Name: 风土通过概念葡萄果实代谢组学和转录组解释的 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: 了解风土概念如何通过非靶向代谢组学和转录组学分析Corvina葡萄果实的代谢物和转录本。本研究利用PCA和auto BLSDA统计技术，揭示了不同宏观区域对葡萄品质的影响。

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本研究得益于欧盟资助的COST行动FA1106“通过整合系统方法确定番茄和葡萄果实品质发育调控机制”的协调网络活动。本研究由卡里韦罗纳银行基金会资助的“植物功能基因组学中心完善”项目以及由意大利农业和林业政策部资助的“主要意大利本土葡萄品种及其风土（Vigneto）的价值提升”项目支持。SDS由意大利大学与研究部FIRB RBFR13GHC5项目“葡萄树在基因型与环境互作中的表观基因组可塑性”资助。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了用于解读葡萄果实风土概念的代谢组学、转录组学及统计分析方案。采用高效液相色谱-电喷雾电离质谱（HPLC-ESI-MS）进行代谢组学分析，其灵敏度足以同时检测大量代谢物，但相对定量结果会受到基质效应以及离子抑制/增强的影响。然而，已有类似方法被用于描述科维纳（Corvina）葡萄果实的成熟过程及采后萎蔫过程，且对基质效应的校正对最终结果影响有限5。此外，最近一项大规模、多仪器、多实验室联合研究采用相同样品，比较了核磁共振（NMR）与液相色谱-质谱联用（LC-MS）在非靶向代谢组学中的稳健性，结果表明不同仪器和技术所得结果具有一致性6。本文所述案例研究涵盖了三个生长季中，来自三个宏观产区共七个葡萄园的葡萄果实，在三个成熟阶段的样品采集与分析。本研究在宏观产区层面（加尔达湖和索阿韦各包含两个葡萄园，瓦尔波利切拉包含三个葡萄园）采用主成分分析（PCA）和正交双偏最小二乘判别分析（O2PLS-DA）等多元统计方法探究风土特征。不同葡萄园之间的差异更为细微，需采用更复杂且更敏感的统计方法才能有效识别10。所提出方案中的多个步骤至关重要，在回答有关风土对葡萄品质影响的生物学问...

基于植物基因组、转录组、蛋白质组和代谢组的大规模数据分析，为理解复杂系统的行为提供了前所未有的洞察，例如葡萄酒的风土特征，其反映了葡萄植株与其环境之间的相互作用。由于即使在同一葡萄克隆种植于不同葡萄园时，葡萄酒的风土特征仍可能存在差异，因此基因组分析作用有限，因为克隆间的基因组是相同的。相反，有必要研究基因表达与果实代谢特性之间的相关性，这些特性决定了葡萄酒的品质特征。在转录组水平上进行基因表达分析得益于所有转录本相似的化学性质，这使得可以通过利用诸如微阵列上固定探针的杂交等通用特性来实现定量分析。相比之下，由于单个蛋白质和代谢物在物理和化学性质上具有巨大的多样性，蛋白质组学和代谢组学中的通用分析方法更具挑战性。在代谢组学中，这种多样性尤为显著，因为单个代谢物在大小、极性、丰度和挥发性方面差异极大，因此目前尚无单一的提取流程或分析方法能够提供全面的整体性研究方案。
在适用于非挥发性代谢物的分析平台中，基于高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）的方法比其他替代技术（如配备紫外检测器或二极管阵列检测器的高效液相色谱法（HPLC-UV、HPLC-DAD）或核磁共振（NMR）波谱法）具有更高的灵敏度，但HPLC-MS的定量分析可能受到基质效应及离子抑制/增强等现象的影响1-3。在利用电喷雾离子源的高效液相色谱-质谱法（HPLC-ESI-MS）分析科维纳葡萄果实的过程中，研究发现保留时间最短的糖类及其他分子被严重低估，这可能也反映了该保留时间区域中分子数量众多；此外，其他分子的丰度可能被低估、高估或不受基质效应影响，但针对基质效应进行的数据归一化处理似乎对整体结果影响有限4,5。本文所述方法针对葡萄果实成熟过程中大量积累、且受风土条件显著影响的中等极性代谢物分析进行了优化。这些代谢物包括花青素、黄酮醇、黄烷-3-醇、原花青素、其他黄酮类化合物、白藜芦醇、芪类化合物、羟基肉桂酸和羟基苯甲酸，它们共同决定了葡萄酒的颜色、风味及与健康相关的特性。其他代谢物（如糖类和脂肪族有机酸）则被忽略，因其在HPLC-MS定量分析中受基质效应和离子抑制现象影响，结果不可靠5。在本方法选定的极性范围内，该方法属于非靶向分析，旨在尽可能检测多种不同的代谢物6。
得益于完整的葡萄基因组序列的获得，转录组学方法得以同时监测成千上万条葡萄转录本7,8。早期基于高通量cDNA测序的转录组学方法，随着下一代测序技术的出现，已发展为一系列统称为RNA-Seq技术的操作流程。该方法正迅速成为转录组学研究的首选。然而，已有大量基于微阵列（microarray）的文献积累，该技术可通过杂交方式并行定量数千条转录本。事实上，在RNA-Seq成为主流技术之前，已开发出多种专用的商业化微阵列平台，使得葡萄转录组能够被深入细致地分析。在众多平台中，仅有两个支持全基因组范围的转录组分析9。其中最先进的芯片允许在单个装置上同时杂交多达12个独立样本，从而降低了每次实验的成本。这12个子阵列各自包含135,000个60碱基长的探针，代表了29,549条葡萄转录本。该装置已被广泛应用于大量研究中10–24。目前这两个平台均已停产，但最近新设计了一款定制微阵列，代表了更近期的发展，其包含数量更多的探针，可覆盖更多新近发现的葡萄基因25。
转录组学和代谢组学分析产生的大规模数据集需要采用适当的统计方法进行数据分析，包括使用多变量技术来确定不同数据形式之间的相关性。目前最常用的多变量技术是基于投影的方法，这些方法可以是无监督的，例如主成分分析（PCA），也可以是有监督的，例如双向正交偏最小二乘判别分析（O2PLS-DA）26。本文所介绍的实验方案利用PCA进行探索性数据分析，并采用O2PLS-DA来识别样本组之间的差异。

<table><tbody><tr><td>研磨机</td><td>IKA</td><td>IKA A11 basic</td><td></td></tr><tr><td>HPLC自动进样器</td><td>Beckman Coulter</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>System Gold 508 Autosampler</td></tr><tr><td>HPLC系统</td><td>Beckman Coulter</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>System Gold 127 Solvent Module HPLC</td></tr><tr><td>C18保护柱</td><td>Grace</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 &amp;mu;m) Guard Column</td></tr><tr><td>C18色谱柱</td><td>Grace</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 &amp;mu;m) Column</td></tr><tr><td>质谱仪</td><td>Bruker Daltonics</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>Bruker Esquire 6000；质谱仪配备ESI离子源，分析器为离子阱。</td></tr><tr><td>提取溶剂和HPLC缓冲液</td><td>Sigma</td><td>34966</td><td>甲醇 LC-MS级</td></tr><tr><td>Sigma</td><td>94318</td><td>甲酸 LC-MS级</td><td></td></tr><tr><td>Sigma</td><td>34967</td><td>乙腈 LC-MS级</td><td></td></tr><tr><td>Sigma</td><td>39253</td><td>水&amp;nbsp; LC-MS级</td><td></td></tr><tr><td>Minisart RC 4 注射器滤器 (0.2 &amp;mu;m)</td><td>Sartorius</td><td>17764</td><td></td></tr><tr><td>数据采集 (a) 和处理 (b) 软件</td><td>Bruker Daltonics</td><td>-</td><td>Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a)；Esquire 3.2 数据分析和MzMine 2.2软件 (b)</td></tr><tr><td>Spectrum植物总RNA试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>STRN250-1KT</td><td>用于葡萄果皮总RNA提取</td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939A</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano试剂</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>RNA芯片</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent基因表达洗涤缓冲液1</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5325</td><td></td></tr><tr><td>Agilent基因表达洗涤缓冲液2</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5326</td><td></td></tr><tr><td>低输入快速扩增标记试剂盒 单色</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-2305</td><td></td></tr><tr><td>试剂盒RNA Spike In - 单色</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5282</td><td></td></tr><tr><td>基因表达杂交试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5242</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>用于cRNA纯化</td></tr><tr><td>Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer 微阵列芯片</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2514F-048771&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>eArray</td><td>Agilent Technologies</td><td>-</td><td>&lt;a href=&quot;https://earray.chem.agilent.com/earray/">https://earray.chem.agilent.com/earray/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>垫片载玻片</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2534-60012</td><td>用于实现Agilent SurePrint微阵列四重杂交</td></tr><tr><td>恒温水浴锅</td><td>Julabo</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>杂交室</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2534-60001</td><td></td></tr><tr><td>微阵列杂交炉</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2545A</td><td></td></tr><tr><td>杂交炉旋转架</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2530-60029</td><td></td></tr><tr><td>旋转架转换杆</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2530-60030</td><td></td></tr><tr><td>染色试剂盒</td><td>Bio-Optica</td><td>10-2000</td><td>载玻片染色皿和载玻片架</td></tr><tr><td>磁力搅拌装置</td><td>AREX加热磁力搅拌器</td><td>F20540163&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>恒温烘箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus - 6030</td><td></td></tr><tr><td>Agilent微阵列扫描仪</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2565CA</td><td></td></tr><tr><td>扫描仪转盘，48位</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2505-60502</td><td></td></tr><tr><td>载玻片架</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2505-60525</td><td></td></tr><tr><td>特征提取软件 v11.5</td><td>Agilent Technologies</td><td>-</td><td>集成于Agilent微阵列扫描仪G2565CA中</td></tr><tr><td>SIMCA + V13软件</td><td>Umetrics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

风土概念通过葡萄果实代谢组学与转录组学的解析

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

风土（terroir）是指一系列环境因素的综合作用，这些因素会因特定生境和管理方式的不同而影响作物（如葡萄藤（Vitis vinifera））的特征。本文展示了如何通过多元统计分析方法，在科维纳（Corvina）葡萄品种的果实代谢组和转录组中检测到特定的风土特征。该方法首先需要制定合理的采样方案。在本案例中，为尽量减少遗传差异，选用了科维纳品种的一个特定克隆，并在三个不同生长季期间，从代表三个不同大区的七个葡萄园采集样品。推荐采用非靶向液相色谱-质谱（LC-MS）代谢组学方法，因其具有高灵敏度，同时结合使用MZmine软件进行高效的数据处理，以及基于碎片树分析的代谢物鉴定策略。通过包含覆盖约99%所有预测葡萄基因探针的微阵列，可实现全面的转录组分析，从而在不同风土背景下同时分析所有差异表达基因。最后，可采用基于投影法的多元数据分析方法，以克服年份效应的强烈干扰，实现代谢组学与转录组学数据的整合与深入分析，进而识别出具有信息价值的相关性。

本文所述案例研究获得了一个最终的数据矩阵，共包含552个信号（m/z 特征），包括分子离子及其同位素、加合物和部分碎片，在189个样品（7个葡萄园 × 3个成熟阶段 × 3个生长季 × 3个生物学重复）中进行了相对定量。因此，数据点的总数为104,328。通过断裂树分析，共注释了282个m/z特征，对应于代谢物及其加合物、同位素和碎片。对整个数据矩阵进行主成分分析（PCA）的探索性分析显示，样品在第一和第二主成分（t1-t2，图2A）上按成熟阶段（转色期、中期成熟和成熟期）聚类，而在第三主成分（t1-t3，图2B）上按生长季聚类。
<img alt="显示2006-2008年葡萄成熟度数据聚类的主成分分析（PCA）图。" src="/files/ftp_upload/54410/54410fig2.jpg" data-altupdatedat="17...

本文描述了非靶向代谢组学、转录组学及多变量统计分析在葡萄果实转录本和代谢物研究中的应用，旨在深入理解风土（terroir）概念。 即环境对浆果品质性状的影响。

风土（terroir）指影响作物（如葡萄藤（Vitis vinifera））特性的环境因素的综合，这些因素包括……

这些实验程序的总体目标是观察葡萄品种科维纳（Corvina）果实代谢组和转录组中不同风土条件的特征差异。本案例研究涵盖了三个生长季中，在三个大区的七个葡萄园内，于三个成熟阶段采集并分析样品的过程。所采用的技术揭示了年份效应对果实代谢组的主导影响。在成熟的浆果中也鉴定出代表三个宏观区域的特异性化学特征。通过合适的统计方法揭示了宏观区域水平上的风土特征，例如主成分分析（PCA）和自动双向正交投影至潜结构离散分析（auto BLSDA），用于分析转录组学和代谢组学数据矩阵。另一方面，单个葡萄园之间的差异更为细微，需要更复杂且更敏感的统计方法。实验开始前，需制定合适的采样方案。确保采样方案中明确说明采样地点、采样时间以及具体的采样操作步骤。从两行葡萄藤的不同位置采集30个果穗后，从每个果穗中随机选取3颗果实，避免选择有明显损伤或感染迹象的果实。重复此过程，为每个成熟阶段获得三个独立的样本池。去除果实的种子，并立即用液氮速冻果皮。使用自动研磨机将每个样本池中的所有冷冻果实研碎。将每份粉末样品均分为两等份，一份用于转录组学分析，另一份用于代谢组学分析。然后，封闭并取出研钵，将粉末在-80摄氏度下保存。在室温下，用三倍体积的甲醇制备浆果样品的代谢提取物，甲醇中加入0.1%甲酸酸化，在40千赫的超声波水浴中超声处理15分钟。在 4 摄氏度下，以 16,000 × g 离心提取物 10 分钟。将上清液用两倍体积的去离子水稀释，然后通过 0.2 微米滤膜过滤。按照文本方案中的描述，使用电喷雾离子化源或 HPLC-ESI-MS 系统，建立与质谱联用的高效液相色谱分析方法。采用溶剂A和B的线性梯度洗脱，在0.2毫升/分钟的恒定流速下运行高效液相色谱分离，进样体积为30微升。以交替的负离子和正离子电离模式采集质谱数据，参数见文本实验方案。为处理液相色谱-质谱数据，使用合适的软件（例如开源软件M Zeta Mine 2.14版本）进行峰检测对齐、填补空白及峰过滤处理。将生成的文本文件导入电子表格中。这将生成一个数据矩阵，其中所有通过编号、质荷比值和保留时间识别出的代谢物，均以其峰面积值在所有样品中进行定量。根据四包格式规范制备杂交体系，将1.65 µg的氰基荧光素标记的互补RNA溶于41.8 µL去离子无RNA酶水中，最终体积为41.8 µL。加入11微升10X封闭剂和2.2微升25X片段化缓冲液。在60摄氏度恒温浴中孵育30分钟，以片段化RNA。30分钟后，立即置于冰上冷却1分钟。最后，加入55 µL的2倍杂交缓冲液，用移液器充分混匀。在室温下以15,500 ×g离心1分钟后，立即将微量离心管置于冰上。为加载定制微阵列，将垫片玻片标签面向上放入杂交舱的底座中。缓慢将100微升杂交样品加载至每个垫片孔中，使用移液器枪头缓慢加入液体，避免产生气泡。将定制微阵列缓慢倒置放置，确保数字条形码朝上。确保三明治配对结构正确对齐。最后，将杂交室的盖子盖在夹好的载玻片上，并用手拧紧夹子固定杂交室。旋转组装好的杂交室，观察气泡的移动情况。将组装好的载玻片杂交室置于平衡的旋转架中，放入设定为65摄氏度的杂交炉内。将旋转器设置为10 RPM旋转，使杂交反应持续17小时。为进行微阵列芯片洗涤，准备三个切片染色皿，并加入相应的洗涤缓冲液。用室温的洗涤缓冲液一填充两个培养皿，另用预热的洗涤缓冲液二填充一个培养皿。拆卸杂交腔室，取出夹心结构。将微阵列芯片的数字条形码面朝上，把夹心结构浸入盛有室温洗涤缓冲液一的第一个染色培养皿中，借助干净的镊子将垫圈从微阵列芯片上分离。迅速将微阵列芯片转移至载玻片架中，并将其放入盛有室温洗涤缓冲液一的第二个染色缸内。将染色缸置于磁力搅拌器上，中等速度搅拌洗涤一分钟。迅速将载玻片架转移至第三个染色缸中，该缸内盛有预热的洗涤缓冲液二，同样中等速度搅拌洗涤一分钟。缓慢地将染色架从玻片染色皿中取出，并小心地将玻片从架上取下，避免产生液滴。将微阵列玻片放入合适的扫描仪中，根据微阵列制造商使用说明书推荐的参数设置，对每个阵列进行扫描。为准备统计分析软件，首先导入代谢组学和转录组学数据。转到文件，新建常规项目，新建常规项目，以导入获得的数据矩阵。然后点击编辑，转置整个矩阵，返回首页，并分配适当的主 ID 和次级 ID，最后完成。为了进行多变量统计分析，请进入工作集窗口，选择 PCAX 作为模型类型，然后点击 AutoFit。选择得分（Scores），再选择散点图（Scatter），以查看显示样本可能分组的图表。检查主成分分析（PCA）得分图。如果已获得一个良好的模型，则使用相同类别的样本构建O2PLS判别分析模型。要利用按MacroZone分类的样本建立两个O2PLS判别分析模型，请前往Home窗口，选择New As，M1，以及Observations，设置所需的类别。然后，将模型类型从PCAX更改为O2PLS判别分析。点击Autofit。接着在项目窗口中选择M2，点击Scores，然后选择Scatter，以查看样本分类的散点图及其位置。转到“选择数据类型”，并选择“观测值和载荷”。然后单击“添加系列”，选择“PQ相关性一”和“PQ相关性二”，或存在时的其他组分。在图表上按住鼠标右键，进入“属性”，选择“颜色”，然后选择“按类别”，以区分不同分子和类别的图表符号。转到布局、格式化图表、访问和/或样式，以根据所需特征修改图表。要观察哪些代谢物表征一个或多个特定类别，请转到图表列表，然后选择散点图。通过对整个数据矩阵进行主成分分析（PCA）的探索性分析，结果显示样本根据成熟阶段（包括转色期、中期成熟和完全成熟期）在第一和第二主成分上聚类。样本沿第三主成分根据生长季节聚类。对成熟浆果进行O2PLS判别分析，可识别出代表三个大区（Valpolicella、Garda Lake 和 Soave）特定风土特征的标志物。这些模型的载荷图以PQ相关性表示，即P（样本类别）与Q（代谢物）之间的相关性。在载荷图中，红色方块代表样本或宏观区域类别，彩色三角形代表单个代谢物。代谢物根据其化学类别进行颜色编码，代谢物与样本之间的距离反映了它们之间的关联性。加尔达湖宏观区域的特征成分为芪类化合物，而索阿韦和瓦尔波利切拉区域则以黄酮类化合物为特征。在花青素中，牡丹色素（peonidin）及其衍生物在加尔达湖大区更为丰富，而其他花青素则在瓦尔波利塞拉大区更为常见。此外，花青素-3-O-葡萄糖苷在瓦尔波利塞拉大区含量较高，而酰化和香豆酰化衍生物在索阿韦大区更为丰富。转录组学、RA 和 RNA sig 方法可实现对成千上万条葡萄藤转录本的同步监测。一种新型定制微阵列最近被设计出来，其包含的探针数量更多，代表了新近发现的葡萄属额外基因序列。鉴于转录组学平台更新迅速，我们描述了一种使用新平台的替代方案，该平台所含探针数量超过旧平台，其中包括249个新预测的peno转录本、1392个新鉴定的peno位点以及179个corvina prava基因。采用HPLC-ESI-MS进行的代谢组学分析具有足够高的灵敏度，可同时检测大量代谢物。建立采样平面至关重要。选择单一克隆以最大限度减少遗传差异，并进行多次时间点的采样，从而能够识别不同风土条件之间的真正差异。若能比较同一品种在较非最适区域种植的情况将十分有意义，但遗憾的是，这些葡萄园无法获得。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

风土通过概念葡萄果实代谢组学和转录组解释的

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风土概念通过葡萄果实代谢组学与转录组学的解析

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