下不同细胞群体之间的相互关系。该方法有助于在空间异质性的三维培养环境中研究多种细胞群体间的相互作用，从而为组织工程及承重组织生理学中的关键科学问题提供解答。该技术的主要优势在于，它提供了一种简单、经济且可重复的方法，用于构建接种细胞的多层海藻酸盐水凝胶，其结构特性适合进行力学刺激研究。

本实验操作将由我实验室的研究生 Poonam Sharma 演示。要制备海藻酸盐圆片，首先将一片厚滤纸叠放在一块 3 英寸 × 3 英寸的端板上，然后在其上放置细胞微孔筛膜。使用无菌刮铲将膜和滤纸压平。

然后，将叠层倒置放在一叠纸巾上，压紧材料以去除多余的氯化钙溶液。接着，将带有圆柱形孔穴的凝胶成型模具置于微筛膜上方，并使用文件夹夹子轻轻将模具固定在左右两侧的端板上。现在，将一张厚滤纸叠放在小端板上，再放上一张微筛膜，然后将此叠层倒置，以去除任何多余的氯化钙溶液，方法如前所述。

当模具的两个半部分均准备好后，将每毫升无菌海藻酸盐培养基中重悬浓度为1×10⁶个目标细胞。当细胞充分分散时，混合液将呈现均匀的浑浊状态。随后，将130微升细胞悬液逐滴加入模具下半部分的各个孔中，每个孔的直径为6毫米，高度为3毫米。

每个孔的边缘上方应可见轻微凸起的弯月面。接种完所有细胞后，使用无菌刮铲小心地抚平模具结构的上半部分。然后将模具翻转，使微筛膜朝上，再将模具放置于孔板上方，注意完全覆盖含有细胞与海藻酸盐混合物的孔。

将模具安装到位后，提起装有材料的模具组件，用手 firmly按压中心位置，并在组件剩余的两侧装上夹子，以固定模具的上下两半。细胞-海藻酸盐溶液应牢固地嵌入孔中。接着，将整个模具组件浸入细胞培养操作台中、室温下的 102 毫摩尔氯化钙溶液中，孵育 90 分钟。

孵育结束后，将装置转移至一叠纸巾上，取下固定上端板与模具顶部的两个文件夹夹子，分离装置的两半。孔中形成的水凝胶应无气泡，并完全充满各孔。

移除剩余的两个活页夹，并将含有水凝胶的模具与另一端的端板分离。使用刮铲小心地沿含有水凝胶的孔边缘划动，以松动凝胶。随后，直接将水凝胶转移至含有氯化钙和氯化镁的DPBS溶液中。

孵育一至五分钟之后，将水凝胶转移至六孔板的各个孔中，加入足量的罗勒生长培养基溶液，确保完全浸没凝胶，并在37摄氏度、5% CO2条件下孵育至少一小时。在孵育的最后30分钟内，使用长尾夹将带有孔径为凝胶成型模具一半高度的模具固定在左侧和右侧的3英寸×3英寸或3英寸×1.5英寸铝制端板上，以制备切割模具。随后，通过将孔径比凝胶成型模具大3毫米的模具用长尾夹固定在左侧和右侧的3英寸×3英寸铝制端板上，制备退火模具。

现在，将水凝胶转移至切片模具的孔中。每个凝胶应紧密地嵌入孔内，且一半凝胶需突出于模具表面。然后使用解剖刀沿模具表面切开，将水凝胶切成两半。

将凝胶的上半部分翻转并放入开放的模具孔中。凝胶应紧密贴合孔内，此时两半凝胶的总高度应与模具齐平，且切割后的内表面应暴露可见。接下来，将一片干燥的细胞微筛膜覆盖在孔上，确保膜与所有待退火的凝胶半片充分接触，并用一张厚滤纸覆盖微筛膜。

当凝胶完全覆盖后，用添加了EDTA的柠檬酸钠饱和滤纸，并在室温下孵育凝胶。一分钟后，弃去细胞微筛膜和厚滤纸，移除夹子。然后打开模具，将凝胶的一半切面朝上转移至预先准备好的退火模具中。

使用刮刀将第二块处理过的半片凝胶转移至第一块凝胶上，使两者的切割面相互接触。当所有凝胶均放置完毕后，用刮刀轻轻按压凝胶以去除气泡，并小心地将退火模具浸入氯化钙溶液中。30分钟后，将退火模具转移至一叠纸巾上，取下固定夹。

然后，将模具与端板分离，将凝胶短暂转移至 DPBS 浴中，随后浸入适当的细胞培养基中。制备完成的双层凝胶可实现细胞群体的完全初始分离，如本图中用绿色或红色细胞示踪染料标记的 293 FT 细胞所示。在退火后包埋于分层水凝胶中的人间充质干细胞具有较高的存活率，与在整体水凝胶中观察到的细胞存活率相似。

经过四小时的无侧限循环压缩后，从每个循环中分离出的峰值应力显示，无细胞分层水凝胶对循环压缩的应力响应显著小于整体无细胞非分层水凝胶，尽管两种类型的水凝胶在培养七天后均保持完整。一旦掌握该技术，包括所有材料的准备，若操作得当，可在不到四个半小时内完成。在进行该操作时，重要的是要谨慎而缓慢地操作，以避免任何错误，并更易于追踪不同样品。

在完成该操作步骤后，可进一步采用机械刺激和免疫染色等其他方法，以探究不同细胞群体之间在可能形成的细胞外基质中相互作用的相关问题。该技术将有助于力学生物学和组织工程领域的研究人员更便捷地研究不同细胞群体之间的关系，例如间充质干细胞、软骨细胞和髓核细胞。请务必注意，操作锐器、生物材料尤其是人类细胞时可能存在极高风险，因此在执行该操作过程中，应始终采取相应预防措施，如穿戴适当的个人防护装备。