通过液相色谱/质谱法改进河豚毒素鱼类的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性基因分型

本实验的总体目标是通过分析小片段PCR扩增产物，快速准确地对有毒河豚进行基因分型。用于制作河豚菜肴的可食用部分因河豚物种的不同而有所差异，且部分物种全身均含有毒素。对河豚的肌肉、数据库、山椒鱼（masu）、鳍以及皮肤进行分析，有助于从食品安全的角度对河豚进行基因分型，以确保公众安全，并为相关调查提供支持。

使用试剂盒进行DNA提取时，首先将30至50毫克鱼组织置于0.5或1.5毫升的微量离心管中。用微型刮勺压碎不含鳍和皮肤的组织。加入180微升动物组织裂解缓冲液和40微升蛋白酶K，短暂涡旋振荡。

在56摄氏度的金属浴中孵育两小时或过夜。在13000×g条件下离心样品5分钟。将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管后，加入200微升试剂盒中含盐酸胍的变性缓冲液。

然后加入 200 µL 99.5% 乙醇，通过涡旋振荡混匀。将混合物（包括任何沉淀）转移至置于 2 mL 收集管中的离心柱中。在 13000×g 条件下离心 1 分钟后，弃去滤过液。

加入500 µL洗脱缓冲液一（含试剂盒中的盐酸胍），并按之前方法进行离心。弃去穿流液和收集管。将离心柱放入试剂盒提供的新的2 mL收集管中。

加入500 µL洗脱缓冲液二，然后在20,000×g条件下离心3分钟。弃去流出液和收集管，将离心柱转移至一个新的1.5 mL离心管中。用移液器将200 µL洗脱缓冲液加入离心柱膜的中央。

一分钟后，在6000×g条件下离心一分钟。然后用移液器将50微升上清液转移至一次性紫外比色皿中。使用分光光度计测定上清液在220至300纳米范围内的紫外光谱及260纳米处的吸光度。

使用无去污剂的试剂对液相色谱的成功至关重要，因为去污剂确实可能对分析柱造成损害。按照文本方案所述，在洁净工作台中操作以避免污染，将每个提取的DNA样本、阳性对照和阴性对照分别在冰上设置25微升的PCR反应体系。为便于操作，可配制足量不含模板DNA的预混液（包含所有试剂），并分装使用。

使用具有校对活性的DNA聚合酶，以避免在PCR产物的3'端添加腺苷酸突出端。在热循环仪上按照文本方案中所示的循环程序进行PCR扩增。进行酶切消化时，向PCR溶液中加入2 µL的酶切缓冲液。

加入1 µL每种限制性内切酶，并轻轻混匀。将样品在37°C的PCR仪中孵育30分钟，随后在72°C孵育5分钟。使用孔径为0.2至0.5 µm的离心过滤装置过滤反应液，以防止堵塞并避免分析柱受损。

将滤液转移至锥形聚丙烯小瓶中，并在20摄氏度下保存直至分析。按照文本方案所述，在一个1升的瓶子中配制六氟异丙醇和三乙胺的溶液。将该瓶子连接至液相色谱仪的A管线，并使用直冷式便携冰箱对瓶子进行冷却，以防止溶剂挥发。

将另一个装有甲醇的瓶子连接到B管路。将保护柱和分析柱连接至仪器。开始流过初始流动相以平衡色谱柱。如果使用的质谱仪没有控制C-Trap压力的软件，则需要通过手动调节压力条来降低C-Trap的压力。

为此，请拉出旋钮以解锁，并非常缓慢地逆时针旋转旋钮，将高真空压力降至原来的三分之一。所示压力应延迟并逐渐变化。忽略关于低压的警告信息。

推动旋钮以锁定。按照文本方案中所述完成校准设置后，将加热电喷雾电离探针移至位置B，使其更靠近质谱仪的接口。将探针与带有导管的注射器连接，使用内置的注射泵以每分钟10 µL的流速持续注入校准物。

仅在自定义校准表中选择六个较低质量的离子。待信号强度稳定后，进行校准。校准完成后，仅选择六个较高质量的离子，并继续进行校准。

避免同时使用所有离子进行校准，以防失败。将探针移至位置D，设置流速为0.4毫升每分钟，并使用惰性金属管连接至仪器。按照文本方案中所述设置参数后，通过轻敲样品瓶底部排除气泡。

将样品瓶放置在样品架上，使用自动进样器进样1 µL，开始分析。使用浏览器软件打开原始数据文件，确认所有采集均已完成，包括阳性和阴性对照。按照文本方案中所述建立方法，然后点击运行队列选项卡中的“运行”按钮，启动解卷积软件。

完成提示后，选择一行并单击上方标题中的“打开结果”以获取去卷积结果。此处显示的是来自阴性对照和河豚样本的典型总离子流色谱图。每个峰代表一个DNA双链体，根据其长度进行分离。

在此示例中，观察到河豚样本中的三个峰。这些峰是使用两种内切核酸酶对扩增子进行消化的结果。在阴性对照样本中未观察到峰。

每个峰代表一个包含多个带电荷离子的质谱图。放大质谱图后，可观察到数十个同位素分辨清晰的峰。这种分辨率是确定单一同位素质量所必需的，只有通过高分辨率质谱仪才能实现。

在此示例中，第三个峰的单同位素质量分别为 16296.7656 和 16468.6616 道尔顿。在质量容差为三 ppm 的条件下，测得的数值与红鳍东方鲀（takifugu rubripes）的理论值完全一致，如图所示。一旦掌握，该技术可在一天内使用常规仪器和设备完成。

观看本视频后，您应能够充分理解如何通过液相色谱-高分辨质谱法分析小扩增子以进行基因分型。该技术也可用于分析其他DNA多态性，前提是序列变异体现在待分析的小扩增子中。然而，该技术仅能识别碱基组成，无法区分同一碱基类型内的碱基替换。