通过液相色谱/质谱法改进河豚毒素鱼类的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性基因分型

本实验的总体目标是通过分析小型PCR扩增片段，对有毒河豚进行快速且准确的基因分型。用于制作河豚菜肴的可食用部分因河豚种类而异，且某些种类的河豚全身均含有毒素。该肌肉数据库以及河豚的斑纹、鳍和皮肤特征，有助于从食品安全的全面保障角度及调查研究角度进行河豚的基因分型。

使用试剂盒进行DNA提取时，首先将30至50毫克鱼组织放入0.5或1.5毫升的微量离心管中。用微型刮勺压碎不含鱼鳍和鱼皮的组织。加入180微升动物组织裂解缓冲液和40微升蛋白酶K，短暂涡旋振荡。

在56摄氏度的金属浴中孵育两小时或过夜。在13000×g下离心样品五分钟。将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管后，加入200微升试剂盒中含盐酸胍的变性缓冲液。

然后加入 200 µL 99.5% 乙醇，通过涡旋振荡混匀。将混合物（包括任何沉淀）转移至置于 2 mL 收集管中的离心柱中。在 13000×g 条件下离心 1 分钟后，弃去滤过液。

加入500 µL洗脱缓冲液一（含试剂盒中的盐酸胍），并按之前方法进行离心。弃去穿流液和收集管。将离心柱放入试剂盒提供的新的2 mL收集管中。

加入500 µL洗脱缓冲液二，然后在20,000×g条件下离心3分钟。弃去流出液和收集管，将离心柱转移至一个新的1.5 mL离心管中。用移液器将200 µL洗脱缓冲液加入离心柱膜的中心。

一分钟后，在6000×g下离心一分钟。然后用移液器将50 µL的上清液转移至一次性紫外比色皿中。使用分光光度计测定上清液在220至300纳米范围内的紫外光谱及260纳米处的吸光度。

使用无去污剂的试剂对液相色谱的成功至关重要，因为去污剂确实可能对分析柱造成损害。按照文本方案所述，在洁净台中操作以避免污染，将每个提取的DNA样本、阳性对照和阴性对照分别在冰上设置25微升的PCR反应体系。为便于操作，可配制足量不含模板DNA的预混液（包含所有试剂），并分装使用。

使用具有校对活性的DNA聚合酶，以避免在PCR产物的3'端添加腺嘌呤突出端。在热循环仪上按照文本方案中所示的循环程序进行PCR扩增。进行酶切消化时，向PCR溶液中加入2 µL的酶切消化缓冲液。

加入每种限制性内切酶各一微升，轻轻混匀。将样品在热循环仪中37摄氏度孵育30分钟，随后在72摄氏度孵育5分钟。使用孔径为0.2至0.5微米的离心过滤装置过滤反应溶液，以防止堵塞并避免分析柱受损。

将滤液转移至锥形聚丙烯小瓶中，并在20摄氏度下保存直至分析。按照文本方案所述，在一个1升瓶中配制六氟异丙醇和三乙胺的溶液。将该瓶连接至液相色谱仪的A管线，并使用直冷式便携冰箱对瓶体进行冷却，以防止溶剂挥发。

将另一个装有甲醇的瓶子连接到B管路。将保护柱和分析柱连接至仪器。开始流过初始流动相以平衡色谱柱。如果使用的质谱仪没有控制C-Trap压力的软件，则需要通过手动调节压力条来降低C-Trap的压力。

为此，请拉出旋钮以解锁，并非常缓慢地逆时针旋转旋钮，将高真空压力降低至原来的1/3。指示的压力应延迟并逐渐变化。忽略关于低压的警告信息。

推动旋钮以锁定。按照文本方案中所述完成校准设置后，将加热电喷雾电离探针移至位置B，使其更靠近质谱仪的接口。将探针与带有管路的注射器连接，使用内置的注射泵以每分钟10微升的流速持续注入校准液。

仅在自定义校准表中选择六个较低质量的离子。待信号强度稳定后，进行校准。校准完成后，仅选择六个较高质量的离子，并继续进行校准。

避免同时使用所有离子进行校准，以防失败。将探针移至位置 D，设置流速为 0.4 毫升每分钟，并使用惰性金属管连接至仪器。按照文本方案中所述设置参数后，通过轻敲样品瓶底部排除气泡。

将样品瓶置于样品架上，使用自动进样器进样1微升，开始分析。使用浏览器软件打开原始数据文件，确认所有采集已完成，包括阳性和阴性对照。按照文本方案中所述设置方法，然后点击运行队列选项卡中的运行按钮，启动解卷积软件。

在完成提示后，选择一行并点击上方标题中的“打开结果”以获取去卷积分析的结果。此处展示的是来自阴性对照和河豚样本的典型总离子流色谱图。每个峰代表一个DNA双链体，根据其长度进行分离。

在此示例中，观察到河豚样本中的三个峰。这些峰是使用两种内切核酸酶对扩增子进行消化的结果。在阴性对照样本中未观察到峰。

每个峰代表一个包含多重电荷离子的质谱。放大质谱图后，可观察到数十个同位素分辨的峰。这种分辨率是确定单一同位素质量所必需的，只有通过高分辨质谱仪才能实现。

在此示例中，第三个峰的单同位素质量分别为 16296.7656 和 16468.6616 道尔顿。在考虑三 ppm 的质量容差时，测得的数值与此处所示的红鳍东方鲀（takifugu rubripes）理论值相同。一旦掌握，该技术可在一天内使用常规仪器和设备完成。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用液相色谱-高分辨质谱法分析小扩增子以进行基因分型。该技术可用于分析其他DNA多态性，前提是序列变异体现在待分析的小扩增子中。然而，该技术仅能识别碱基组成，无法区分同一碱基类型内的碱基替换。