Name: 经典霍奇金淋巴瘤的芦苇细胞的流分选和外显子测序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 了解从经典霍奇金淋巴瘤肿瘤中通过流式细胞术分选分离霍奇金里德-斯特恩伯格细胞的方法，用于高质量全外显子组测序。该技术无需预扩增即可生成肿瘤来源DNA，有助于识别关键驱动突变和免疫逃逸突变。

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本项目方法的开发由威尔康奈尔医学院病理学与实验室医学系资助。我们感谢三校联合计算生物学与医学培训项目提供的部分资金支持。我们衷心感谢与我们分享宝贵时间与专业知识的科学家们，特别是Maryke Appel、Dan Burgess、Iwanka Kozarewa、Chad Locklear，以及来自威尔康奈尔医学院基因组核心设施的所有成员，包括Jenny Zhang、Xiaobo (Shawn) Liang、Dong Xu、Wei Zhang、Huimin Shang、Tatiana Batson和Tuo Zhang。

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作者无任何利益冲突需要披露。

掌握该技术后的未来应用或发展方向
本方法可用于含有至少 10 ng DNA 的样本进行外显子组测序。在临床背景下，由于材料不足，该限量排除了大多数细针穿刺样本，但包括足够的穿刺活检和切除活检样本。这将能够从更多可能的样本中获取数据。
方案中的关键步骤
适当的冷冻和解离技术对实验成功至关重要。应尽可能完全解离整个样本，包括纤维化区域。使用130 µm喷嘴进行细胞分选似乎对最大化获得大体积HRS细胞及DNA产量至关重要。尽管尚未开展使用多种喷嘴尺寸的严格对照实验，但与100 µm喷嘴相比，使用更大尺寸喷嘴时细胞得率显著提高；而使用85 µm喷嘴分选后，载玻片上几乎未检测到细胞（未发表观察结果）。
修改与故障排除
当用于文库构建的输入DNA质量少于100 ng时，应尽...

由于下一代测序技术的发展，癌症基因组学取得了显著进展，从而在多种血液系统及非血液系统肿瘤的治疗靶点识别和预后判断方面实现了重大突破。基于特定基因组改变的新型个体化治疗策略正在多种肿瘤类型中迅速涌现（参见文献综述1,2）。尽管淋巴瘤基因组学已取得显著进展，经典型霍奇金淋巴瘤（CHL）中肿瘤性HRS细胞的基因组仍研究较少。由于肿瘤性HRS细胞存在于反应性微环境中且数量稀少，难以分离出纯化的HRS细胞群体，这限制了相关研究的开展3。
从原发性肿瘤中分离活体HRS细胞的方法由Fromm 等4,5,6建立。该方法采用包含CD30、CD15、CD40、CD95、CD45、CD20、CD5和CD64的八种抗体混合物，明确鉴定经典霍奇金淋巴瘤（CHL）肿瘤悬液中的HRS细胞。利用该技术，我们能够从新鲜或冷冻的肿瘤活检细胞悬液中分离出至少1,000个活体HRS细胞，这些悬液至少含有107个细胞（约10 mg组织）。流式细胞术分析显示纯度超过90%，在连续10例病例的外显子组基因组分析中估计纯度至少为80%。
我们改进了一种流式细胞术细胞分离技术，显著简化了操作流程，能够快速从原发性经典霍奇金淋巴瘤（CHL）肿瘤中分离出数千个有活力的HRS细胞7。我们已利用该技术获得了据信是首例原发性霍奇金淋巴瘤肿瘤细胞的全外显子组序列。我们的研究证明了对单个CHL病例进行高通量、全基因组分析的可行性，并已成功鉴定出一些新的基因组改变，有望揭示CHL发病机制的某些方面。
我们进一步开发了一条流程，用于将提取的DNA应用于高通量基因组研究。为了从仅1,000个分选获得的HRS细胞（连续病例中所能获得的最低数量）中获得可靠结果，我们进一步优化了下一代DNA文库构建流程8，从而提高了接头连接效率，并能够在无需过度扩增的情况下生成DNA片段文库。该方法使得常规临床样本的分析成为可能，并可用于检测反复出现的突变及染色体改变7。

<table><tbody><tr><td>培养皿或细胞培养皿（无菌）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>罗斯威尔公园纪念研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS，热灭活）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冻存液（RPMI，20% FCS，10% 二甲基亚砜（DMSO））——现配并保持无菌</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>含 2% FCS 的 RPMI（现配或可储存至 1 个月）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带新刀片的手术刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器（无针头）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管，耐压</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td></td><td></td><td>可容纳 50 mL 圆锥形离心管，并提供 400g 离心力</td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液（1 M，细胞培养级）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluronic-F68</td><td>Thermo-Fisher</td><td>24040-032</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D4527-10KU</td><td>建议以 5 mg/mL 溶于 RPMI 中，于 -200 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分选缓冲液（PBS + 2% BSA + 25 mM HEPES + Pluronic &amp;ndash;F68（1x））</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD64-FITC（22）</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td>建议起始体积为 20 &amp;mu;L；建议进行滴定</td></tr><tr><td>CD30-PE（BerH83）</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td>建议起始体积为 20 &amp;mu;L；建议进行滴定</td></tr><tr><td>CD5-ECD（BL1a）</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td>建议起始体积为 10 &amp;mu;L；建议进行滴定</td></tr><tr><td>CD40-PerCP-eFluor 710（1C10）</td><td>Ebiosciences, San Diego, CA</td><td></td><td>建议起始体积为 5 &amp;mu;L；建议进行滴定</td></tr><tr><td>CD20-PC7（B9E9）</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td>建议起始体积为 10 &amp;mu;L；建议进行滴定</td></tr><tr><td>CD15-APC（HI98）</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td>建议起始体积为 20 &amp;mu;L；建议进行滴定</td></tr><tr><td>CD45 APC-H7（2D1）</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td>可替换为 CD45-Krome Orange（J.33, Beckman Coulter），建议体积为 10 &amp;mu;L；建议进行滴定</td></tr><tr><td>CD95-Pacific Blue（DX2）</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td></td><td>建议起始体积为 5 &amp;mu;L；建议进行滴定</td></tr><tr><td>CD2（5 &amp;mu;g；克隆号 RPA-2.10）</td><td>Biolegend, San Diego, CA</td><td></td><td>用于可选方案；建议进行滴定</td></tr><tr><td>CD54（10 &amp;mu;g；克隆号 84H10）</td><td>Serotec, Oxford, United Kingdom</td><td></td><td>用于可选方案；建议进行滴定</td></tr><tr><td>CD58（10 &amp;mu;g；克隆号 TS2/9）</td><td>eBioscience, San Diego, CA</td><td></td><td>用于可选方案；建议进行滴定</td></tr><tr><td>LFA-1（12 &amp;mu;g；克隆号 MHM23）</td><td>Novus Biologicals, Littleton, CO</td><td></td><td>用于可选方案；建议进行滴定</td></tr><tr><td>BD CS&amp;T 微球</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Accudrop 微球</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BC Versa Comp 抗体捕获微球</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td>补偿微球</td></tr><tr><td>配备 5 个激光器的 BD-FACS ARIA 特殊研究订单仪器</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td>任何具备检测抗体组合中荧光染料能力的 BD-FACS Aria 仪器均可满足要求</td></tr><tr><td>Wizard</td><td>Promega</td><td>A2360</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl 缓冲液</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S2 超声破碎仪</td><td>Covaris, Woburn, MA</td><td></td><td>可使用替代产品</td></tr><tr><td>microTUBE</td><td>Covaris, Woburn, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低通量文库制备试剂盒</td><td>Kapa Biosystems, Wilmington, MA</td><td>KK8221</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Green</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 微球</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物分析仪</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SeqCap EZ 外显子 v.3.0</td><td>Roche Nimblegen</td><td>6465684001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TruSeq 风格通用接头</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa</td><td></td><td>HPLC 纯化；AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T</td></tr><tr><td>TruSeq 风格索引接头</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa</td><td></td><td>HPLC 纯化；/5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG</td></tr><tr><td>TruSeq 风格 PCR 引物 1</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa</td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGAGA</td></tr><tr><td>TruSeq 风格 PCR 引物 2</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa</td><td></td><td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAG</td></tr><tr><td>无核酸酶双链缓冲液</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDIVA 软件</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 管</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD 流式管</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

流式分选与经典霍奇金淋巴瘤中里-施细胞的外显子组测序

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

经典霍奇金淋巴瘤中的霍奇金-里德-斯特恩伯格细胞（Hodgkin Reed-Sternberg cells）稀疏分布于炎性淋巴细胞背景中，通常仅占肿瘤质量的不到1%。来源于整体肿瘤的材料中肿瘤含量浓度不足，难以进行有效表征。因此，本文介绍了一种利用八种抗体以及侧向散射和前向散射进行荧光激活细胞分选的方法，可快速分离并高纯度富集数千个HRS细胞用于后续研究。同时，由于外显子组测序的标准流程通常需要100–1,000 ng的输入DNA，这一要求即使经过流式分选仍常过高，我们还提供了一种优化的低输入量文库构建方案，仅需低至10 ng的输入DNA即可生成高质量数据。该组合方法可生成适用于全外显子捕获探针或更聚焦的靶向面板的下一代测序文库。将HRS细胞与肿瘤内健康的T细胞或B细胞进行比较，开展外显子组测序可识别体细胞变异，包括突变、插入与缺失以及拷贝数变异。这些发现有助于阐明HRS细胞的分子生物学机制，并可能揭示靶向药物治疗的新途径。

文库扩增及0.8x磁珠纯化后应进行生物分析仪检测。应观察到片段大小在目标范围内呈现“近似正态”的分布（图2a）。若曲线偏离该形态，例如出现明显的“肩峰”，则提示存在高或低分子量的副产物。例如，图2b-2d 展示了含有明显副产物的文库示例，此类文库理想情况下不应进行测序。若文库质量严重受损，且仍有DNA材料可用，或可重新进行文库构建和/或细胞分选以重新开始实验。
有时接头二聚体可能在第一次0.8x磁珠纯化过程中残留。若发生此情况，会在125 - 130 bp附近出现一个尖锐的峰（见图2c）。此时，建议再进行一次额外的0.8x磁珠纯化，并重复生物分析仪检测，以确保成功去除二聚体。
<p class="jove_content" fo:ke...

本文介绍了一种结合流式细胞分选与低起始量下一代测序文库构建的实验方案，旨在从经典型霍奇金淋巴瘤（CHL）的霍奇金-里德-斯特恩伯格（HRS）细胞中获得高质量的全外显子组数据。

经典霍奇金淋巴瘤中的霍奇金-里德-斯特恩伯格细胞稀疏分布于炎性淋巴细胞背景中，通常……

本实验的总体目标是从富含炎性淋巴细胞的经典型霍奇金淋巴瘤（CHL）肿瘤组织中分离并富集具有活性的霍奇金-里德-斯特恩伯格（Hodgkin Reed-Sternberg，HRS）细胞，以制备和分析高质量的全外显子组高通量测序数据。该方法可解答经典型霍奇金淋巴瘤（CHR）生物学中的关键问题，包括关键驱动突变的鉴定、免疫逃逸相关突变的识别，以及分类内部基因多样性的分析。该技术所获得的肿瘤来源DNA在质量和纯度方面均非常高。无需预扩增步骤即可促进下一代测序文库的构建。该技术可能对霍奇金淋巴瘤的诊断具有重要意义，因其有助于疾病的亚型分类及预后判断。此外，该技术还可能影响治疗方案的选择，因为某些基因改变可能提示对特定药物的敏感性或耐药性。Jonathan From 首次提出这一想法，当时他发现了通过流式细胞术可视化HRS细胞的方法，并首次对这些细胞进行了分选实验。在准备细胞之前，将预滴定的抗体混合于避光的玻璃小瓶中。然后加入PBS和BSA，使抗体混合液总体积达到100 µL。将冻存管从液氮中取出，放入装有冰块或干冰的容器中。接着，在37°C水浴中快速解冻目标细胞。当仅剩少量冰晶时，将细胞悬液倒入含有45毫升37°C解冻培养基的50毫升锥形管中，并用1毫升新鲜解冻培养基冲洗冻存管两次。合并两次洗涤液后，将细胞在室温下消化15分钟。待细胞重新平衡后，通过离心收集细胞。弃去上清液，仅保留最后200微升。将细胞重新悬浮于剩余的冻存复苏培养基中，静置2至3分钟。随后，在100微升抗体混合液中室温避光孵育15分钟。孵育结束后，用3毫升分选培养基洗涤细胞，并将细胞沉淀重新悬浮于1毫升新鲜分选培养基中。然后，将细胞通过一个5 mL流式管顶部滤网过滤。用额外的1 mL分选培养基冲洗管子和滤网，并将细胞置于冰上保存。在开始细胞分选前，在流式细胞仪软件的实验菜单下选择新建实验，并打开仪器状态窗口。在参数选项卡中，删除任何未使用的参数。然后，重新打开实验选项卡，并选择补偿设置以创建补偿对照。在浏览器窗口中，单击加号以展开补偿对照样本，运行补偿对照管但不记录数据。根据需要调整检测器电压，使每种荧光染料的阳性染色微球群体位于 10,000 至 100,000 通道之间，并在其主要检测通道中达到最亮。记录每根试管每个参数所需的电压。然后，在补偿对照样本下，单击左侧鼠标键以选中未染色对照管，并将未染色对照管加载到样本载台上。在采集控制窗口中，点击“加载”，并将各个单独的补偿对照运行至所有参数的检测器电压字段中，以手动输入已确定的电压值。点击“记录”以获取未染色对照数据。然后运行所有其余的补偿对照，记录数据时不得更改任何检测器设置。当所有对照分析完成后，运行一管无菌去离子水五分钟，以清除仪器中残留的任何物质，然后再继续下一步操作。为了对细胞进行HRS分选设门，加载实验样本管，并记录至少100,000个事件，同时调整流速，使每秒获取3,000至4,000个事件。确保记录足够多的事件，以可视化可能低至每 1,000 个细胞中仅有一个的细胞群体。为鉴定体细胞 B 细胞和 T 细胞对照，分别圈选 CD20 和 CD5 阳性细胞。当所有圈门设置完成后，将细胞分选至预冷的 15 毫升锥形管中，每管含 7 至 8 毫升收集培养基。分选结束后，将分离的细胞群体转移至1.5毫升微量离心管中，通过离心形成细胞沉淀。随后，用1毫升新鲜PBS洗涤细胞，并小心移除各管中的上清液，注意不要扰动微小的细胞沉淀。文库扩增和8X磁珠纯化后，应在目标范围内观察到片段大小的正常光信号分布。若文库的分布形态偏离此正常形态，则表明存在高分子量或低分子量的异常产物，理想情况下不应进行测序。例如，接头二聚体有时会在第一次8X磁珠纯化过程中残留，表现为在125至130个碱基对附近的一个尖锐峰。在此情况下，应额外进行一次带尖端的磁珠纯化，随后重复检测片段大小分布，以确保成功去除二聚体。在每泳道对四个样本进行多重测序后，目标区域可达到中位覆盖深度 50 至 100 X。尽管如此，由 1 纳克文库生成的拷贝数图谱可能会出现假阳性的拷贝数增加和缺失。大约70%的经典型霍奇金淋巴瘤病例携带B2M基因的820位点突变和/或缺失，这些突变和缺失表现为克隆性，可用于估算相对肿瘤含量。若使用T细胞作为体细胞对照，HRS测序将显示T细胞受体α、δ和β基因位点出现显著的拷贝数增加，同时B细胞受体重链以及κ轻链位点出现显著丢失，整体突变负荷为每外显子病例100至400个体细胞突变。一旦掌握，该技术包括细胞分选和测序文库构建，若操作得当，可在三到四天内完成。通过此方法，我们可开展更大规模的前瞻性研究及其他方法，如表观遗传学、蛋白质组学和代谢组学，以更深入地了解霍奇金淋巴瘤，并推动更具特异性的个体化治疗。该方法建立后，使我们能够以较高纯度且相对大量的数量研究HRS细胞。观看本视频后，您应能充分理解如何分离 HRS 细胞并启动其基因组分析。

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经典霍奇金淋巴瘤的芦苇细胞的流分选和外显子测序

本视频介绍了使用凝胶型十交联葡聚糖G-10柱从骨髓基质细胞中分离急性淋巴细胞白血病细胞的方法。该方法有助于回收已迁移至贴壁骨髓基质细胞层下方的肿瘤细胞群体，从而生成一个 "相位暗场"...

基于G-10柱的白血病细胞分选：一种从骨髓基质细胞中纯化急性淋巴细胞白血病细胞的方法

在本视频中，我们介绍一种基于流式细胞术从人外周血B细胞中分选初始B细胞、记忆B细胞以及浆母细胞/浆细胞亚群的实验方案。通过荧光标记抗体与B细胞表面表达的CD19、CD27和CD38受体结合，可区分不同的B细胞亚群，随后进行细胞分选。...

基于流式细胞术的循环B细胞亚群分选

本文介绍了一种从脐带血中分离前体B细胞亚群的实验方案。可从这些细胞中提取足量且高质量的核酸，并用于后续基于DNA或RNA的检测分析。...

从脐带血中分离前体B细胞亚群

本文介绍了一种结合两种蛋白质组学技术的实验方案，即二维凝胶电泳（2DE）与质谱分析（MS），用于鉴定两个或多个原始样本组之间差异表达或发生翻译后修饰的蛋白质。该方法结合功能实验，可实现对预后标志物或治疗靶点的鉴定与表征。...

从二维电泳凝胶斑点到蛋白质功能：慢性淋巴细胞白血病中HS1蛋白的研究启示

为了监测血红蛋白病患者在干细胞移植后的植入情况，需要对供体来源的细胞进行定量。可通过结合基于流式细胞术的细胞分选、集落形成实验以及后续的短串联重复序列分析，来评估红系细胞区室中前体细胞的增殖与分化能力。...

血红蛋白病患者造血干细胞移植后残余供体红系祖细胞的检测

检测微小残留病（MRD）是急性髓系白血病（AML）中用于优化风险评估和预测复发的重要预后生物标志物。这些关于MRD一致且准确识别与检测的最佳实践指南和建议，可有助于制定有效的AML治疗决策。...

全面采样与处理骨髓以检测急性髓系白血病中可测量残存病灶及白血病干细胞的实验方案

我们概述了一种通过流式细胞术检测原代急性髓系白血病细胞上白血病干细胞标志物共表达的实验方案。我们展示了如何定量分析三种具有不同程度成熟特征的前体细胞群以及一个假定的白血病干细胞（LSC）群体。我们已在相应的患者来源异种移植模型中证实了这些细胞群的存在。...

通过流式细胞术在初诊及随访时评估原发性急性髓系白血病和患者来源异种移植模型中的白血病干细胞

批量基因表达检测会掩盖异质性细胞群体中单个细胞的差异。本文介绍了一种将单细胞基因表达分析与基于荧光激活细胞分选（FACS）的索引分选相结合的实验方案，可用于解析细胞异质性，并在分子水平上对免疫表型不同的细胞亚群进行特征鉴定。...

一种用于表征人类干细胞与祖细胞群体分子及免疫表型异质性的组合式单细胞方法

我们介绍一种结合免疫磁珠和荧光激活细胞分选的方法，用于分离和分析外周血单个核细胞中的特定免疫细胞亚群（单核细胞、CD4+ T细胞、CD8+...

儿童传染性单核细胞增多症外周血样本中免疫细胞亚群的分离

本文介绍了一种基于流式细胞术的技术，可同时测量细胞分裂次数、细胞表面表型以及细胞间的亲缘关系。这些特性可通过基于置换的统计框架进行检验。...

同时评估亲缘关系、分裂次数和表型 通过 造血干细胞与祖细胞的流式细胞术

了解从经典霍奇金淋巴瘤肿瘤中通过流式细胞术分选分离霍奇金里德-斯特恩伯格细胞的方法，用于高质量全外显子组测序。该技术无需预扩增即可生成肿瘤来源DNA，有助于识别关键驱动突变和免疫逃逸突变。

流式分选与经典霍奇金淋巴瘤中里-施细胞的外显子组测序

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