流式分选与经典霍奇金淋巴瘤中里-施细胞的外显子组测序

本实验的总体目标是从富含炎性淋巴细胞的经典型霍奇金淋巴瘤（CHL）肿瘤组织中分离并富集具有活性的霍奇金-里德-斯特恩伯格（Hodgkin Reed-Sternberg，HRS）细胞，以制备和分析高质量的全外显子组高通量测序数据。该方法可解答经典型霍奇金淋巴瘤（CHR）生物学中的关键问题，包括关键驱动突变的鉴定、免疫逃逸相关突变的识别，以及分类内部基因多样性的分析。该技术所获得的肿瘤来源DNA在质量和纯度方面均非常高。

无需预扩增步骤即可促进下一代测序文库的构建。该技术可能对霍奇金淋巴瘤的诊断具有重要意义，因其有助于疾病的亚型分类及预后判断。此外，该技术还可能影响治疗方案的选择，因为某些基因改变可能提示对特定药物的敏感性或耐药性。

Jonathan From 首次提出这一想法，当时他发现了通过流式细胞术可视化HRS细胞的方法，并首次对这些细胞进行了分选实验。在准备细胞之前，将预滴定的抗体混合于避光的玻璃小瓶中。然后加入PBS和BSA，使抗体混合液总体积达到100 µL。

将冻存管从液氮中取出，放入装有冰块或干冰的容器中。接着，在37°C水浴中快速解冻目标细胞。当仅剩少量冰晶时，将细胞悬液倒入含有45毫升37°C解冻培养基的50毫升锥形管中，并用1毫升新鲜解冻培养基冲洗冻存管两次。

合并两次洗涤液后，将细胞在室温下消化15分钟。待细胞重新平衡后，通过离心收集细胞。弃去上清液，仅保留最后200微升。

将细胞重新悬浮于剩余的冻存复苏培养基中，静置2至3分钟。随后，在100微升抗体混合液中室温避光孵育15分钟。孵育结束后，用3毫升分选培养基洗涤细胞，并将细胞沉淀重新悬浮于1毫升新鲜分选培养基中。

然后，将细胞通过一个5 mL流式管顶部滤网过滤。用额外的1 mL分选培养基冲洗管子和滤网，并将细胞置于冰上保存。在开始细胞分选前，在流式细胞仪软件的实验菜单下选择新建实验，并打开仪器状态窗口。

在参数选项卡中，删除任何未使用的参数。然后，重新打开实验选项卡，并选择补偿设置以创建补偿对照。在浏览器窗口中，单击加号以展开补偿对照样本，运行补偿对照管但不记录数据。

根据需要调整检测器电压，使每种荧光染料的阳性染色微球群体位于 10,000 至 100,000 通道之间，并在其主要检测通道中达到最亮。记录每根试管每个参数所需的电压。

然后，在补偿对照样本下，单击左侧鼠标键以选中未染色对照管，并将未染色对照管加载到样本载台上。在采集控制窗口中，点击“加载”，并将各个单独的补偿对照运行至所有参数的检测器电压字段中，以手动输入已确定的电压值。点击“记录”以获取未染色对照数据。

然后运行所有其余的补偿对照，记录数据时不得更改任何检测器设置。当所有对照分析完成后，运行一管无菌去离子水五分钟，以清除仪器中残留的任何物质，然后再继续下一步操作。为了对细胞进行HRS分选设门，加载实验样本管，并记录至少100,000个事件，同时调整流速，使每秒获取3,000至4,000个事件。

确保记录足够多的事件，以可视化可能低至每 1,000 个细胞中仅有一个的细胞群体。为鉴定体细胞 B 细胞和 T 细胞对照，分别圈选 CD20 和 CD5 阳性细胞。当所有圈门设置完成后，将细胞分选至预冷的 15 毫升锥形管中，每管含 7 至 8 毫升收集培养基。

分选结束后，将分离的细胞群体转移至1.5毫升微量离心管中，通过离心形成细胞沉淀。随后，用1毫升新鲜PBS洗涤细胞，并小心移除各管中的上清液，注意不要扰动微小的细胞沉淀。

文库扩增和8X磁珠纯化后，应在目标范围内观察到片段大小的正常光信号分布。若文库的分布形态偏离此正常形态，则表明存在高分子量或低分子量的异常产物，理想情况下不应进行测序。例如，接头二聚体有时会在第一次8X磁珠纯化过程中残留，表现为在125至130个碱基对附近的一个尖锐峰。

在此情况下，应额外进行一次带尖端的磁珠纯化，随后重复检测片段大小分布，以确保成功去除二聚体。在每泳道对四个样本进行多重测序后，目标区域可达到中位覆盖深度 50 至 100 X。尽管如此，由 1 纳克文库生成的拷贝数图谱可能会出现假阳性的拷贝数增加和缺失。

大约70%的经典型霍奇金淋巴瘤病例携带B2M基因的820位点突变和/或缺失，这些突变和缺失表现为克隆性，可用于估算相对肿瘤含量。若使用T细胞作为体细胞对照，HRS测序将显示T细胞受体α、δ和β基因位点出现显著的拷贝数增加，同时B细胞受体重链以及κ轻链位点出现显著丢失，整体突变负荷为每外显子病例100至400个体细胞突变。

一旦掌握，该技术包括细胞分选和测序文库构建，若操作得当，可在三到四天内完成。通过此方法，我们可开展更大规模的前瞻性研究及其他方法，如表观遗传学、蛋白质组学和代谢组学，以更深入地了解霍奇金淋巴瘤，并推动更具特异性的个体化治疗。该方法建立后，使我们能够以较高纯度且相对大量的数量研究HRS细胞。

观看本视频后，您应能充分理解如何分离 HRS 细胞并启动其基因组分析。