Name: 河豚有毒改进的聚合酶链反应 - 限制性片段长度多态性分型液相色谱/质谱法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 学习利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性结合液相色谱/质谱法对有毒河豚进行快速准确的基因分型。该方法通过反相硅胶整体柱有效分离酶切扩增子，实现基于单同位素质量的精确碱基组成鉴定，从而提升食品安全检测水平。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究得到了日本促进科学基金（15K08060）科研费的资助。

1. DNA 提取
注意：DNA 提取和 PCR 后检测（如凝胶电泳和液相色谱-电喷雾电离质谱）应在不同的房间进行。根据 DNA 提取试剂盒说明书，向洗涤缓冲液 1（含盐酸胍）和洗涤缓冲液 2（不含盐酸胍）中加入乙醇。鱼类样本采自日本的鱼类批发商和零售市场。
<ol>
	<li>取30-50 mg鱼组织置于0.5 ml或1.5 ml的微量离心管中。使用微型刮勺压碎组织（鳍和皮肤除外）。 
	注意：对于鳍组织，使用0.5 ml离心管进行浸泡。</li>
	<li>加入180 µl裂解缓冲液和40 µl蛋白酶K，短暂涡旋混匀。在56 °C的金属浴中孵育2小时或过夜。孵育期间每15分钟短暂涡旋混匀一次。 
	注意：无需完全裂解。</li>
	<li>在13,000 x g下离心5分钟。离心后，若脂肪含量较高的样本（如肝脏）表面出现少量油状物，应弃去。将上清液转移至新的1.5 ml微量离心管中。</li>
	<li>加入200 µl含盐酸胍的变性缓冲液，通过涡旋混匀。再加入200 µl乙醇（99.5%），再次涡旋混匀。</li>
	<li>将混合液转移至置于2 ml收集管中的离心柱中。在13,000 x g下离心1分钟。弃去穿流液。 
	注意：切勿向废液中加入漂白剂，因为盐酸胍与漂白剂反应可能生成高活性化合物。</li>
	<li>加入500 µl洗涤缓冲液1（含盐酸胍），在13,000 x g下离心1分钟。弃去穿流液和收集管。</li>
	<li>将离心柱放入试剂盒提供的新2 ml收集管中。加入500 µl洗涤缓冲液2，在20,000 x g下离心3分钟。弃去穿流液和收集管。将离心柱转移至新的1.5 ml微量离心管中。</li>
	<li>用移液器将200 µl洗脱缓冲液加至离心柱膜的中央。静置1分钟后，在6,000 x g下离心1分钟。</li>
	<li>取50 µl洗脱液加入一次性紫外比色皿中，使用紫外分光光度计测定220-300 nm范围内的紫外吸收光谱及260 nm处的吸光度。</li>
	<li>确认DNA的紫外吸收光谱在260 nm处有吸收峰。使用简单公式 &#34;DNA浓度（ng/µl）= 260 nm处吸光度 × 50&#34; 计算DNA的大致浓度。 
	注意：从河豚鳍组织提取的DNA典型浓度为63 ± 30 ng/µl（n = 20）。</li>
	<li>若DNA浓度高于10 ng/µl，用Tris-EDTA（TE）缓冲液（pH 8）将DNA样本稀释至5 ng/µl。</li>
	<li>将样本在−20 °C下保存，或直接进行PCR扩增（第2节）。</li>
</ol>
2. PCR
<ol>
	<li>在洁净工作台上，将每个提取的DNA样本、阳性对照（含有目标序列的0.2 µM合成寡核苷酸，溶于pH 8.0的TE缓冲液）和阴性对照（以超纯水代替DNA样本）分别在冰上设置25 µl PCR反应体系，具体组分见表1和表2，以避免污染。 
	注意：为便于操作，可预先配制足量的预混液（包含除模板DNA外的所有试剂），然后分装使用。应选用具有校对活性的DNA聚合酶，以避免在PCR产物的3'端添加A突出末端。</li>
	<li>使用热循环仪进行PCR扩增，循环程序见表3。</li>
</ol>
3. 酶消化
<ol>
	<li>向 PCR 溶液中加入 2 µl 含有 100 mM Tris-HCl (pH 7.5)、100 mM MgCl2、10 mM 二硫苏糖醇和 500 mM NaCl 的溶液。</li>
	<li>加入 1 µl 的每种限制性内切酶（Dra I 和 Msp I），轻轻混匀。在 PCR 仪中 37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>在 72 °C 下孵育 5 分钟，以激活残留的 DNA 聚合酶，该酶可填充 Msp I 产生的黏性末端。</li>
	<li>可选：使用交联比（%C，双丙烯酰胺百分比）为 3.33（wt %）、聚丙烯酰胺凝胶浓度（%T）为 15（% w/v）38 的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析各 2.5 µl 反应溶液。用荧光 DNA 染料染色，并在蓝光透射仪上配合琥珀色滤光片观察双链 DNA。</li>
	<li>使用 0.2–0.5 µm 的离心过滤装置过滤反应溶液，以防止堵塞而损坏分析柱。</li>
	<li>将滤液转移至锥形聚丙烯小管中，于 -20 °C 保存直至分析。</li>
</ol>
4. 液相色谱-电喷雾电离质谱分析
<ol>
	<li>称取 67.2 g（约 42 ml）HFIP 和 1.52 g（约 在1 L的瓶子中加入2.0 ml三乙胺（TEA），加入955 ml超纯水（液相色谱/质谱级），使用磁力搅拌器搅拌至试剂完全溶解。取该溶液适量，用pH计检测pH值（应在7.85至7.95之间，理想pH值为7.9）。 
	注意：切勿将分装液返回瓶中，以免金属离子污染。如果pH值不是7.9，可加入少量HFIP或TEA调节pH，并重新测定pH值。</li>
	<li>将瓶子连接至液相色谱仪的A管路，同时使用便携式直冷冰箱（家用型）对瓶子进行冷却，以防止挥发。将另一装有甲醇的瓶子连接至B管路。</li>
	<li>连接保护柱和分析柱（2.0 × 50 mm，介孔尺寸 = 30 nm）至液相色谱仪。开始流过初始流动相（95% A 和 5% B）以平衡色谱柱。</li>
	<li>配制 0.5 mg/ml 三氟乙酸钠（pH 3.5）作为校准物39.
	<ol>
		<li>称取50 mg（约 34 µl 三氟乙酸置于烧杯中。</li>
		<li>加入30 ml超纯水，借助pH计，用10 mM氢氧化钠滴定至pH 3.5。</li>
		<li>用超纯水定容至 50 ml，加入 50 ml 乙腈（LC/MS 级）并混匀。</li>
		<li>取部分工作液置于室温保存，其余溶液在 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>降低C-trap的氮气压力，步骤如下。 
	注意：近期适用于完整蛋白质分析的傅里叶变换质谱仪均配备可控制压力的控制软件。
	<ol>
		<li>取下质谱仪的左上盖。C-陷阱阀位于左前方的角落处。</li>
		<li>在控制软件的仪器状态窗口中检查高真空压力值。 
		注意：该值通常为 3 x 10−8 巴</li>
		<li>拉动旋钮解锁，并缓慢逆时针旋转旋钮，将高真空压力降至三分之一（通常为 1 x 10⁻³ Torr）。−8 bar）。所示压力应延迟后逐渐变化。忽略低压警告消息。按下旋钮以锁定。</li>
		<li>为安全起见，重新装好顶盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用三氟乙酸钠校准质谱仪39. 
	注意：每日质量校准可用本方案替代，但在执行本校准前，应已完成制造商建议的校准程序。
	<ol>
		<li>在调谐软件的仪器控制框中设置扫描参数和加热电喷雾离子源（ESI）参数如下：扫描类型为全扫描MS；扫描范围 m/z 500–4,000；碎裂（源内碰撞诱导解离（CID）电压 60 eV；负离子模式；自动增益控制（AGC）目标值 1 × 106最大注入时间 50 毫秒；鞘气流速 5；辅助气流速 0；吹扫气流速 0；喷雾电压 3 kV；毛细管温度 320 °C；S-透镜射频（RF）水平 100；加热器温度 30 °C。
		<ol>
			<li>输入需监测的阴离子列表 m/z 792.85908, 1064.80870, 1336.75832, 1608.70794, 1880.65755, 2152.60717, 2424.55679, 2696.50640, 2968.45602, 3376.38045.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将加热的ESI探针移至更靠近质谱仪接口处（位置B）。用一根管路将探针与注射器连接。</li>
		<li>使用内置的注射泵以 10 µl/min 的流速持续注入校准物。仅检测质量较低的 6 个离子（m/z 792.85908-2152.60717）在自定义校准表中。
		<ol>
			<li>信号强度稳定后进行校准。校准完成后，仅检查六个较高质量的离子（m/z 1880.65755-3376.38045）并进行校准。避免同时使用所有离子进行校准，以防校准失败。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将探头移至对应流速为0.4 ml/min的位置（位置D），并使用惰性金属管连接至液相色谱仪。</li>
	<li>在调谐软件的仪器控制框中设置加热电喷雾离子源（heated ESI）参数如下：鞘气流速 50；辅助气流速 15；吹扫气流速 1；喷雾电压 2.5 kV；毛细管温度 350 °C；S-透镜射频水平 100；加热器温度 350 °C。</li>
	<li>在仪器设置窗口中设定质谱仪的采集参数如下：方法持续时间 8 min；分流阀，3.5–6 min 通向质谱仪，0–3.5 和 6–8 min 通向废液；运行时间 3.5 至 6 min；电离模式为负离子；源内 CID 电压 15.0 eV；微扫描次数 3；标称分辨率（在 m/z 200) 140,000；AGC 目标值 1 × 106；最大离子时间 50 msec；扫描次数 1；扫描范围 m/z 700-3,500；谱图数据类型为轮廓模式</li>
	<li>设置液相色谱仪参数如下：柱温箱温度 20 °C；自动进样器温度 10 °C；梯度程序 0–0.5 min 5% B，0.5–1 min 5–30% B，1–3.5 min 30–40% B，3.5–5 min 40–98% B，5–6 min 98% B，6–6.05 min 98–5% B，6.05–8 min 5% B；流速 0.4 ml/min。</li>
	<li>轻敲样品瓶底部以排除气泡。将样品瓶置于样品架上，使用自动进样器进样1.0 µl开始分析。</li>
	<li>使用浏览器软件打开原始数据文件，确认所有采集均已完成，包括阳性和阴性对照。 
	注意：当河豚鱼DNA成功扩增并消化后，在总离子流色谱图中通常会在4-5.5分钟的保留时间处观察到两个或三个峰。</li>
</ol>
5. 去卷积与解析
<ol>
	<li>启动去卷积软件，选择实验类型 &#34;自动提取（同位素分辨）&#34;。</li>
	<li>使用以下参数编辑方法：输出质量 M；信噪比阈值 3；相对丰度阈值 0；负电荷 是；计算提取离子流色谱图（XIC） 是；m/z 范围 700–3,500；电荷载体 H+；检测到的最小电荷数 3；核苷酸同位素比例；拟合因子 80%；残差阈值 0%；考虑重叠 是；电荷范围 3–50；最小强度 1；预期强度误差 3。
	<ol>
		<li>将该方法另存为新方法并选中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择包含原始数据文件的目录，选中待分析的原始数据文件，然后点击“添加到队列”按钮。</li>
	<li>在“运行队列”标签页中点击“运行”按钮，开始去卷积分析。</li>
	<li>队列完成后，选中某一行，点击上方标题栏中的“打开结果”，以获取去卷积分析结果。</li>
	<li>根据保留时间为 4–5.5 分钟处峰所得到的单一同位素质量，结合表 4解读结果。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突可披露。

提取DNA时，采用市售的血液和组织DNA提取试剂盒，按照生产商提供的方案稍作修改（蛋白酶K用量及裂解液离心步骤）进行操作。然而，只要能够以适当的回收率和纯度提取出可用于PCR的细胞DNA，任何DNA提取试剂盒均可使用。该方法已成功应用于肌肉、鳍、肝脏、卵巢和皮肤组织37。其中，鳍组织尤为适用，因其表面积较大，可实现蛋白酶K介导的快速裂解。新鲜、冷冻、干燥、煮沸和烘烤的河豚样品均已被成功检测37。
PCR 引物组（表 1）针对河豚设计，用于扩增河豚线粒体 16S 核糖体 RNA 基因。待扩增的目标 DNA 长度为 114–115 bp（Takifugu 属）和 86 bp（Lagocephalus 属）（表 5）。为便于方法开发，使用含有目标序列的合成寡核苷酸作为参考，而非采集真实的河豚样本。可根据实验目的更换引物组，但酶切后的最终 DNA 长度应小于 100 nt，以保证质谱质量，满足成功去卷积的要求。此外，当目标寡核苷酸长度超过约 75 nt 且质谱质量不足以实现有效去卷积时，应降低 C-Trap 中的氮气压力。此类限制可通过仪器软件的最新进展进行调控；否则，必须按照方案部分所述调整仪器机箱内 C-Trap 的阀门。在样品制备方面，为获得合适的峰形、足够的峰强度和稳定的保留时间，使用不含去垢剂的试剂至关重要31。
已使用PS-DVB毛细管整体柱21,24-33、C18反相颗粒硅胶柱23,40,41以及亲水相互作用色谱（HILIC）柱42进行寡核苷酸的液相色谱-电喷雾质谱（LC/ESI-MS）分析。其中，毛细管整体柱在分离能力方面优于其他类型色谱柱，但以往研究中所用的毛细管整体柱均为自制，且在低流速（2 µl/min）下运行，需配备专用于微流液相色谱的仪器。为便于操作，本研究评估了市售色谱柱在较高流速（100–400 µl/min）下分离长链寡核苷酸的性能。利用上述色谱柱分离了三对DNA双链（26、37和53 bp），C18键合颗粒硅胶柱和PS-DVB整体柱的循环时间分别为65分钟和70分钟，而C18键合硅胶整体柱的循环时间仅为8分钟（图1）。考虑到快速分析的需求，尽管C18键合硅胶整体柱的分离能力有限，仍被选为本研究所用色谱柱；然而，当需要更高分离度时，其余两种色谱柱仍可选用。理论上，整体柱不存在颗粒间的间隙体积，流动相被迫流经固定相的孔隙，同时保持一致的流路长度，从而实现高效分离27。此类效应在分析如寡核苷酸等生物大分子时尤为显著，因为大分子扩散较慢。整体柱的一个实际优势是其背压低于颗粒硅胶柱27。即使在高流速（400 µl/min）和低柱温（20 °C）条件下，系统的最大背压也仅为12.5 MPa37。这是首次展示C18键合硅胶整体柱在长链寡核苷酸快速分析中的优势。由于采用高流速，无需专用的微流液相仪器，也无需在接口处进行精确对准。但需要使用加热电喷雾电离（ESI）探针，以解离DNA双链并促进DNA的离子化，具体将在后文描述。
离子对色谱法常用于寡核苷酸的质谱兼容性分离。然而，离子对试剂通常会干扰电喷雾电离（ESI）过程，降低ESI-MS的灵敏度。因此，常使用HFIP作为流动相以提高寡核苷酸的检测灵敏度。但是，HFIP（沸点59 °C）在接口处的挥发速度比甲醇（沸点65 °C）更快，因此该溶剂的损失会导致pH升高，进而促进离子对试剂的解离即，TEA）从寡核苷酸上解离。由于本方法采用加热电喷雾电离探针，在350 °C下用热氮气雾化洗脱液，该效应可能被过度放大。Erb和Oberacher建议在基因分型分析中使用环己基二甲基铵乙酸盐（CycHDMAA；pH 8.4）替代HFIP-TEA缓冲液，因其可减少与痕量金属离子形成加合物的现象。33作者推断，CycHDMAA 本身抑制了金属加合物的形成。尽管文献中有相关报道，但在本方法中并未观察到明显的加合物生成。此外，HFIP-TEA-甲醇体系的一个显著优势在于，分析一段86 bp扩增片段时，该体系所获得的峰面积是CycHDMAA-乙腈体系的17倍 T. poecilonotus （数据未显示）。然而，HFIP-TEA-甲醇体系的一个缺点是其成本相较于CycHDMAA-乙腈体系有所增加。
计算单一同位素质量需要分离多电荷离子的同位素峰。因此，分辨率对本分析至关重要。尽管所需的分辨率取决于分析物的碱基对长度，但对于短链寡核苷酸的分析，分辨率仅为数万的传统飞行时间（TOF）分析器可能有所局限。
所示理论单一同位素质量 表 4 根据分析物相应的碱基组成进行计算。或者，Muddiman 等 开发了一款软件应用程序，用于根据精确质量计算碱基组成43. 类似的程序被整合到自动化的 ESI-MS 系统中16-18这些算法的使用可能会提高本方法的稳健性，因为由于不可避免的测量误差导致3 ppm的质量容差，测得的单同位素质量并不总是对应唯一的碱基组成。遗憾的是，我们未能在本研究中获得这些软件产品。
目前基于单同位素质量的物种鉴定方法不仅适用于河豚鱼的区分，也可用于其他DNA多态性的检测，因为本方法基于碱基组成的分析，并不涉及专为河豚鱼设计的特定步骤。在DNA多态性检测方面，专用的电喷雾电离质谱（ESI-MS）系统实现了完全自动化且操作简便，可能适用于病原体检测等诊断用途15,17,18,20,30。相反，本方法也可使用常见的科研仪器和设备完成，因此同样适用于科研目的。电喷雾电离质谱已成功应用于人类DNA多态性的研究，例如单核苷酸多态性13,28,32、短串联重复序列26以及线粒体DNA分析16,19。微小RNA也已通过毛细管液相色谱/电喷雾电离质谱（LC/ESI-MS）进行了分析44。这些已发表的应用均可通过本方法实现。此外，由于采用了低温分离技术，该方法还可能适用于寡核苷酸与小分子化合物之间相互作用的监测，例如抗生素与核糖体RNA之间的相互作用45。在此类情况下，寡核苷酸与小分子化合物可被同时检测，这正是采用LC/ESI-MS技术的一大优势。
该技术存在一定的局限性，即仪器不适合进行平行分析，而传统的桑格测序和实时PCR等方法则可实现平行分析。此外，当前方法仅能确定碱基组成，无法区分同一分子内的碱基替换。然而，与基于DNA结合染料的技术（如凝胶电泳和实时PCR）相比，本文所述的基于质谱的DNA分析方法在准确性方面仍具有优势。

质谱法（MS）是一种用于快速、可靠地鉴定核酸的成熟技术，其中基质辅助激光解吸/电离（MALDI）和电喷雾电离（ESI）被用于离子化过程。1,2基质辅助激光解吸电离（MALDI）技术通常与飞行时间（TOF）分析器联用；然而，由于后续存在片段化、加合物形成以及离子化效率低等问题，MALDI-TOF质谱技术的应用仅限于较短的寡核苷酸（约25个核苷酸（nt））1,2相比之下，ESI适用于较长的寡核苷酸（&#62;100 nt），但存在多种多电荷离子的电荷态（[M−nH]n−) 由生物大分子同时产生，因此分析物的质量可能超过上限 m/z 光谱仪的检测范围。这需要对卷积光谱进行解析， 即，通过去卷积将电荷态系列转换为相应的质量。
对于小分子的质量测定，单一同位素质量的峰 即，仅含各元素最常见同位素的分子质量是最丰富且在自然界中可观测到的3随着分子量的增加，同位素分布向更高质量方向移动 m/z 单一同位素峰被基线噪声掩盖3-5当质量大于10 kDa时，单一同位素峰不再可检测3，测量时采用平均分子质量而非单一同位素质量5在这种情况下，只有当使用高分辨质谱分析器（如飞行时间质谱仪、经傅里叶变换修饰的Kingdon离子阱分析器）时，才能观察到各个峰之间相隔1 Da的同位素分布。6，或使用傅里叶变换离子回旋共振分析仪进行分析。然而，最丰富的峰有时与平均分子质量不一致5这些问题可能导致难以准确定量分析物。
鉴于稳定同位素天然丰度的差异以及确定平均分子质量的困难，单一同位素质量的测定是生物大分子质谱表征的理想选择3,4。在实际操作中，无论是否能够观测到单一同位素峰，均可通过将实测同位素分布模式与基于模型分析物计算得到的理论分布模式进行比对，从而估算单一同位素质量4,7-10。该拟合算法8目前已集成于专有软件中。
在电喷雾电离质谱（ESI-MS）分析中，为避免因离子抑制和加合物形成导致电离失败，需对DNA双链进行解离，并对样品进行纯化和脱盐处理2,10-14。尽管这些步骤较为繁琐，但目前已商业化开发出完全自动化的分析系统，整合了聚合酶链式反应（PCR）、样品前处理和ESI-MS技术，用于病原体检测15-20。另一种方法是引入液相色谱（LC）进行分离。LC可在线将分析物与共存物质分离，从而无需在电离前进行复杂的样品制备21,22。然而，由于核苷酸具有多聚阴离子特性，使用与质谱兼容的流动相分离核酸比分离大多数其他化合物（如药物、肽段和蛋白质）更为困难。目前最成功的LC/ESI-MS应用案例采用的是离子对反相液相色谱法。Apffel et al. 首次提出使用1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇（HFIP）-三乙胺（TEA）-甲醇作为流动相，用于短链寡核苷酸的分离与检测23。已有报道利用毛细管聚合物整体柱结合LC/ESI-MS基因分型技术，实现对较长寡核苷酸的分离，并应用于病原体种类鉴别、单核苷酸多态性及短串联重复序列的分析1,21,24-33。
在日本和美国，由于河豚的误判和不当处理，曾发生严重的食物中毒事件，尽管河豚的销售和处理受到食品安全法规的严格管控34,35。此外，日本曾发生过使用河豚提取物故意杀人的案件36。因此，从公共卫生和法医学调查的角度，都需要对河豚物种进行区分。此外，由于红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）的价格远高于其他种类的河豚，在食品欺诈调查中也同样需要具备物种鉴别能力。
本文详细描述了一种利用反相硅胶整体柱和高分辨质谱仪，通过液相色谱-电喷雾电离质谱法（LC/ESI-MS）测定PCR产物单一同位素质量的方法。该方法特别设计用于基于PCR限制性片段长度多态性（RFLP）技术37来区分有毒河豚物种，这是首次利用质谱法实现动物物种鉴别的实例。

<table><tbody><tr><td>DNeasy 血液 &amp;amp; 组织试剂盒（50）</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>DNA提取试剂盒</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（99.5+ vol%）</td><td>和光</td><td>054-07225</td><td>用于洗涤缓冲液的稀释</td></tr><tr><td>TE缓冲液（pH 8.0）</td><td>和光</td><td>310-90023</td><td>用于DNA样本的稀释</td></tr><tr><td>PCR 引物</td><td>Fasmac</td><td>NA</td><td>由供应商使用反相萃取柱进行纯化</td></tr><tr><td>模板DNA</td><td>Eurofins Genomics</td><td>NA</td><td>由供应商通过高效液相色谱法纯化</td></tr><tr><td>超纯水</td><td>NA</td><td>NA</td><td>使用默克密理博（Merck Millipore）Milli-Q Direct 水纯化系统制备的超纯水，用于样品制备</td></tr><tr><td>无去垢剂 5x Phusion HF 缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>F-520L</td><td>使用替代所提供的DNA聚合酶缓冲液</td></tr><tr><td>Pfu-X DNA聚合酶</td><td>Jena Bioscience</td><td>PCR-207S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP混合液（每种20 mM）</td><td>Jena Bioscience</td><td>NA</td><td>随DNA聚合酶提供</td></tr><tr><td>10&amp;times; 通用缓冲液 M</td><td>Takara Bio</td><td>NA</td><td>含有 100 mM Tris-HCl (pH 7.5)、100 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，10 mM 二硫苏糖醇和 500 mM NaCl</td></tr><tr><td>Dra I</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>FD0224</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>Msp I</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>FD0544</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）</td><td>Fluka</td><td>42060-50ML</td><td>液相色谱-质谱联用级洗脱液添加剂</td></tr><tr><td>三乙胺（TEA）</td><td>Fluka</td><td>65897-50ML</td><td>液相色谱-质谱联用级洗脱液添加剂</td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>用于校准品的制备。</td></tr><tr><td>氢氧化钠（1.0 M）</td><td>Fluka</td><td>72082</td><td>用超纯水稀释至 10 mM，用于三氟乙酸的滴定。</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td>用于配制校准品，液相色谱/质谱级。</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>关东</td><td>25185-76</td><td>用于流动相，LC/MS级。</td></tr><tr><td>水</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>W6-1</td><td>用于流动相，LC/MS级。</td></tr><tr><td>微型离心管（0.5 ml）</td><td>Eppendorf</td><td>0030123301</td><td>PCR 级无核酸酶</td></tr><tr><td>微型离心管（1.5 ml）</td><td>Eppendorf</td><td>0030123328</td><td>PCR 级清洁</td></tr><tr><td>UVette</td><td>Eppendorf</td><td>0030106300</td><td>一次性紫外比色皿</td></tr><tr><td>Gel Green</td><td>Biotium</td><td>41004</td><td>荧光DNA染料</td></tr><tr><td>Cosmospin 滤器 G（0.2 &amp;mu;m)</td><td>Nakalai Tesque</td><td>06549-44</td><td>由亲水性聚四氟乙烯（PTFE）膜制成。任何离心过滤装置（孔径，0.2&amp;ndash;0.5 &amp;mu;m) 可使用由亲水性PTFE或其他低结合膜制成的材料。</td></tr><tr><td>300 &amp;mu;l PP 螺旋盖小瓶</td><td>美国色谱供应公司</td><td>V0309P-1232</td><td></td></tr><tr><td>预组装螺口盖和隔垫</td><td>Finneran</td><td>5395-09R</td><td></td></tr><tr><td>单双十八烷基分析柱（2.0&amp;times;50 mm，介孔尺寸 = 30 nm</td><td>京都单科技</td><td>2050H30ODS</td><td>在日本以外地区，可通过 GL Sciences 的经销商购买。（http://www.glsciences.com/distributors/）</td></tr><tr><td>单双C18保护柱</td><td>京都单科技</td><td>GCSET-ODS3210</td><td>含支架。</td></tr><tr><td>Cadenza CW-C18 (3.0&amp;times;250 mm</td><td>Imtakt</td><td>CW036</td><td>C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;键合颗粒硅胶柱</td></tr><tr><td>ProSwift RP-4H (1.0&amp;times;250 mm</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>066640</td><td>聚（苯乙烯-二乙烯基苯）整体柱</td></tr><tr><td>Themo Mixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382 000.023</td><td>用于鱼类组织的消化。</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>岛津</td><td>UV-3150</td><td>DNA浓度的定量</td></tr><tr><td>热循环仪</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>便携式冰箱</td><td>Twinbird</td><td>D-CUBE</td><td>为防止HFIP挥发，水相流动相应置于冰盒中替代。</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 液相色谱仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive 质谱仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NA</td><td>配备改进型金登离子阱分析器的傅里叶变换质谱仪。</td></tr><tr><td>蛋白质解卷积 3.0</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NA</td><td>使用版本 3.0 或更高版本，且具备核苷酸同位素分布模型的软件。</td></tr></tbody></table>

通过液相色谱/质谱法改进河豚毒素鱼类的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性基因分型

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

本文描述了一种通过液相色谱/电喷雾电离质谱法（LC/ESI-MS）对有毒河豚物种进行基因分型的聚合酶链式反应（PCR）-限制性片段长度多态性（RFLP）方法的改进版本。DNA提取采用基于二氧化硅膜的DNA提取试剂盒进行。使用无去污剂的PCR缓冲液完成PCR扩增后，无需纯化反应体系，直接向溶液中加入限制性内切酶。分离和检测分别采用反相二氧化硅整体柱和配备改进型Kingdon阱分析器的傅里叶变换高分辨质谱仪。流动相由400 mM 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇、15 mM 三乙胺（pH 7.9）和甲醇组成，流速为0.4 ml/min。LC/ESI-MS分析的循环时间（包括色谱柱平衡）为8分钟。采用带有寡核苷酸同位素分布模型的去卷积软件，从质谱图中计算相应的单一同位素质量。在分析寡核苷酸（长度范围为26–79个核苷酸）时，质量准确度为0.62 ± 0.74 ppm（n = 280），且在180小时内无需使用锁定质量标准即可保持优异的准确度和精密度。

评估了三种 commercially-available 柱用于在 100–400 µl/min 流速下分离长寡核苷酸。比较了宽孔十八烷基碳链（C18）键合颗粒硅胶柱（a）、一种 commercially-available 聚（苯乙烯-二乙烯基苯）（PS-DVB）整体柱（b）和一种 C18 键合硅胶整体柱（c）（图 1）。使用所有这些柱分离了三对 DNA 双链体（26、37 和 53 bp），后续研究中选用了 C18 键合硅胶整体柱。
从肌肉组织中提取的DNA样本分析的代表性结果 T. rubripes 如图所示 图2同位素分辨峰，如图所示 图 2a，是成功计算单同位素质量所必需的。单同位素质量的理论值与实测值 T. rubripes 如图所示 图2b由于内切酶消化是在PCR扩增后直接进行，未经过纯化步骤，因此由Msp I内切酶产生的3ʹ黏性末端会被残留的DNA聚合酶补平。根据对源自合成DNA模板的扩增子的分析，质谱准确度范围为-2.48至2.40 ppm（平均为0.62 ± 0.74 ppm） n = 280）。因此，采用 3 ppm 的质量容差用于区分物种（表4）。利用该表格，从市场和商店获取的所有河豚样本均被准确地鉴别为特定物种37.
根据对T. chrysops合成DNA模板样品的周期性分析，在至少180小时内无需进行任何质量校准，所有分析物的单同位素质量均在± 3 ppm范围内成功测定（图3）。这意味着质量校准只需每周进行一次。
<img alt="比较硅胶柱和整体柱的色谱图，显示DNA片段分离情况。" src="/files/ftp_upload/54402/54402fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：使用C18键合颗粒硅胶柱（a，3×250 mm，粒径3 µm）、聚（苯乙烯-二乙烯基苯）（PS-DVB）整体柱（b，1.0×250 mm）和C18键合整体硅胶柱（c，本方法）对源自合成DNA模板的T. pardalis PCR-RFLP产物进行分析所得的总离子流色谱图。 条件（a）：流速0.2 ml/min；甲醇比例，0–2 min为5%，2–5 min为5%–25%，5–20 min为25%–40%，20–35 min为40%–98%，35–50 min为98%，50–51 min为98%–5%，51–65 min为5%。条件（b）：流速0.1 ml/min；甲醇比例，0–2 min为5%，2–5 min为5%–25%，5–35 min为25%–40%，35–40 min为40%–98%，40–55 min为98%，55–56 min为98%–5%，56–70 min为5%。两根色谱柱的温度均为20 °C。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="总离子流色谱图、质谱图及DNA分析图，显示解卷积与单一同位素质量结果。" src="/files/ftp_upload/54402/54402fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2： 分析生肉样品的代表性结果 T. rubripes. (a典型的总离子流色谱图与质谱图。bPCR-RFLP 产物的理论与实测单一同位素质量，源自合成 DNA 模板 T. rubripes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="质量准确性与时间关系图，色谱数据分析，79 nt 和 37 nt 正向、反向。" src="/files/ftp_upload/54402/54402fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3： 稳定性测试。 每隔 10 小时对来源于 T. chrysops 合成 DNA 的消化扩增子进行分析。测试期间未进行质量校准。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>名称</td>
			<td>序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lago86F</td>
			<td>5ʹ-CCATGTGGAATGAAAACACC-3ʹ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>taki114F</td>
			<td>5ʹ-AAAAACAAGAGCCACAGCTCTAA-3ʹ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fugu86-114R</td>
			<td>5ʹ-CCCTAGGGTAACTCGGTTCG-3ʹ</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：PCR引物。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PCR 试剂</td>
			<td>使用体积</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>超纯水</td>
			<td>15.75 μl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无去污剂 5x 缓冲液</td>
			<td>5.0 μl</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP 混合液（每种 10 mM）</td>
			<td>0.5 μl</td>
			<td>0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>引物混合液（TE 缓冲液 pH 8.0 中含 lago86F、taki114F 和 fugu86-114R，每种 10 μM）</td>
			<td>1.0 μl</td>
			<td>每种 0.4 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA 聚合酶（2.5 单位/μl）</td>
			<td>0.25 μl</td>
			<td>0.1 单位/μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE 缓冲液 pH 8.0 中的模板 DNA（提取样品为 5.0–10 ng/μl，合成 DNA 作为阳性对照为 0.2 μM）</td>
			<td>2.5 μl</td>
			<td>提取 DNA 为 0.5–1.0 ng/μl，合成 DNA 为 20 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>总计：25 μl</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：25 µl 规模PCR反应的组分。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>循环</td>
			<td>条件</td>
			<td>功能</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>95 °C 下 2 分钟</td>
			<td>初始变性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>95 °C 下 30 秒</td>
			<td>变性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>56 °C 下 30 秒</td>
			<td>退火</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>72 °C 下 30 秒</td>
			<td>延伸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>重复步骤 2–4（共 30 个循环）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>72 °C 下 7 分钟</td>
			<td>最终延伸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>12 °C 保温直至取出样品</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：PCR程序。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">4.0–5.5 分钟保留时间处的峰数量</td>
			<td colspan="2">该范围内第三个峰的单同位素质量（Da）</td>
			<td colspan="2">该范围内第二个峰的单同位素质量（Da）</td>
			<td rowspan="2">河豚物种</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>较小链</td>
			<td>较大链</td>
			<td>较小链</td>
			<td>较大链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">2</td>
			<td rowspan="5">→</td>
			<td rowspan="5">→</td>
			<td>15890.707–15890.803</td>
			<td>16177.531–16177.629</td>
			<td>L. inermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15921.702–15921.797</td>
			<td>16146.537–16146.634</td>
			<td>L. gloveri</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15930.713–15930.809</td>
			<td>16137.525–16137.622</td>
			<td>L. lunaris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15937.697–15937.792</td>
			<td>16131.537–16131.634</td>
			<td>L. wheeleri</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24173.034–24173.179</td>
			<td>24566.905–24567.053</td>
			<td>T. chrysops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="6">3</td>
			<td rowspan="2">16295.706–16295.804</td>
			<td rowspan="2">16467.610–16467.709</td>
			<td>11341.851–11341.919</td>
			<td>11466.875–11466.944</td>
			<td>T. pardalis 
			T. snyderi 
			T. ocellatus 
			T. xanthopterus 
			T. stictonotus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11654.908–11654.978</td>
			<td>11770.920–11770.991</td>
			<td>T. niphobles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16296.701–16296.799</td>
			<td>16468.605–16468.704</td>
			<td>→</td>
			<td>→</td>
			<td>T. rubripes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16311.701–16311.799</td>
			<td>16452.610–16452.709</td>
			<td>→</td>
			<td>→</td>
			<td>T. poecilonotus 
			T. exascurus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16320.713–16320.811</td>
			<td>16443.599–16443.697</td>
			<td>→</td>
			<td>→</td>
			<td>T. porphyreus 
			T. obscurus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16599.751–16599.851</td>
			<td>16780.667–16780.767</td>
			<td>→</td>
			<td>→</td>
			<td>T. vermicularis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：基于液相色谱/电喷雾电离质谱法测定的单一同位素质量区分河豚种类。
<img alt="DNA测序结果；表格数据；物种特异性序列；扩增DNA长度分析。" src="/files/ftp_upload/54402/54402tbl5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表5"> 
表5：扩增的DNA序列。（a）该序列与表4中所述其他河豚物种的序列相同。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402tbl5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此表格的放大版本。</a>

本文描述了一种通过液相色谱/质谱法改进的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法，用于河豚物种的基因分型。该方法采用反相硅胶整体柱分离经酶切后的扩增产物。此技术可解析寡核苷酸的单一同位素质量，有助于碱基组成的鉴定。

一种改进的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法，用于通过……对有毒河豚物种进行基因分型

本实验的总体目标是通过分析小型PCR扩增片段，对有毒河豚进行快速且准确的基因分型。用于制作河豚菜肴的可食用部分因河豚种类而异，且某些种类的河豚全身均含有毒素。该肌肉数据库以及河豚的斑纹、鳍和皮肤特征，有助于从食品安全的全面保障角度及调查研究角度进行河豚的基因分型。使用试剂盒进行DNA提取时，首先将30至50毫克鱼组织放入0.5或1.5毫升的微量离心管中。用微型刮勺压碎不含鱼鳍和鱼皮的组织。加入180微升动物组织裂解缓冲液和40微升蛋白酶K，短暂涡旋振荡。在56摄氏度的金属浴中孵育两小时或过夜。在13000×g下离心样品五分钟。将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管后，加入200微升试剂盒中含盐酸胍的变性缓冲液。然后加入 200 µL 99.5% 乙醇，通过涡旋振荡混匀。将混合物（包括任何沉淀）转移至置于 2 mL 收集管中的离心柱中。在 13000×g 条件下离心 1 分钟后，弃去滤过液。加入500 µL洗脱缓冲液一（含试剂盒中的盐酸胍），并按之前方法进行离心。弃去穿流液和收集管。将离心柱放入试剂盒提供的新的2 mL收集管中。加入500 µL洗脱缓冲液二，然后在20,000×g条件下离心3分钟。弃去流出液和收集管，将离心柱转移至一个新的1.5 mL离心管中。用移液器将200 µL洗脱缓冲液加入离心柱膜的中心。 一分钟后，在6000×g下离心一分钟。然后用移液器将50 µL的上清液转移至一次性紫外比色皿中。使用分光光度计测定上清液在220至300纳米范围内的紫外光谱及260纳米处的吸光度。使用无去污剂的试剂对液相色谱的成功至关重要，因为去污剂确实可能对分析柱造成损害。按照文本方案所述，在洁净台中操作以避免污染，将每个提取的DNA样本、阳性对照和阴性对照分别在冰上设置25微升的PCR反应体系。为便于操作，可配制足量不含模板DNA的预混液（包含所有试剂），并分装使用。使用具有校对活性的DNA聚合酶，以避免在PCR产物的3'端添加腺嘌呤突出端。在热循环仪上按照文本方案中所示的循环程序进行PCR扩增。进行酶切消化时，向PCR溶液中加入2 µL的酶切消化缓冲液。加入每种限制性内切酶各一微升，轻轻混匀。将样品在热循环仪中37摄氏度孵育30分钟，随后在72摄氏度孵育5分钟。使用孔径为0.2至0.5微米的离心过滤装置过滤反应溶液，以防止堵塞并避免分析柱受损。将滤液转移至锥形聚丙烯小瓶中，并在20摄氏度下保存直至分析。按照文本方案所述，在一个1升瓶中配制六氟异丙醇和三乙胺的溶液。将该瓶连接至液相色谱仪的A管线，并使用直冷式便携冰箱对瓶体进行冷却，以防止溶剂挥发。将另一个装有甲醇的瓶子连接到B管路。将保护柱和分析柱连接至仪器。开始流过初始流动相以平衡色谱柱。如果使用的质谱仪没有控制C-Trap压力的软件，则需要通过手动调节压力条来降低C-Trap的压力。为此，请拉出旋钮以解锁，并非常缓慢地逆时针旋转旋钮，将高真空压力降低至原来的1/3。指示的压力应延迟并逐渐变化。忽略关于低压的警告信息。推动旋钮以锁定。按照文本方案中所述完成校准设置后，将加热电喷雾电离探针移至位置B，使其更靠近质谱仪的接口。将探针与带有管路的注射器连接，使用内置的注射泵以每分钟10微升的流速持续注入校准液。仅在自定义校准表中选择六个较低质量的离子。待信号强度稳定后，进行校准。校准完成后，仅选择六个较高质量的离子，并继续进行校准。避免同时使用所有离子进行校准，以防失败。将探针移至位置 D，设置流速为 0.4 毫升每分钟，并使用惰性金属管连接至仪器。按照文本方案中所述设置参数后，通过轻敲样品瓶底部排除气泡。将样品瓶置于样品架上，使用自动进样器进样1微升，开始分析。使用浏览器软件打开原始数据文件，确认所有采集已完成，包括阳性和阴性对照。按照文本方案中所述设置方法，然后点击运行队列选项卡中的运行按钮，启动解卷积软件。在完成提示后，选择一行并点击上方标题中的“打开结果”以获取去卷积分析的结果。此处展示的是来自阴性对照和河豚样本的典型总离子流色谱图。每个峰代表一个DNA双链体，根据其长度进行分离。在此示例中，观察到河豚样本中的三个峰。这些峰是使用两种内切核酸酶对扩增子进行消化的结果。在阴性对照样本中未观察到峰。每个峰代表一个包含多重电荷离子的质谱。放大质谱图后，可观察到数十个同位素分辨的峰。这种分辨率是确定单一同位素质量所必需的，只有通过高分辨质谱仪才能实现。在此示例中，第三个峰的单同位素质量分别为 16296.7656 和 16468.6616 道尔顿。在考虑三 ppm 的质量容差时，测得的数值与此处所示的红鳍东方鲀（takifugu rubripes）理论值相同。一旦掌握，该技术可在一天内使用常规仪器和设备完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用液相色谱-高分辨质谱法分析小扩增子以进行基因分型。该技术可用于分析其他DNA多态性，前提是序列变异体现在待分析的小扩增子中。然而，该技术仅能识别碱基组成，无法区分同一碱基类型内的碱基替换。

improved-polymerase-chain-reaction-restriction-fragment-length

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

河豚有毒改进的聚合酶链反应 - 限制性片段长度多态性分型液相色谱/质谱法

本文介绍如何使用安捷伦鱼类物种鉴定系统，通过提取DNA并进行PCR和RFLP分析来鉴定鱼类的物种。...

基于DNA的鱼类物种鉴定方案

来源：Gulla, S.，等．通过多重PCR和毛细管电泳对鱼类致病性细菌Yersinia ruckeri进行多位点可变数目串联重复序列分析．J. Vis.

利用可变数目串联重复序列（VNTR）分析检测鱼类病原体

本视频介绍了毛细管电泳技术，用于根据大小分析从各种样本中获得的荧光标记PCR扩增子。该技术利用每个片段中标记的荧光染料，生成迁移图谱，从而确定片段的碱基对长度。...

毛细管电泳：一种用于分析荧光标记聚合酶链式反应扩增子的技术

聚合酶链式反应（PCR）结合高分辨率熔解分析（HRMA）被证明是一种快速高效鉴定斑马鱼基因型的方法。...

利用高分辨率熔解分析结合PCR进行斑马鱼快速高效基因分型

本文介绍了一种用于实验室估算多氯联苯（PCB）同系物从猎物向食鱼性鱼类净营养级传递效率的技术。为了最大限度地将实验室结果外推至野外实际情况，应使用该食鱼性鱼类在自然环境中通常摄食的鱼类作为饵料进行喂养。...

实验室估算多氯联苯同系物从猎物向湖鳟（Salvelinus namaycush）的净营养级传递效率

前体同位素标记与等重标记联合技术（cPILOT）是一种定量蛋白质组学策略，可增强等重标签的样本多重检测能力。本方案描述了cPILOT在阿尔茨海默病小鼠模型及野生型对照组织样本中的应用。...

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）增强组织样本的多重检测能力

对大型无脊椎动物肠道内容物的分析大多采用视觉检测方法。这类方法需要研究者具备关于猎物生物形态多样性的深入知识，且无法检测到软体猎物，同时由于猎物被严重破碎，使得某些生物（包括钩虾）的鉴定几乎无法进行。本文提供了针对钩虾食性中大型无脊椎动物猎物鉴定的详细且新颖的遗传学方法。...

利用类群特异性rDNA引物对水生大型无脊椎动物进行肠道内容物遗传分析的实验室方案

斑马鱼已被广泛用作生物医学研究中可靠的遗传学模式生物，尤其是在基因编辑技术出现之后。当预期出现幼体表型时，DNA 提取和基因型鉴定可能具有挑战性。本文介绍了一种高效的斑马鱼幼体基因分型方法，可在受精后 72...

高通量DNA提取与基于鳍剪法的3日龄斑马鱼幼鱼基因分型

本文介绍的多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）检测方法可实现对鱼类致病菌Yersinia...

用于鱼类致病菌 Yersinia ruckeri 的多位点可变数目串联重复序列分析的多重 PCR 与毛细管电泳方法

在微量滴定板中培养放射性标记的细菌，可实现高通量取样，从而对核苷酸池含量（包括(p)ppGpp）进行多次技术重复和生物学重复检测。可监测由生理应激源引发的生长转换及其从应激中恢复过程中的效应。...

使用微量滴定板放射性标记法结合薄层色谱进行体内多重复测定大肠杆菌（Escherichia coli）的(p)ppGpp水平

我们开发了一种改进的QuEChERS-HPLC方法，用于检测斑马鱼胚胎内16种多环芳烃的含量水平。...

一种改良的QuEChERS-HPLC方法用于检测暴露于细颗粒物的斑马鱼胚胎中多环芳烃

学习利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性结合液相色谱/质谱法对有毒河豚进行快速准确的基因分型。该方法通过反相硅胶整体柱有效分离酶切扩增子，实现基于单同位素质量的精确碱基组成鉴定，从而提升食品安全检测水平。

通过液相色谱/质谱法改进河豚毒素鱼类的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性基因分型

探索更多视频