风土概念通过葡萄果实代谢组学与转录组学的解析

这些实验程序的总体目标是观察葡萄品种科维纳（Corvina）果实代谢组和转录组中不同风土条件的特征差异。本案例研究涵盖了三个生长季中，在三个大区的七个葡萄园内，于三个成熟阶段采集并分析样品的过程。所采用的技术揭示了年份效应对果实代谢组的主导影响。

在成熟的浆果中也鉴定出代表三个宏观区域的特异性化学特征。通过合适的统计方法揭示了宏观区域水平上的风土特征，例如主成分分析（PCA）和自动双向正交投影至潜结构离散分析（auto BLSDA），用于分析转录组学和代谢组学数据矩阵。另一方面，单个葡萄园之间的差异更为细微，需要更复杂且更敏感的统计方法。

实验开始前，需制定合适的采样方案。确保采样方案中明确说明采样地点、采样时间以及具体的采样操作步骤。从两行葡萄藤的不同位置采集30个果穗后，从每个果穗中随机选取3颗果实，避免选择有明显损伤或感染迹象的果实。

重复此过程，为每个成熟阶段获得三个独立的样本池。去除果实的种子，并立即用液氮速冻果皮。使用自动研磨机将每个样本池中的所有冷冻果实研碎。

将每份粉末样品均分为两等份，一份用于转录组学分析，另一份用于代谢组学分析。然后，封闭并取出研钵，将粉末在-80摄氏度下保存。在室温下，用三倍体积的甲醇制备浆果样品的代谢提取物，甲醇中加入0.1%甲酸酸化，在40千赫的超声波水浴中超声处理15分钟。

在 4 摄氏度下，以 16,000 × g 离心提取物 10 分钟。将上清液用两倍体积的去离子水稀释，然后通过 0.2 微米滤膜过滤。按照文本方案中的描述，使用电喷雾离子化源或 HPLC-ESI-MS 系统，建立与质谱联用的高效液相色谱分析方法。

采用溶剂A和B的线性梯度洗脱，在0.2毫升/分钟的恒定流速下运行高效液相色谱分离，进样体积为30微升。以交替的负离子和正离子电离模式采集质谱数据，参数见文本实验方案。为处理液相色谱-质谱数据，使用合适的软件（例如开源软件M Zeta Mine 2.14版本）进行峰检测对齐、填补空白及峰过滤处理。

将生成的文本文件导入电子表格中。这将生成一个数据矩阵，其中所有通过编号、质荷比值和保留时间识别出的代谢物，均以其峰面积值在所有样品中进行定量。根据四包格式规范制备杂交体系，将1.65 µg的氰基荧光素标记的互补RNA溶于41.8 µL去离子无RNA酶水中，最终体积为41.8 µL。

加入11微升10X封闭剂和2.2微升25X片段化缓冲液。在60摄氏度恒温浴中孵育30分钟，以片段化RNA。30分钟后，立即置于冰上冷却1分钟。

最后，加入55 µL的2倍杂交缓冲液，用移液器充分混匀。在室温下以15,500 ×g离心1分钟后，立即将微量离心管置于冰上。为加载定制微阵列，将垫片玻片标签面向上放入杂交舱的底座中。

缓慢将100微升杂交样品加载至每个垫片孔中，使用移液器枪头缓慢加入液体，避免产生气泡。将定制微阵列缓慢倒置放置，确保数字条形码朝上。确保三明治配对结构正确对齐。

最后，将杂交室的盖子盖在夹好的载玻片上，并用手拧紧夹子固定杂交室。旋转组装好的杂交室，观察气泡的移动情况。将组装好的载玻片杂交室置于平衡的旋转架中，放入设定为65摄氏度的杂交炉内。

将旋转器设置为10 RPM旋转，使杂交反应持续17小时。为进行微阵列芯片洗涤，准备三个切片染色皿，并加入相应的洗涤缓冲液。

用室温的洗涤缓冲液一填充两个培养皿，另用预热的洗涤缓冲液二填充一个培养皿。拆卸杂交腔室，取出夹心结构。将微阵列芯片的数字条形码面朝上，把夹心结构浸入盛有室温洗涤缓冲液一的第一个染色培养皿中，借助干净的镊子将垫圈从微阵列芯片上分离。

迅速将微阵列芯片转移至载玻片架中，并将其放入盛有室温洗涤缓冲液一的第二个染色缸内。将染色缸置于磁力搅拌器上，中等速度搅拌洗涤一分钟。迅速将载玻片架转移至第三个染色缸中，该缸内盛有预热的洗涤缓冲液二，同样中等速度搅拌洗涤一分钟。

缓慢地将染色架从玻片染色皿中取出，并小心地将玻片从架上取下，避免产生液滴。将微阵列玻片放入合适的扫描仪中，根据微阵列制造商使用说明书推荐的参数设置，对每个阵列进行扫描。为准备统计分析软件，首先导入代谢组学和转录组学数据。

转到文件，新建常规项目，新建常规项目，以导入获得的数据矩阵。然后点击编辑，转置整个矩阵，返回首页，并分配适当的主 ID 和次级 ID，最后完成。

为了进行多变量统计分析，请进入工作集窗口，选择 PCAX 作为模型类型，然后点击 AutoFit。选择得分（Scores），再选择散点图（Scatter），以查看显示样本可能分组的图表。检查主成分分析（PCA）得分图。

如果已获得一个良好的模型，则使用相同类别的样本构建O2PLS判别分析模型。要利用按MacroZone分类的样本建立两个O2PLS判别分析模型，请前往Home窗口，选择New As，M1，以及Observations，设置所需的类别。

然后，将模型类型从PCAX更改为O2PLS判别分析。点击Autofit。接着在项目窗口中选择M2，点击Scores，然后选择Scatter，以查看样本分类的散点图及其位置。

转到“选择数据类型”，并选择“观测值和载荷”。然后单击“添加系列”，选择“PQ相关性一”和“PQ相关性二”，或存在时的其他组分。在图表上按住鼠标右键，进入“属性”，选择“颜色”，然后选择“按类别”，以区分不同分子和类别的图表符号。

转到布局、格式化图表、访问和/或样式，以根据所需特征修改图表。要观察哪些代谢物表征一个或多个特定类别，请转到图表列表，然后选择散点图。通过对整个数据矩阵进行主成分分析（PCA）的探索性分析，结果显示样本根据成熟阶段（包括转色期、中期成熟和完全成熟期）在第一和第二主成分上聚类。

样本沿第三主成分根据生长季节聚类。对成熟浆果进行O2PLS判别分析，可识别出代表三个大区（Valpolicella、Garda Lake 和 Soave）特定风土特征的标志物。这些模型的载荷图以PQ相关性表示，即P（样本类别）与Q（代谢物）之间的相关性。

在载荷图中，红色方块代表样本或宏观区域类别，彩色三角形代表单个代谢物。代谢物根据其化学类别进行颜色编码，代谢物与样本之间的距离反映了它们之间的关联性。加尔达湖宏观区域的特征成分为芪类化合物，而索阿韦和瓦尔波利切拉区域则以黄酮类化合物为特征。

在花青素中，牡丹色素（peonidin）及其衍生物在加尔达湖大区更为丰富，而其他花青素则在瓦尔波利塞拉大区更为常见。此外，花青素-3-O-葡萄糖苷在瓦尔波利塞拉大区含量较高，而酰化和香豆酰化衍生物在索阿韦大区更为丰富。转录组学、RA 和 RNA sig 方法可实现对成千上万条葡萄藤转录本的同步监测。

一种新型定制微阵列最近被设计出来，其包含的探针数量更多，代表了新近发现的葡萄属额外基因序列。鉴于转录组学平台更新迅速，我们描述了一种使用新平台的替代方案，该平台所含探针数量超过旧平台，其中包括249个新预测的peno转录本、1392个新鉴定的peno位点以及179个corvina prava基因。采用HPLC-ESI-MS进行的代谢组学分析具有足够高的灵敏度，可同时检测大量代谢物。

建立采样平面至关重要。选择单一克隆以最大限度减少遗传差异，并进行多次时间点的采样，从而能够识别不同风土条件之间的真正差异。若能比较同一品种在较非最适区域种植的情况将十分有意义，但遗憾的是，这些葡萄园无法获得。