Name: 分层海藻酸钠构造:一个异质细胞群的共培养平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 探索双层海藻酸盐水凝胶构建技术，用于研究异质细胞群在三维共培养中的相互作用。该方法为组织工程和承重组织生理学研究提供了一种简便、经济且可重复的实验平台。

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本工作由美国国家科学基金会（CBET 0845754，AHH）资助。

1. 海藻酸盐圆盘形成的准备工作
<ol>
	<li>在不含氯化钙和氯化镁的1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液中配制4%（w/v）海藻酸钠溶液，并置于37 °C水浴中。海藻酸钠溶液的浓度可以有所变化，但建议使用1–4%（w/v）的浓度范围。</li>
	<li>将海藻酸钠溶液与温热的细胞培养基按1:1的比例混合例如，适用于目标细胞类型的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基）。此时，海藻酸盐浓度为原始浓度的一半 即，2%（w/v）。使用无菌的0.2 µm尼龙注射器滤器对海藻酸盐/培养基溶液进行除菌。</li>
	<li>制备无菌水中的无菌二水合氯化钙溶液（102 mM），用量需足以浸没模具（约 200 - 300 ml）。</li>
	<li>收集无菌的 &#34;凝胶成型模具&#34; （直径6 mm、高3 mm的圆柱形孔，位于3英寸×3英寸的铝板上，参见 图1）和端板（底部：一块 3 英寸 × 3 英寸铝板，顶部：一块 1.5 英寸 × 3 英寸铝板），并按如下步骤准备模具：
	<ol>
		<li>将厚滤纸（吸水滤纸）和细胞微孔滤膜（10 µm 孔径）裁剪成与上下端板相同尺寸，放入氯化钙溶液中浸泡至饱和，约 1 分钟。如需灭菌，可在使用前通过高压灭菌或紫外照射 30 分钟对厚滤纸和微孔滤膜进行消毒。</li>
		<li>组装模具结构的下半部分（底部半模）。
		<ol>
			<li>将以下物品按顺序叠放，并使用无菌刮刀抹平：大端板（3 英寸 × 3 英寸）、厚滤纸，然后是微筛膜。</li>
			<li>倒置模具并将其压在叠放的纸巾上，以确保去除多余的氯化钙溶液。</li>
			<li>放置 &#34;凝胶成型模具&#34; 将圆柱形孔置于细胞微筛膜上方，并使用左侧和右侧的长尾夹从两侧轻轻固定模具。注意预留足够空间，以便后续用顶盖端板（1.5 英寸 × 3 英寸）完全覆盖孔洞。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>组装模具结构的上半部分。
		<ol>
			<li>按以下顺序将下列物品依次叠放并抚平：小端板、厚滤纸、微筛膜。</li>
			<li>倒置并将模具的这一半压在叠好的纸巾上，以确保去除多余的氯化钙溶液。此时不要使用长尾夹固定模具的这一半。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照制造商的说明培养细胞。收集所需细胞用于包埋于分层海藻酸盐水凝胶中。推荐的细胞密度为 1 - 2 x 106 细胞/毫升，但可根据所需实验进行调整。 
	注意：使用本方法制备含不同细胞类型的层时，需平行培养两种细胞类型以用于分层。以 1 × 10⁶ 细胞密度接种的间充质干细胞（MSCs）6 细胞/毫升&#160;将作为以下实验方案的示例。细胞数量和培养皿数量可根据实验需要进行调整。
	<ol>
		<li>包埋前一至两周，以每平方厘米3,000 - 5,000个细胞的密度接种间充质干细胞2 在T-75培养瓶中加入10 ml基础生长培养基（DMEM，10%胎牛血清，2% L-谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，1%青霉素/链霉素）。</li>
		<li>每2至3天更换一次用过的培养基，并加入10 ml基础生长培养基，直至细胞融合度达到80%–90%。</li>
		<li>收获细胞时，移除旧培养基，用移液管加入 3 ml 1x Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（不含氯化钙和氯化镁）冲洗细胞。移除该溶液后，向 T-75 培养瓶中生长的细胞加入 3 ml 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 培养 5 分钟。待细胞从贴壁表面脱落后，加入 6–9 ml 基础生长培养基。</li>
		<li>在室温下以 600 x g 离心间充质干细胞 5 分钟，吸除上清液，并重悬于 1 - 5 ml 基础生长培养基中。根据血细胞计数仪的使用说明，对细胞进行计数。</li>
		<li>移除 1 x 106 从总细胞重悬液中取细胞，以相同条件离心，并吸除上清液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞接种海藻酸盐圆盘的制备
<ol>
	<li>用1 ml无菌海藻酸盐/培养基溶液重悬细胞沉淀，使细胞密度达到1 × 106 个细胞/ml。当细胞充分混匀后，细胞-海藻酸盐混合物应呈现均匀浑浊的外观。</li>
	<li>将130 µl细胞-海藻酸盐混合物逐滴加入模具构件下半部分的六个直径6 mm、高3 mm的孔中，注意避免产生气泡。每个孔中的液面应略呈凸形弯月面，略高于孔边缘。</li>
	<li>使用无菌刮刀小心抚平模具构件的上半部分，然后将其翻转，使细胞微筛膜位于孔的上方。将模具构件放置在孔上方，确保完全覆盖含有细胞和海藻酸盐混合物的孔。</li>
	<li>提起已装载的模具构件，同时用力按压中心部位，并用长尾夹固定其余两侧（顶部和底部），以锁紧模具构件的上下两半。此时，细胞-海藻酸盐溶液应牢固地嵌入各孔中。</li>
	<li>将固定好的模具构件浸入102 mM氯化钙溶液中，确保整个构件完全浸没。在室温下细胞培养操作台中孵育90分钟。</li>
	<li>90分钟结束后，将模具构件从102 mM氯化钙溶液中取出，置于细胞培养操作台中的纸巾堆上。取下全部四个长尾夹，分离模具构件的两半。孔中形成的水凝胶应无气泡，并完全充满各孔。</li>
	<li>使用刮刀小心沿含水凝胶的孔边缘划动，以松动并撬出水凝胶。将水凝胶从模具构件中取出后，直接放入含有氯化钙和氯化镁的1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液中。完全浸没水凝胶，以洗去多余的氯化钙溶液，清洗时间为1–5分钟。</li>
	<li>将水凝胶转移至盛有基础生长培养基的合适培养皿（例如，6孔板）中，确保培养基完全覆盖水凝胶。在37 °C、5% CO2的细胞培养孵箱中孵育至少1小时，然后进行后续的叠层操作。 
	注意：在此阶段，含细胞的水凝胶可无限期保存于细胞培养孵箱中，直至需要与其他细胞群体进行叠层操作，前提是每2–3天更换一次培养基。</li>
</ol>
3. 海藻酸盐圆盘的叠层
<ol>
	<li>在1小时孵育的最后半小时内，收集并准备用于凝胶退火的无菌模具和溶液。
	<ol>
		<li>制备 &#34;切割模具&#34; 通过固定一个具有半高孔的模具 &#34;凝胶成型模具&#34; （使用左侧和右侧的长尾夹将一个带有直径6 mm、高1.5 mm孔的3英寸×3英寸铝板与另一块3英寸×3英寸铝板端板连接）</li>
		<li>制备 &#34;退火模具&#34; 通过固定一个直径比目标大3 mm的模具 &#34;凝胶成型模具&#34; （使用左侧和右侧的长尾夹将一个带有9 mm直径×3 mm高孔的3 in×3 in铝板）固定到另一块3 in×3 in铝板端板上。</li>
		<li>在无菌水中配制 100 mM 柠檬酸钠/30 mM EDTA（柠檬酸钠二水合物，乙二胺四乙酸四钠盐二水合物）溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从培养皿的培养基中取出目标细胞群体的凝胶（本示例中为含hMSCs的两个圆片），并放入 &#34;切割模具&#34; 孔。每个凝胶应紧密地放入孔中，且凝胶的一半需突出于模具上方。</li>
	<li>使用手术刀沿模具表面切割凝胶（将水凝胶切成两半）。翻转凝胶的上半部分并将其放入敞开的模具孔中。凝胶的一半应紧密贴合模具孔，此时两个半片凝胶的高度均与模具齐平，且切割后的内表面可见。对第二个凝胶重复上述操作。 
	注意：警告：只有内切表面才能形成分层圆盘。使用外表面会导致两半分离。据推测，微筛膜的纹理转移到凝胶表面，会影响退火过程的成功。</li>
	<li>将一片干燥的细胞微筛膜置于各孔上方，确保微筛膜与所有待退火的凝胶半片充分接触并完全覆盖。在微筛膜上方放置厚滤纸，确保完全覆盖所有凝胶。</li>
	<li>用移液器将100 mM柠檬酸钠/30 mM EDTA溶液（柠檬酸钠二水合物，乙二胺四乙酸四钠盐二水合物）滴加至厚滤纸上，直至滤纸饱和。四个孔约需750 µl。</li>
	<li>将凝胶在室温下孵育1分钟。随后，移除细胞微筛膜和厚滤纸并弃去。取下长尾夹，打开模具。</li>
	<li>对于每种退火凝胶，将经柠檬酸钠/EDTA处理的水凝胶半部分转移至已准备好的 &#34;退火模具&#34; 切面朝上放置。这将是退火结构的一半。</li>
	<li>使用刮勺将另一块经柠檬酸钠/EDTA处理的凝胶（可能含有不同细胞类型）提起，并放置在已置于其中的凝胶上 &#34;退火模具&#34;，将这第二半凝胶翻转，使其切割面与已置于其中的凝胶的切割面相接触 &#34;退火模具&#34;.</li>
	<li>用刮刀轻轻按压两块凝胶，以去除两者之间的气泡。必要时调整凝胶位置，确保它们完全对齐重叠。</li>
	<li>轻轻提起 &#34;退火模具&#34; 将其浸入102 mM氯化钙浴液中30分钟。不要用端板覆盖孔板。</li>
	<li>30分钟孵育后，移除 &#34;退火模具&#34; 并将其放在纸巾上。取下文件夹夹子，将模具与端板分离。</li>
	<li>使用刮勺收集退火后的凝胶，并将其放入含氯化钙和氯化镁的1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液中浸泡，以洗涤凝胶。随后，将退火后的水凝胶转移至所需培养皿中的细胞培养基中例如用于培养的6孔板</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种制备分层海藻酸盐水凝胶圆盘的实验方案，用于研究多种细胞群体的共培养体系，例如生理条件下呈分层结构的组织。 例如， 软骨。分层结构（如所述的培养平台）可用于研究在相同培养环境或载荷条件下两种不同细胞群体之间的相互作用。
海藻酸盐是一种阴离子线性多糖，已被证实具有生物相容性，并已成功应用于软骨生物学和组织工程研究 12,14. 使用二价阳离子交联形成海藻酸盐水凝胶， 例如钙离子。这些交联可通过使用螯合剂（如柠檬酸钠或EDTA）去除阳离子而解除，该过程此前已被用于分离在凝胶中培养的软骨细胞 3,4,12同样，该原理也已成功应用于将海藻酸盐片层粘合为双层结构，甚至将海藻酸盐微球聚集成簇。 11,12,15该平台基于相同的原理，但用于制备小型圆盘状的层状水凝胶。该过程分为两个步骤：首先，将模具浸入富含钙离子的溶液中，形成海藻酸盐圆盘；随后将这些圆盘切成两半，并用钙螯合溶液处理，以局部释放交联海藻酸盐中的钙离子。将经处理的表面相互贴合，并再次将圆盘浸入富含钙离子的溶液中，从而重新...

诸如关节软骨或椎间盘等承受压缩负荷的组织，由多种异质性组织区域构成，这些区域对于组织的生物力学功能以及适当的力学信号转导均具有关键作用。不仅不同区域的细胞排列和功能各不相同，其细胞外基质（ECM）在组成和结构上也存在差异。例如，关节软骨可分为三个主要区域，各区域在细胞形态、力学功能及细胞外基质方面均有所不同。由于细胞外基质的差异，各区域承担不同的负荷功能：浅表层主要负责对抗拉伸负荷，而中层和深层则主要承担抗压缩功能1。类似地，在椎间盘中，凝胶状的髓核被层状的纤维环所包围，这两个不同区域内的细胞所经历的生物物理刺激类型也不同2。在这些类型的组织中，当组织承受并响应机械力时，各层中的细胞与其所在区域的细胞外基质相互作用。
在组织工程和再生医学领域，重现此类异质性组织结构仍面临挑战，且我们对其生物学意义的理解尚有限。目前亟需开发可用于分析分层组织以及在同一构建体中不同细胞群体共培养的培养平台。在关节软骨组织工程中，已利用分区软骨细胞沉积不同细胞外基质（ECM）的能力，构建出无支架的分层结构，以模拟该组织的不同层次3,4。然而，分层水凝胶结构为研究多种缺乏独立形成强健组织能力的细胞群体之间的相互作用提供了新机遇。例如，可在分层结构中对不同来源的间充质干细胞进行共培养。此类分层支架已联合软骨细胞与正在分化的间充质干细胞用于提升组织工程效果5。不仅可在相似的水凝胶层中对不同细胞群体进行共培养，还可将单一细胞类型培养于经调控而具有不同刚度或生化成分的层中，以诱导细胞产生不同的响应6,7。
在软骨组织工程中，已有多种不同的生物材料水凝胶被用于分层培养细胞群体，例如基于聚乙二醇或聚乙烯醇的水凝胶7-9。然而，海藻酸盐水凝胶是构建分层支架以研究共培养中异质细胞群体的最简单生物材料之一。尽管琼脂糖水凝胶也易于形成，但海藻酸盐水凝胶具有额外优势，即可以方便地从三维结构中分离细胞，用于单个细胞的分析，这一点在先前的研究中已有描述10。在以往的研究中，双层海藻酸盐水凝胶被制备成薄片，并从这些薄片中切割出特定部分（例如，使用活检打孔器），用于生化成分或界面剪切性能等特定应用11,12。另一种制备薄层海藻酸盐片的方法也被报道，该方法具有形成多层结构的潜力，但仍需对水凝胶进行改造才能用于力学性能测试13。
本文介绍一种可重复地制备双层海藻酸盐水凝胶圆盘的方法，用于共培养不同细胞群体。该海藻酸盐圆盘平台具有多项优势。首先，其形状均一、尺寸较小，便于对包埋的细胞施加机械刺激，在许多应用中无需使用活检打孔器或其他物理手段对水凝胶进行改造。此外，在逐层构建过程中细胞存活率保持较高水平，&#160;且凝胶形成后，可在凝胶内清晰观察到两个细胞群体之间的分界，初始阶段无重叠区域。

<table><tbody><tr><td>海藻酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1112</td><td>使用 DPBS (-/-) 配制的质量百分比（wt%）溶液</td></tr><tr><td>1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液 (-/-)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液 (+/+)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11965</td><td>示例：使用所需类型的培养基</td></tr><tr><td>注射器滤器（0.02 &amp;#956;m 尼龙）</td><td>FisherBrand</td><td>0979C</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP510</td><td>用无菌水配制溶液</td></tr><tr><td>Criterion 印迹滤纸</td><td>Biorad</td><td>1704085</td><td>裁剪至与模具端板相同尺寸以形成模具</td></tr><tr><td>细胞微筛膜（孔径 10 &amp;#956;m）</td><td>Biodesign Inc of New York</td><td>N10R</td><td>裁剪至与模具端板相同尺寸以形成模具</td></tr><tr><td>二水合柠檬酸钠</td><td>FisherScience</td><td>S93364</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸四钠盐二水合物（EDTA）</td><td>FisherBioreagent</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>26140</td><td>用于示例中的间充质干细胞基础生长培养基</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（10,000 U/ml）</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>15140</td><td>用于示例中的间充质干细胞基础生长培养基</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>25030081</td><td>用于示例中的间充质干细胞基础生长培养基</td></tr><tr><td>非必需氨基酸（100×）</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11140050</td><td>用于示例中的间充质干细胞基础生长培养基</td></tr></tbody></table>

分层海藻酸盐构建体：异质细胞群体共培养平台

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

许多承重组织具有结构和功能上明显不同的区域，通常伴随着不同表型的细胞以及差异性的机械感应特性。这些组织类型的构建与分析仍然是一个挑战。分层水凝胶结构为研究单个构建物内多个细胞群体之间的相互作用提供了机会。海藻酸盐水凝胶不仅具有良好的生物相容性，还可在实验后方便地分离细胞。本文描述了一种制备小型双层海藻酸盐水凝胶圆盘的方法。该方法在形成过程中可维持人源间充质干细胞的高细胞活力，且这些双层圆盘能够耐受无侧限循环压缩，而这种压缩常用于刺激正在进行软骨生成的hMSCs。这些分层结构有望进一步扩展以包含更多层次，也可用于在分层后初始阶段分离不同的细胞群体。这种双层海藻酸盐水凝胶培养平台可用于多种不同应用，包括承重组织细胞的构建与分析，以及其他细胞类型的共培养。

图1展示了海藻酸盐水凝胶的形成与分层结构。如图2所示，制备完成的双层凝胶表现出细胞群体之间完全的初始分离。如图3所示，嵌入在这些水凝胶中并呈分层分布的人类间充质干细胞的细胞活力保持较高水平，且与整体水凝胶中的细胞活力相当。在退火处理后，将凝胶垂直切开以暴露其中心区域，随后根据试剂说明书，使用活细胞示踪染料CMFDA（绿色）对退火凝胶中的活细胞染色，同时使用碘化乙啶同二聚体-1对死细胞（红色）染色。利用荧光显微镜对切开的表面进行共聚焦Z轴扫描，成像深度约为凝胶内部100 µm处，并将这些图像投影为一幅二维图像。随后使用ImageJ软件中的颗粒分析功能对活细胞与死细胞进行定量分析。
我们希望验证这些无细胞的分层水凝胶是否能够承受类似于诱导软骨生成反应所需的周期性压缩。结果发现，这些水凝胶在培养七天后，再经受4小时、1 Hz、0–10%应变的无侧限周期性压缩...

具有异质细胞群体的承重组织的构建与分析仍是一项挑战。本文中，我们描述了一种制备双层海藻酸盐水凝胶圆盘的方法，该圆盘可作为在同一结构内共培养不同细胞群体的平台。

许多承重组织具有结构和功能上明显不同的区域，通常伴随不同细胞表型的差异……

本实验的主要目标是可重复地制备双层海藻酸盐水凝胶圆盘，用于研究三维共培养条件下不同细胞群体之间的相互关系。该方法有助于在空间异质性的三维培养环境中研究多种细胞群体间的相互作用，从而为组织工程及承重组织生理学中的关键科学问题提供解答。该技术的主要优势在于，它提供了一种简单、经济且可重复的方法，用于构建接种细胞的多层海藻酸盐水凝胶，其结构特性适合进行力学刺激研究。本实验操作将由我实验室的研究生 Poonam Sharma 演示。要制备海藻酸盐圆片，首先将一片厚滤纸叠放在一块 3 英寸 × 3 英寸的端板上，然后在其上放置细胞微孔筛膜。使用无菌刮铲将膜和滤纸压平。然后，将叠层倒置放在一叠纸巾上，压紧材料以去除多余的氯化钙溶液。接着，将带有圆柱形孔穴的凝胶成型模具置于微筛膜上方，并使用文件夹夹子轻轻将模具固定在左右两侧的端板上。现在，将一张厚滤纸叠放在小端板上，再放上一张微筛膜，然后将此叠层倒置，以去除任何多余的氯化钙溶液，方法如前所述。当模具的两个半部分均准备好后，将每毫升无菌海藻酸盐培养基中重悬浓度为1×10⁶个目标细胞。当细胞充分分散时，混合液将呈现均匀的浑浊状态。随后，将130微升细胞悬液逐滴加入模具下半部分的各个孔中，每个孔的直径为6毫米，高度为3毫米。每个孔的边缘上方应可见轻微凸起的弯月面。接种完所有细胞后，使用无菌刮铲小心地抚平模具结构的上半部分。然后将模具翻转，使微筛膜朝上，再将模具放置于孔板上方，注意完全覆盖含有细胞与海藻酸盐混合物的孔。将模具安装到位后，提起装有材料的模具组件，用手 firmly按压中心位置，并在组件剩余的两侧装上夹子，以固定模具的上下两半。细胞-海藻酸盐溶液应牢固地嵌入孔中。接着，将整个模具组件浸入细胞培养操作台中、室温下的 102 毫摩尔氯化钙溶液中，孵育 90 分钟。孵育结束后，将装置转移至一叠纸巾上，取下固定上端板与模具顶部的两个文件夹夹子，分离装置的两半。孔中形成的水凝胶应无气泡，并完全充满各孔。移除剩余的两个活页夹，并将含有水凝胶的模具与另一端的端板分离。使用刮铲小心地沿含有水凝胶的孔边缘划动，以松动凝胶。随后，直接将水凝胶转移至含有氯化钙和氯化镁的DPBS溶液中。孵育一至五分钟之后，将水凝胶转移至六孔板的各个孔中，加入足量的罗勒生长培养基溶液，确保完全浸没凝胶，并在37摄氏度、5% CO2条件下孵育至少一小时。在孵育的最后30分钟内，使用长尾夹将带有孔径为凝胶成型模具一半高度的模具固定在左侧和右侧的3英寸×3英寸或3英寸×1.5英寸铝制端板上，以制备切割模具。随后，通过将孔径比凝胶成型模具大3毫米的模具用长尾夹固定在左侧和右侧的3英寸×3英寸铝制端板上，制备退火模具。现在，将水凝胶转移至切片模具的孔中。每个凝胶应紧密地嵌入孔内，且一半凝胶需突出于模具表面。然后使用解剖刀沿模具表面切开，将水凝胶切成两半。将凝胶的上半部分翻转并放入开放的模具孔中。凝胶应紧密贴合孔内，此时两半凝胶的总高度应与模具齐平，且切割后的内表面应暴露可见。接下来，将一片干燥的细胞微筛膜覆盖在孔上，确保膜与所有待退火的凝胶半片充分接触，并用一张厚滤纸覆盖微筛膜。当凝胶完全覆盖后，用添加了EDTA的柠檬酸钠饱和滤纸，并在室温下孵育凝胶。一分钟后，弃去细胞微筛膜和厚滤纸，移除夹子。然后打开模具，将凝胶的一半切面朝上转移至预先准备好的退火模具中。使用刮刀将第二块处理过的半片凝胶转移至第一块凝胶上，使两者的切割面相互接触。当所有凝胶均放置完毕后，用刮刀轻轻按压凝胶以去除气泡，并小心地将退火模具浸入氯化钙溶液中。30分钟后，将退火模具转移至一叠纸巾上，取下固定夹。然后，将模具与端板分离，将凝胶短暂转移至 DPBS 浴中，随后浸入适当的细胞培养基中。制备完成的双层凝胶可实现细胞群体的完全初始分离，如本图中用绿色或红色细胞示踪染料标记的 293 FT 细胞所示。在退火后包埋于分层水凝胶中的人间充质干细胞具有较高的存活率，与在整体水凝胶中观察到的细胞存活率相似。经过四小时的无侧限循环压缩后，从每个循环中分离出的峰值应力显示，无细胞分层水凝胶对循环压缩的应力响应显著小于整体无细胞非分层水凝胶，尽管两种类型的水凝胶在培养七天后均保持完整。一旦掌握该技术，包括所有材料的准备，若操作得当，可在不到四个半小时内完成。在进行该操作时，重要的是要谨慎而缓慢地操作，以避免任何错误，并更易于追踪不同样品。在完成该操作步骤后，可进一步采用机械刺激和免疫染色等其他方法，以探究不同细胞群体之间在可能形成的细胞外基质中相互作用的相关问题。该技术将有助于力学生物学和组织工程领域的研究人员更便捷地研究不同细胞群体之间的关系，例如间充质干细胞、软骨细胞和髓核细胞。请务必注意，操作锐器、生物材料尤其是人类细胞时可能存在极高风险，因此在执行该操作过程中，应始终采取相应预防措施，如穿戴适当的个人防护装备。

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科研

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生物工程

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