可控合成和高度统一聚荧光追踪（ñ -isopropylacrylamide）微凝胶

这项工作的总体目标是研究软胶体颗粒在玻璃化转变附近各种颗粒密度的分散体中的动力学行为和相互作用。微凝胶是柔软的物体，可以根据其环境调整其大小、形状和移动性。与刚性胶体颗粒相比，关于软微凝胶的行为存在许多悬而未决的问题。

宽场荧光显微镜的主要优点是可以高精度定位单个微凝胶，直接跟踪它们在 C2 中的运动，并分析扩散量。为了研究致密系统中单个微凝胶的动力学，只需对少量微凝胶进行荧光标记。非搅拌沉淀聚合允许在可变反应条件下平行合成微凝胶，以方便地匹配标记和未标记微凝胶的大小。

动态光散射可在几纳米的精度内提供微凝胶的平均流体动力学半径。将 1.8 克 NIPAM 和 24 毫克 BIS 溶解在 245 毫升过滤的双蒸水中，溶于 500 毫升三口圆底烧瓶中，该烧瓶配有回流冷凝器、搅拌器和橡胶隔膜。插入温度计和 120 毫米针头，以便通过隔膜输入氮气。

一边搅拌一边将溶液加热至 60 摄氏度。然后，用氮气吹扫 40 分钟，使溶液脱氧。同时在 5 毫升过滤的双蒸水中制备 155 毫克过硫酸钾 （KPS） 的引发剂溶液，并用氮气使溶液起泡以去除氧气。

接下来，用氮气清洗注射器，并将完整的 5 毫升 KPS 溶液转移到配备 120 毫米针头的氮气清洗注射器中。将氮针提升到三颈瓶中的溶液水平以上，并通过橡胶隔膜将 KPS 溶液快速加入反应器中。让聚合在氮气流下进行 1 小时，并在 60 摄氏度下缓慢搅拌。

使用 Buchner 漏斗和滤纸过滤热反应溶液，并丢弃任何大聚集体。让分散液冷却后，离心并以 257， 000 倍 G 的速度将分散液 3 次，每次 40 分钟，最后，在冻干分散液进行储存之前，将沉淀物重新分散在最低活量的双蒸水中。在玻璃容器中称取 257.7 毫克 NIPAM、3.5 毫克 BIS 和 1.5 毫克甲基丙烯氧乙基硫代氨基甲酰罗丹明 B 染料，并加入 10 毫升过滤双蒸水。

在单独的玻璃容器中制备不含染料的相同溶液。对染料溶液进行超声处理 15 分钟，使染料溶于水。用染料制备各种稀释的单体溶液，以获得浓度系列。

在这里，使用浓度范围为 02 至 0.1 毫摩尔/升的染料。接下来，将 8.4 毫克 KPS 溶解在 10 毫升过滤的双蒸水中，得到引发剂溶液。将 0.5 mL 浓度系列和 05 mLs KPS 溶液转移到直径为 10 mm 的试管中，以获得最终反应溶液。

用橡胶隔垫密封试管。在连接到加热循环器的双壁玻璃容器中将油浴预热至 63 摄氏度。通过 120 毫米针头用氮气吹扫 20 分钟，使反应溶液脱氧。

然后，将试管插入浮动平台，并将平台浸入预热的油浴中。将温度设置为 60 摄氏度。对于高精度粒度调整，初始反应期间的温度控制必须严格，通常为正负 0.1 摄氏度。

让反应进行适当的时间。通常，一个小时就足够了。反应结束后，将反应管快速转移到 60 摄氏度的烘箱中。

将一滴热分散体放入 10 毫升过滤的双蒸水中，预热至 poly-NIPAM 体积相变温度，以测量塌陷状态下颗粒的流体动力学半径。让其余的分散液冷却至室温，然后转移到离心管中。离心溶液后，用两毫升过滤的双蒸水中稀释微凝胶，用作示踪剂颗粒。

对于通过动态光散射在塌陷状态下的流体动力学半径测定，首先用丙酮蒸汽清洗比色皿和玻璃器皿。将大约 1 mL 稀释的颗粒分散液转移到测量比色皿中。将动态光散射测角仪指数匹配浴槽回火至 50 摄氏度，并在不让其冷却的情况下将样品转移到仪器上。

插入样品比色皿，并将检测器臂移动到小散射角度。按照文本协议中的说明检查光束轮廓和计数范围后，将测角仪臂移动到最高散射角度。检查计数率是否仍然足够高以进行测量。

如果强度太低，请将手臂移动到较低的散射角度。然后，通过甲苯浴玻璃以最低散射角目视检查光束。如果观察到入射光束周围的辉光，则会发生多次散射。

获取最小和最大散射角之间的 20 个相关图，最小采集时间为 60 秒。如有必要，增加弱强度大散射角的采集时间。使用具有所需放大倍率和孔径的适当物镜来激发示踪剂并同时从样品中收集荧光。

在本工作中，使用了 100X、1.3 数值孔径油浸物镜。将水分室放在适合显微镜的 XYZ pi-SO 工作台上。为防止样品干燥，将等离子体清洁的盖玻片放入水分室中，并移液 10 微升所需浓度的聚 NIPAM 分散体。

根据荧光染料的激发和发射光谱，使用合适的激光器进行激发，并适当调整激光功率。这里使用 561 纳米二极管泵浦固态激光器，激光功率恒定为 16 毫瓦。为了获得均匀的样品照明，将激光器耦合到多模光纤中，使用涡旋器摇动光纤以暂时平均激光散斑，然后将光纤末端投射到样品平面中。

校准与盖玻片背向反射的 Z 距离，并通过将物镜稍微向上移动将几微米聚焦到样品中，并使用 Z 补偿器固定 Z 位置。这避免了与盖玻片的任何界面影响。根据荧光信号的强度调整检测器参数，例如曝光时间。

在这种情况下，使用 EMCCD 相机，在电子倍增模式下的曝光时间为 0.1 秒，增益为 50。获取具有适当帧数的多个电影，以获得足够的滞后时间来计算样品不同区域中微凝胶的均方位移。合成了 8 个标记的微凝胶批次。

对于六个批次，相关图衰减率相对于散射矢量大小的平方线性上升，这表明尺寸分布较窄。通过原点的拟合仅表示平移扩散。对于两个批次，观察到非线性行为。

偏差是由较宽的粒度分布和最小颗粒形状因子引起的，这与散射矢量范围一致。为了更好地估计粒子的平均扩散系数，请从拟合中排除这些点。高信噪比可实现荧光微凝胶的示踪。

它们的扩散受到未标记的微凝胶基质的限制。右侧较高浓度的未标记微凝胶基质会导致明显的笼效应，其中荧光微凝胶被困在未标记的微凝胶基质中。在低浓度的未标记 mircogel 基质下，示踪微凝胶表现出正常的扩散，这可以从均方置换随滞后时间的线性增加推断出来。

然而，在接近胶体玻璃转变的高浓度下，它们表现出非线性扩散，由均方位移的非线性时间演变来描述。在较高浓度的未标记微凝胶基质下，示踪微凝胶被未标记的邻居捕获到瞬时笼中，如 12 个微凝胶的聚类轨迹所示。平行小规模合成可实现不同反应参数的快速实验。

这也最大限度地减少了由于反应温差引起的任何不需要的实验变化。结合仔细的动态光散射表征，可以快速找到合适微凝胶尺寸的反应条件。在本视频中，我们演示了受控微凝胶合成如何使我们能够通过宽场荧光显微镜研究浓缩微凝胶溶液中单个微凝胶的扩散。

按照这个程序，将有可能了解微凝胶的结构如何控制它们的特性。这将为设计新的软交互物质打开大门。