Name: 定量应用同质MALDI样品的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学习通过调控干燥温度优化MALDI质谱样品制备的方法，利用流体动力学原理减少离子信号空间异质性，提高分析结果的可靠性与重复性。

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本工作由台湾中国台湾地区中央研究院基因体研究中心以及中国台湾地区科技部（合同编号：104-2119-M-001-014）资助。

注意：本方案旨在降低采用干燥液滴法制备的麦芽三糖和缓激肽片段（1-7）的空间异质性。该方案包括三个主要步骤：样品制备与预处理、样品点样与干燥、质谱数据分析。具体操作流程如下所述：
1. 准备与预处理
<ol>
	<li>清洗样品板
	<ol>
		<li>佩戴腈手套，用洗涤剂和去离子蒸馏水（DDW）轻轻清洗样品板。</li>
		<li>用甲醇（MeOH）和去离子蒸馏水（DDW）冲洗样品板。</li>
		<li>将样品板放入600 ml烧杯中，并加入去离子蒸馏水（DDW）至充满。</li>
		<li>在超声波清洗仪（200 W，40 kHz）中用去离子蒸馏水（DDW）超声处理样品板15分钟。</li>
		<li>倒掉烧杯中的去离子蒸馏水（DDW），并加入甲醇（MeOH）至充满。</li>
		<li>在超声波清洗仪（200 W，40 kHz）中用甲醇（MeOH）超声处理样品板15分钟。</li>
		<li>用氮气吹去样品板表面的溶剂液滴，并在点样前保持样品板干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调节干燥室温度 
	注：干燥室为一个35 × 20 × 45 cm3（宽 × 深 × 高）的丙烯酸材质腔室。图1展示了该干燥系统的示意图。通过气体流量计以恒定流速通入室温氮气，对腔室进行吹扫，以维持低相对湿度环境，相对湿度由安装在干燥室内部的校准湿度计监测。干燥室内设有一个铜质底座块，连接程序控温的循环水浴，用于放置不锈钢样品板。该铜质底座块可将样品板温度调节在5至25 °C之间。空气、铜质底座块和样品板的温度均由K型热电偶监测。
	<ol>
		<li>打开门，迅速将样品板放置在铜质底座块上，然后关闭门。</li>
		<li>手动调节气体流量计，将氮气流速设定为10标准立方英尺每小时（SCFH）。</li>
		<li>通过湿度计监测干燥室内的相对湿度，并微调气体流量计，确保相对湿度始终低于25%。</li>
		<li>使用K型热电偶监测样品板温度，并手动调节循环水浴温度，直至样品板达到实验所需的5 °C或对照所需的室温（25 °C）。 
		注：为使样品板温度稳定在设定值，循环水浴的设定温度通常比目标样品板温度低0至5 °C。例如，若需维持样品板温度为5 °C，则循环水浴温度应设置在0至2 °C范围内；若需维持样品板温度为25 °C，则循环水浴温度应设置在23至25 °C范围内。</li>
		<li>在点样前，确保已达到所需的温度和相对湿度条件（见表1）。 
		注：所有不同样品板温度下的干燥过程参数及其设定值均列于表1中。 
		注：当样品板温度较低时，若长时间打开腔室门，可能导致样品板表面出现冷凝水。一旦发生冷凝现象，应立即关闭门，并在冷凝水完全蒸发前切勿在样品板上点样。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基质和分析物溶液的制备
	<ol>
		<li>基质溶液的制备
		<ol>
			<li>用50%乙腈（ACN）: 50%去离子蒸馏水（DDW）水溶液配制0.1 M THAP溶液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>分析物的制备
		<ol>
			<li>用去离子蒸馏水（DDW）配制10-4 M麦芽三糖溶液。</li>
			<li>用50%乙腈（ACN）: 50%去离子蒸馏水（DDW）水溶液配制10-5 M缓激肽片段（1-7）溶液。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 样品沉积与干燥
<ol>
	<li>在微量离心管中预混 0.25 µl 的 0.1 M THAP 溶液与 0.25 µl 的 10-4 M 麦芽三糖溶液或 10-5 M 缓激肽片段（1-7）溶液。</li>
	<li>将混合溶液涡旋振荡 3 秒。</li>
	<li>以 2,000 × g 离心 2 秒，使溶液聚集于离心管底部。</li>
	<li>打开干燥室门，用移液器小心地将 0.1 µl 溶液滴加到样品板上，并立即关闭门。</li>
	<li>等待样品液滴完全干燥。 
	注意：不同样品板温度下的典型干燥时间见表 1。当样品板温度为 5 °C 时，平均干燥时间为 800 至 1,000 秒；当样品板温度为 25 °C 时，平均干燥时间为 100 至 150 秒。</li>
	<li>干燥完成后，打开干燥室门。</li>
	<li>将水循环器温度设为室温（25 °C）。 
	注意：若在干燥过程中样品板始终维持在室温（25 °C），则可跳过此步骤。</li>
	<li>待样品板温度恢复至室温（25 °C）后，将其从干燥室中取出。</li>
	<li>在 5X 体视显微镜下观察样品形貌，并拍摄明场图像。 
	注意：若晶体形貌不符合预期，需按照相同步骤重新制备样品。典型的晶体形貌见图 2上部图示。 
	注意：在样品板温度较低（如 5 °C）的情况下，取出样品板前必须先使其升温至室温。加样时，切勿将预混溶液在移液器吸头中停留超过 10 秒。切勿在加样后再次使用剩余的预混溶液。图 2上部展示了在不同样品板温度下制备样品的明场图像。</li>
</ol>
3. 质谱数据分析
<ol>
	<li>质谱数据采集 
	注意：样品制备完成后，可使用成像质谱技术进行分析。本研究中，成像质谱实验采用实验室自建的同步双极性飞行时间（DP-TOF）成像质谱仪进行15。具有成像功能的商用MALDI-TOF质谱仪也适用于此类实验。质谱仪在线性提取和正离子模式下运行，并优化了提取延迟时间。离子的动能为20 kV。激光束在样品表面的直径为35 µm，每个点的谱图是5次激光脉冲的平均值。
	<ol>
		<li>将样品靶板插入MALDI质谱仪中。</li>
		<li>对步骤2.1–2.9制备的样品进行成像质谱分析。</li>
		<li>从结果窗口显示的质谱列表中选择一个特征质荷比峰，并点击 &#34;2D&#34; 以绘制二维离子图像。 
		注意：对于与THAP混合的麦芽三糖，其特征峰包括钠加合的麦芽三糖、质子化的THAP以及钠加合的THAP。对于与THAP混合的缓激肽片段（1-7），其特征峰包括质子化的缓激肽片段（1-7）、质子化的THAP以及钠加合的THAP。</li>
		<li>点击弹出窗口中的调节按钮，设定信号强度的上下限，然后点击 &#34;保存图片&#34;。此设置用于定义离子图像的对比度。 
		注意：在每组独立的数据中，裂纹区域和亮度较低的无效点将被剔除。</li>
		<li>观察并比较离子图像与步骤2.9中获取的明场图像。 
		注意：成像质谱及特定离子图像的构建可通过商用仪器实现。由于数据采集与分析软件种类多样，用户应遵循仪器供应商提供的软件说明，以获得高质量图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析 
	注意：样品的异质性将被定量分析。在本示例中，每个样品通过自主研发的软件划分为多个同心区域，以分析离子的空间分布情况。该分析也可使用独立的数据分析软件完成。
	<ol>
		<li>在结果窗口显示的离子图像中，点击无效点和裂纹区域，以去除不重要的区域。 
		注意：此步骤用于确定离子图像的有效区域。</li>
		<li>点击 &#34;寻找边缘&#34; 按钮，以识别离子图像的最外层边界。</li>
		<li>点击 &#34;扣除&#34; 按钮，将最外层的离子丰度信息保存至数据库，同时从离子图像中移除该层。代表此最外层的复选框将出现在结果窗口的 &#34;输出数据&#34; 列表中。</li>
		<li>重复步骤3.2.2和3.2.3，直至确定离子图像的中心区域。</li>
		<li>点击并选中 &#34;输出数据&#34; 列表中的所有复选框，然后点击 &#34;导出&#34; 按钮以导出数据。</li>
		<li>使用电子表格软件打开导出的数据，计算每一层的平均离子丰度，从而获得离子的空间分布信息。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Desorption+Ionization+of+Proteins+with+Molecular+Masses+Exceeding+10000+Daltons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons.</a> Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988).</li>
<li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Velocity+Distributions+of+Intact+High+Mass+Polypeptide+Molecule+Ions+Produced+by+Matrix+Assisted+Laser+Desorption%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Velocity Distributions of Intact High Mass Polypeptide Molecule Ions Produced by Matrix Assisted Laser Desorption.</a> Chem. Phys. Lett. 181, 479-484 (1991).</li>
<li>Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic+Acid+as+a+Matrix+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Mass-Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-Assisted Laser Desorption Mass-Spectrometry.</a> Org. Mass Spectrom. 27, 156-158 (1992).</li>
<li>Ehring, H., Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Photoionization+and+Photochemistry+in+Ionization+Processes+of+Organic-Molecules+and+Relevance+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+Mass-Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Role of Photoionization and Photochemistry in Ionization Processes of Organic-Molecules and Relevance for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry.</a> Org. Mass Spectrom. 27, 472-480 (1992).</li>
<li>Strupat, K., Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C5-Dihydroxybenzoic+Acid+-+a+New+Matrix+for+Laser+Desorption+Ionization+Mass-Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom.+Ion+Process%22%5BJournal%5D)">2,5-Dihydroxybenzoic Acid - a New Matrix for Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry.</a> Int. J. Mass Spectrom. Ion Process. 111, 89-102 (1991).</li>
<li>Hu, H., Larson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaporation+of+a+Sessile+Droplet+on+a+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Evaporation of a Sessile Droplet on a Substrate.</a> J. Phys. Chem. B. 106, 1334-1344 (2002).</li>
<li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+Flow+as+the+Cause+of+Ring+Stains+from+Dried+Liquid+Drops%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary Flow as the Cause of Ring Stains from Dried Liquid Drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li>
<li>Hu, J. -B., Chen, Y. -C., Urban, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coffee-Ring+Effects+in+Laser+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Coffee-Ring Effects in Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chim. Acta. 766, 77-82 (2013).</li>
<li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Tissue+Analysis+Using+Matrix-Assisted+Laser+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry%3A+Practical+Aspects+of+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct Tissue Analysis Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry: Practical Aspects of Sample Preparation.</a> J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).</li>
<li>Hu, H., Larson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marangoni+Effect+Reverses+Coffee-Ring+Depositions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Marangoni Effect Reverses Coffee-Ring Depositions.</a> J. Phys. Chem. B. 110, 7090-7094 (2006).</li>
<li>Bhardwaj, R., Fang, X., Attinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+Formation+During+the+Evaporation+of+a+Colloidal+Nanoliter+Drop%3A+A+Numerical+and+Experimental+Study%5BTitle%5D)+AND+%22New+J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Pattern Formation During the Evaporation of a Colloidal Nanoliter Drop: A Numerical and Experimental Study.</a> New J. Phys. 11, 075020(2009).</li>
<li>Savino, R., Paterna, D., Favaloro, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buoyancy+and+Marangoni+Effects+in+an+Evaporating+Drop%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thermophys+Heat+Tr%22%5BJournal%5D)">Buoyancy and Marangoni Effects in an Evaporating Drop.</a> J Thermophys Heat Tr. 16, 562-574 (2002).</li>
<li>Probstein, R. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aProbstein%2C+RF+%22Surface+Tension.+in+Physicochemical+Hydrodynamics+%3A+An+Introduction%22">Surface Tension. in Physicochemical Hydrodynamics : An Introduction</a>. , John Wiley & Sons. Ch. 10 305-361 (1994).</li>
<li>Lai, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Spatial+Heterogeneity+of+MALDI+Samples+with+Marangoni+Flows+During+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27, 1314-1321 (2016).</li>
<li>Hsiao, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Molecular+Imaging+of+Photolabile+Surface+Samples+with+Synchronized+Dual-Polarity+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Molecular Imaging of Photolabile Surface Samples with Synchronized Dual-Polarity Time-of-Flight Mass Spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 834-842 (2011).</li>
<li>Vorm, O., Roepstorff, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Resolution+and+Very+High-Sensitivity+in+MALDI+TOF+of+Matrix+Surfaces+Made+by+Fast+Evaporation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Improved Resolution and Very High-Sensitivity in MALDI TOF of Matrix Surfaces Made by Fast Evaporation.</a> Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994).</li>
<li>Gabriel, S. J., Schwarzinger, C., Schwarzinger, B., Panne, U., Weidner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Segregation+as+the+Major+Cause+for+Sample+Inhomogeneity+in+MALDI+Dried+Droplet+Spots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Matrix Segregation as the Major Cause for Sample Inhomogeneity in MALDI Dried Droplet Spots.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 1356-1363 (2014).</li>
<li>Mampallil, D., Eral, H. B., van den Ende, D., Mugele, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Evaporating+Complex+Fluids+through+Electrowetting%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Control of Evaporating Complex Fluids through Electrowetting.</a> Soft Matter. 8, 10614-10617 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

根据先前的理论预测，液滴内部由温度引起的流体动力学流动可以克服由溶剂蒸发引起的向外毛细流动。当液滴内部的温度梯度增大时，分子内部再循环的效率会得到增强。根据预测结果，当保持样品板温度低于 5 °C 而周围环境维持在室温时，液滴内部再循环流动的平均速度约为向外毛细流动的 4 倍。如果样品板温度与周围环境相同，则再循环流动的平均速度比向外毛细流动慢 1,800 倍。该计算结果表明，在样品制备过程中降低样品板温度是有利的。实验观察结果与这一预测一致。
在整个样品制备过程中，应精确控制样品板的温度。表1展示了在不同样品板温度下，0.1 µl 样品的典型液滴干燥时间。在将样品溶液滴加到样品板之前，必须确保样品板表面干燥。当在低温条件下制备样品时，若出现水汽凝结，则不建议进行样品溶液的点样，因为冷凝水会扩大样品区域并稀释溶液。因此，必须将干燥室内的相对湿度保持在25%以下。此外，在低温条件下制备样品时，应先将样品板在取出干燥室前升温至室温。尽管样品结晶完成后出现少量水汽凝结不会改变样品颗粒的状态，但仍应避免明显的冷凝现象。
<p class="jove...

质谱法（MS）是分析复杂样品分子组成最重要的分析技术之一。在质谱所使用的各种电离方法中，基质辅助激光解吸/电离（MALDI）是生物分析应用中最灵敏且使用最广泛的方法1。与其他电离技术相比，MALDI 具有最高的灵敏度以及对盐类污染物的高度耐受性。这些分析特性使其成为碳水化合物分析和许多蛋白质组学应用的首选方法。然而，样品制备是获得高质量 MALDI-MS 数据的关键步骤。
基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）中最常用的样品制备方法是干燥液滴法，该方法将样品液滴沉积在表面，并在常温条件下自然干燥。这种干燥方法操作简单且通常有效。2-5 然而，干燥液滴法存在一个常见问题，即生成的分析物/基质晶体通常分布不均。在许多情况下，晶体聚集在样品区域的边缘，形成所谓的“环状沉积”现象。6-8 晶体形貌的不均一性会影响分析物分子在空间上的分布，导致样品区域内离子信号出现显著波动。这种强烈的信号波动和较差的数据重复性，在MALDI-MS中被称为“热点”问题。9 因此，迫切需要减少MALDI-MS干燥液滴法应用中的空间异质性。
在采用干燥液滴法制备样品时，样品液滴中的流体动力学流动对样品的空间分布具有重要影响。10-12 研究发现，溶剂蒸发会引发液滴内部向外的毛细流动，从而导致环状沉积的形成。7,10 相反，由切向表面张力梯度诱导的再循环流动可能抵消向外的毛细流动。13 如果再循环流动的速度高于向外的毛细流动速度，则样品可被有效重新分布，从而减轻不均匀性问题。14
本研究展示了一种利用简易干燥室制备样品的详细方案，可在液滴干燥过程中诱导高效的再循环流动。实验精确控制液滴干燥条件，包括样品板及其周围环境的温度，以及干燥室内的相对湿度。模型分析物包括麦芽三糖和缓激肽链（1-7）。演示中使用的基质为2,4,6-三羟基苯乙酮（THAP）。样品采用飞行时间质谱（TOF MS）进行检测，并对数据进行定量分析，以展示异质性的降低。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>洗涤剂粉末</td><td>Alconox</td><td>242985</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Merck</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Merck</td><td>100003</td><td></td></tr><tr><td>2,4,6-三羟基苯乙酮（THAP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T64602&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>缓激肽片段（1-7）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1651</td><td></td></tr><tr><td>麦芽三糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47884</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Mettler Toledo</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 超纯水净化系统</td><td>Millipore</td><td>ZMQS6VFT1</td><td></td></tr><tr><td>无粉腈类手套</td><td>Microflex</td><td>SU-690</td><td></td></tr><tr><td>600 ml 烧杯</td><td>Duran</td><td>2110648</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗器</td><td>Delta</td><td>DC300H</td><td></td></tr><tr><td>湿度计</td><td>Wisewind</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>氮气流量计</td><td>Dwyer</td><td>RMA-6-SSV</td><td></td></tr><tr><td>K型热电偶</td><td>Digitron</td><td>311-1670</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Select BioProducts</td><td>Force Mini&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Rainin</td><td>pipet-lite XLS</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>温控干燥室</td><td>this lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>同步双极性飞行时间成像质谱仪（DP-TOF IMS）</td><td>this lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF 不锈钢样品靶板</td><td>this lab</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于定量分析的均一化maldi样品制备

Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications

本方案展示了一种简单的样品制备方法，可在基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱分析过程中减少离子信号的空间异质性。离子信号的异质性是MALDI技术中的一个严重问题，会导致数据重复性差，并使MALDI不适用于定量分析。通过在样品制备过程中调控样品靶板的温度，可利用样品溶液液滴内部由热效应诱导产生的流体动力学流动，从而缓解异质性问题。该方法采用一个配备有温度可控铜基底块的室温样品制备腔室，该基底块用于承载MALDI样品靶板，从而实现对样品干燥条件的精确控制。在样品液滴完全干燥后，将样品靶板温度恢复至室温，并从腔室中取出，用于后续质谱分析。利用MALDI成像质谱技术检测样品区域，以获得样品中所有组分的空间分布情况。与在无温度控制的环境条件下进行制备的传统干液滴法相比，本方案所制备的样品表现出显著更优的空间分布均匀性和信号强度。根据对碳水化合物和肽类样品的观察结果，在干燥过程中降低基底温度的同时保持周围环境处于室温，可有效减少离子信号的异质性。该方法可广泛适用于多种样品与基质的组合。

使用样品板温度为 5 和 25 °C 制备的麦芽三糖和缓激肽片段（1-7）的明场图像以及质谱图像如图 1所示。对于钠加合的麦芽三糖，当在样品板温度为 25 °C 下制备时，离子信号主要集中于样品区域的边缘。当将样品板温度降低至 5 °C 时，信号在整个样品区域均匀分布。在 5 °C 下制备样品的唯一明显缺点是，与在 25 °C 下制备的样品相比，裂纹更多。质子化的缓激肽片段（1-7）的离子图像表现出与钠加合的麦芽三糖相似的趋势。成像质谱的结果表明，在较低的样品板温度下制备样品可显著重新分布分子并减少异质性。
根据实验结果，统计分析表明，在样品靶温度为 5 °C 时获得的离子信号异质性相较于 25 °C 时降低了 60–80%。图3展示了在样品靶温度分别为 5 °C 和 25 °C 条件下制备的麦芽三糖和缓激肽片段（1-7）的统计分析结果。对于每个样品，其平均强度均进行了归一化处理。以钠...

本文演示了一种通过在样品干燥过程中调控基底温度来降低MALDI质谱中离子信号空间异质性的实验方案。

用于定量分析的均一化MALDI样品制备

本方案展示了一种简单的样品制备方法，用于在基质辅助激光解吸/电离过程中降低离子信号的空间异质性。

该MALDI质谱样品制备方法的总体目标是降低MALDI质谱分析过程中离子信号的空间异质性。通过调控样品液滴在干燥过程中的流体动力学流动，建立了一个受控良好的干燥环境，从而对传统的干滴法进行了优化。该技术的主要优势在于，采用优化后的干滴法所制备样品的离子信号空间异质性可被有效降低。尽管该方法可为THAP质谱系统提供均质的样品。该方法也可应用于其他质谱体系，例如 α-氰基-4-羟基肉桂酸（alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic acid）。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为难以控制干燥条件。开始此操作时，打开干燥室的门，并立即将一块预先清洁好的样品靶板放置在铜基底座上。然后，关闭舱门。手动调节气体流量计，将氮气流速设定为10标准立方英尺每小时。随后，微调气体流量计，确保干燥室内的相对湿度始终低于25%，湿度值由湿度计测定。使用 K 型热电偶监测温度，手动调节水循环器温度，直至样品载样台达到实验所需的 5 摄氏度。在点样前，确保达到所需的温度和相对湿度。在微量离心管中混合 0.25 微升 0.1 摩尔 THAP 溶液与 0.25 微升目标分析物。将样品涡旋振荡三秒钟。然后，离心样品两秒钟，使溶液聚集在微量离心管底部。离心后，打开干燥室的门，用移液器小心地将0.1微升溶液滴加到样品板上。立即关闭门，等待样品液滴完全干燥。当样品板温度低于周围环境时，液滴内环流的平均流速显著增加，从而促进分子的重新分布。样品点样是决定数据质量和可重复性的最关键步骤。预混的样品溶液需要立即点样到样品板上，以确保样品在受控条件下结晶。干燥后，打开干燥室的门。然后，将水循环器温度设置为25摄氏度。待样品板温度恢复至25摄氏度后，从干燥室中取出样品板。在五倍放大体视显微镜下观察样品形貌，并拍摄明场图像。此时，将样品板插入基质辅助激光解吸电离质谱仪（MALDI质谱仪）中，然后进行成像质谱分析。从结果窗口显示的质量列表中选择一个特征性质荷比峰，点击“2D”以生成二维离子图像。接下来，点击弹出窗口中的调节按钮，设定信号强度的上限和下限以提高图像分辨率，然后点击保存图像。观察并比较质谱离子图像与先前获得的明场图像，以确定关键的样品区域。现在，在结果窗口显示的离子图像中，点击空白点位和破裂区域，以精细调整待分析区域。单击“查找边缘”按钮以识别离子图像的最外层。随后，单击“扣除”按钮，将最外层的离子丰度信息保存至数据库，同时从离子图像中移除该层。重复上述步骤，直至定义到离子图像的中心位置。然后勾选输出数据列表中的所有复选框，并单击“导出”以输出数据。最后，使用电子表格软件打开导出的数据，计算每一层的平均离子丰度，以获得离子的空间分布信息。在麦芽三糖的明场和 MALDI 图像中，当样品载板温度为 25 摄氏度时，其钠加合离子信号主要集中于样品区域的边缘。当温度降低至 5 摄氏度时，信号在整个样品区域均匀分布，表明在较低的样品载板温度下制备样品可显著重新分布分子并降低异质性。质子化的缓激肽碎片离子图像显示出与钠化的麦芽三糖相似的趋势。统计分析表明，当样品靶温度为5摄氏度时，所得离子信号的异质性相较于25摄氏度时降低了60%至80%。对于钠化的麦芽三糖而言，在样品靶温度为25摄氏度的情况下，其中心处的信号强度明显低于5摄氏度时的信号强度。缓激肽质子化片段在样品载物台温度从25°C降至5°C时表现出较小的变异。采用此干燥方法时，需严格控制并监测干燥室内的温度和相对湿度。一旦掌握该技术，若操作得当，可在30分钟内完成样品制备。该技术发展之后，为基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI MS）领域的研究人员探索干斑样品的定量分析铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何为MALDI MS分析制备均一的干斑样品。

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