从细胞使用寡核苷酸定向洗脱同源RNA-蛋白质复合物的隔离
January 16th, 2017
本手稿描述了一种通过特异性寡核苷酸定向富集分离真核细胞中形成的选定同源 RNP 的方法。我们通过分离与由 DHX9/RNA 解旋酶 A 组成的逆转录病毒 5' 非翻译区结合的同源 RNP 来证明这种方法的适用性。
这种 RNA 免疫沉淀技术的总体目标是通过特异性寡核苷酸定向富集选择性地分离和表征真核细胞中形成的内源性 RNA 蛋白复合物。这种方法可以帮助回答转录后控制领域的关键问题，例如 RNA 结合蛋白的组成，这些蛋白定义了逆转录病毒转录物的五个主要 UTR 以调节其基因表达。该技术的主要优点是，它允许研究人员选择性地分离和表征感兴趣的特定 RNA 蛋白复合物，同时保持对下游 RNP 进行更全面分析的可能性。
好吧，这项技术的影响延伸到对病毒感染和许多细胞疾病的基本理解。并为基因表达的转录后控制机制提供了重要的见解。这可能意味着新的可行的药物靶点。
根据文本方案培养细胞并对 FLAG 标记的蛋白质进行免疫沉淀后，将每 IP 60 μL 的 pro-TG 磁珠浆液转移到 1.7 mL微量离心管中。将试管放在磁力架上，小心移液以去除储存溶液。然后从架子上取下试管。
加入 600 微升 1x 洗涤缓冲液。并将试管在室温下端对端旋转器上放置 3 分钟，以洗涤和平衡磁珠。将试管放在磁力架上并取出洗涤缓冲液。
然后加入 10 体积的新鲜 1x 洗涤缓冲液。将免疫沉淀 FLAG 抗体添加到平衡的 pro-TG 磁珠中。然后在室温下旋转试管至少 30 分钟，以偶联免疫沉淀抗体。
将试管放在磁铁上并去除上清液。然后从磁架上取下试管，向磁珠中加入 1x 洗涤缓冲液，并在室温下旋转 3 分钟。重复洗涤步骤两次并去除最终缓冲液。
通过抽吸从细胞中取出培养基，并使用 1.5 毫升冰冷的 PBS 洗涤细胞两次。使用细胞刮刀去除潮湿的贴壁细胞。将细胞悬液移液到新试管中，然后在 4 摄氏度下以 226 倍 G 离心培养物 4 分钟。
向细胞沉淀中加入 375 μL 冰冷的低盐缓冲液，并将样品在冰上孵育 5 分钟以使其溶胀。在低盐裂解缓冲液中添加和重悬细胞沉淀时要小心，以确保完全浸没和溶胀而不会过早地机械破坏。要收集细胞质细胞裂解物，请添加 125 μL 冰冷的裂解缓冲液，然后使用预冷的 Dounce 匀浆器进行 10 次冲程。
以足够的力进行 Dounce 匀浆，以实现质膜裂解和释放的细胞质裂解物的污染物。但要注意不要过度拉伸机械破坏，否则会有核污染、RNA 蛋白复合物破坏或释放的损失的风险，在微量离心机中以最高速度旋转匀浆一分钟。然后将上清液转移到已在冰上放置的新 1.7 mL 试管中。
确定总蛋白浓度。保留 10% 用于 western blot 分析，用作输入对照。为了进行免疫沉淀，将所需体积的收获细胞裂解物添加到靶标抗体偶联珠中。
使用 1x 洗涤缓冲液，使总体积达到 600 微升，并在室温下旋转样品。孵育 90 分钟后，将 IP 管放在磁力架上以收集磁珠。然后收集上清液并将其保留为流出液。
接下来，向 RNP 结合的抗体偶联珠中加入 10 体积冰冷的 NETN 150 洗涤缓冲液，并在室温下旋转样品 3 分钟。根据文本方案将固定的 RNP 复合物重悬于 1x 结合缓冲液中后，在 100 微升冰冷的 1x 结合缓冲液中调整剩余体积。并在 70 摄氏度下加热管子三分钟。
为了分离同源 RNA 蛋白复合物，添加大约 30 个核苷酸的 DNA 寡核苷酸，与目标 RNA 的三个主要序列边界互补。并在室温下轻轻摇动孵育 30 分钟。向试管中加入 5 至 10 个单位或 RNase H，并在室温下孵育样品 1 小时，以从 RNA DNA 杂交体中切割 RNA。
然后将含有捕获的目标 RNP 复合物的上清液转移到无菌的 1.7 ml 微量离心管中。为了收集免疫沉淀的 RNA，将捕获的 RNA 复合物总样品的一半重悬于 750 μL 酸性硫氰酸胍试剂中。向试管中加入 200 微升氯仿，剧烈摇晃 10 秒，然后在室温下孵育 3 分钟。
离心后，将水相收集在新管中，并加入等体积的异丙醇。充分混合并在室温下孵育样品至少 10 分钟。向样品中加入 1 微升乙二醇蓝，并将其储存在零下 20 摄氏度，以便将来进行高效沉淀或处理。
将试管在 4 摄氏度下以 16， 000 倍 G 离心 10 分钟。使用 P200 微量移液器小心收集并丢弃上清液，以免干扰 RNA 沉淀。向每管中加入 500 微升 75% 乙醇。
涡旋并离心试管 5 分钟。小心收集并丢弃上清液，如刚才所示。将沉淀风干 2 到 3 分钟，然后使用 100 微升不含 RNase 的水重新悬浮。
将 100 μL RNA 样品加入 RNA 纯化柱中。并根据制造商协议对其进行处理。最后，在 30 μL 不含 RNase 的水中洗脱 RNA，并在零下 80 摄氏度下储存长达三个月。
分离转录后对照元件，或在增殖细胞中形成的 PCE、GAG、RNA、RHA 核糖核蛋白复合物。在转染的 HECK293 细胞裂解物中进行 FLAG-MS2 RNP 免疫沉淀。结果显示 FLAG-MS2 蛋白的高效沉淀。
由于 DHX9/RHA 存在于 RNP 复合物中，而不是在 IgG 同位素对照中，也不在阴性对照中。此处显示的是 RNase H 消化的 RNA DNA 复合物的蛋白质印迹。RNase H 裂解 PCE GAG RNA，释放与 5 个引物 UTR 特异性结合的 RNP 复合物。
DHX9/RHA 相关 RNP 在洗脱液中富集。重要的是，FLAG-MS2 结合的 RNP 仍与抗体偶联的磁珠保持在一起。在本实验中，通过 RT-PCR 和 QRT-PCR 验证了细胞和洗脱液中含有逆转录病毒 PCE GAG RNA 的 MS2 茎环的 HO 免疫沉淀。
结果证实了 DHX9/RHA 与逆转录病毒 5 个主要 UTR 之间的选择性关联，这已被强调为一种独特的 RNP，对靶向翻译控制很重要。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约五个小时内完成。在尝试此程序时，请务必记住要高效、小心地执行所有步骤，以确保维持完整的 RNP 复合物并分离感兴趣的特定 RNP 复合物。
在此程序之后，可以执行其他方法，如质谱和 RNA-Seq，以回答其他问题，例如蛋白质与目标 RNA 的整体结合。和区域或对特定 RNP 中参与的所有转录本的完整分析。该技术发展后，为转录后基因控制领域的研究人员探索控制病原病毒基因过期和细胞基因表达控制一般机制的不同 RNA 蛋白复合物铺平了道路。
观看本视频后，您应该对如何收获完整的细胞 RNP 复合物并使用选择性寡核苷酸定向富集确定其组成有很好的了解。也不要忘记，与病原病毒和生物样品以及酸或苯酚等危险化学品一起工作可能非常危险。执行此程序时，应始终采取所有预防措施，例如适当的个人防护设备。
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概述
本手稿描述了一种RNA免疫沉淀技术，用于选择性地分离和表征真核细胞中内源性RNA-蛋白复合物。该方法关注逆转录病毒的5'非翻译区，并强调了DHX9/RNA解旋酶A的作用。
关键研究组成部分
科学领域
- RNA生物学
- 转录后控制
- 病毒基因表达
背景
- RNA-蛋白复合物在基因调控中起着关键作用。
- 理解这些复合物可以提供对病毒感染的洞察。
- 转录后控制对基因表达调控至关重要。
- 五端非翻译区在逆转录病毒转录物中具有重要意义。
研究目的
- 使用寡核苷酸指导的富集来分离特定的RNA-蛋白复合物。
- 表征逆转录病毒转录物中RNA结合蛋白的组成。
- 探索对病毒感染和细胞疾病的影响。
使用的方法
- RNA免疫沉淀技术。
- 寡核苷酸指导的富集。
- RNA结合蛋白的表征。
- RNA-蛋白相互作用的分析。
主要结果
- 成功分离与逆转录病毒转录物结合的相应RNP。
- 在分离的复合物中鉴定DHX9/RNA解旋酶A。
- 对转录后控制机制的洞察。
- 潜在识别病毒感染的新药物靶点。
结论
- 该技术增强了对RNA-蛋白相互作用的理解。
- 它为研究转录后调控提供了框架。
- 研究结果可能导致针对病毒性疾病的新型治疗策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables selective isolation of specific RNA-protein complexes from eukaryotic cells, supporting target validation in post-transcriptional gene regulation. By enriching cognate RNPs at the 5' UTR of retroviral transcripts, it provides mechanistic insights into viral translation control and cellular stress response pathways. The approach aids in de-risking target hypotheses by defining RNP composition relevant to antiviral and disease-modifying strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by defining RNA binding protein composition at specific RNA elements.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional validation of RNA-protein interactions in disease-relevant contexts.
- Predictive Value: Enhances confidence in target selection by linking RNP complexes to translational control of viral and stress-response genes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated RNP complexes for downstream proteomic and biochemical analysis.
- Operational Value: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay standardization and screening readiness.
- Platform Value: Enables scalable isolation of cognate complexes for reliable compound evaluation in follow-up workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational continuity by linking discovery-phase RNP identification to preclinical validation of gene regulation mechanisms.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions through mechanistic de-risking of post-transcriptional targets.
- Predictive Value: Aligns with biomarker development by identifying RNP components associated with pathogenic gene expression.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for RNA-mediated mechanisms of gene expression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating specific RNP complexes from cellular lysates.
- Screening: Enables assay readiness through standardized isolation of RNA-protein complexes with defined composition.
- Analytics: Generates protein and RNA readouts that allow comparative analysis of RNP composition under varying conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing mechanistic insight into viral and cellular gene expression control.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for probing RNA-protein interactions across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in RNA-regulated pathways.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility in RNP isolation across laboratories and projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early de-risking of targets involved in post-transcriptional control.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antiviral and cellular stress-response programs based on RNP composition data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, immunoprecipitation, and RNA handling techniques.
- Depends on access to magnetic bead systems, centrifuges, and RNase-free laboratory equipment.
- Necessitates cross-team standardization of oligonucleotide design and RNase H digestion protocols.
- Involves adaptation considerations when applying to different RNA targets or cell types.
- Includes practical limitations such as the need for careful handling to preserve RNP integrity during lysis and elution steps.
