Name: 可控合成和高度统一聚荧光追踪（ñ -isopropylacrylamide）微凝胶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 了解聚N-异丙基丙烯酰胺微凝胶的可控合成方法，利用非搅拌沉淀聚合法制备高度统一的荧光标记微凝胶。通过宽场荧光显微镜追踪单颗粒运动，研究其在玻璃化转变附近的扩散动力学行为。

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感谢德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）在特殊研究领域 SFB 985“功能性微凝胶与微凝胶系统”项目中提供的经费支持。

1. 微凝胶合成
注意：N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）使用正己烷重结晶。其他试剂直接使用，未经进一步处理。
<ol>
	<li>聚(NIPAM)基质微凝胶的传统批次合成
	<ol>
		<li>在装有回流冷凝器、搅拌器和橡胶隔垫的500 ml三颈圆底烧瓶中，将1.8 g NIPAM和24 mg N,N'-双丙烯酰胺（BIS）溶于245 ml经滤膜（0.2 µm再生纤维素（RC）膜滤器）过滤的重蒸馏水中。</li>
		<li>通过隔垫插入一支温度计和一根120 mm长的针头用于通入氮气。</li>
		<li>在搅拌下将溶液加热至60 °C，并持续通入氮气40分钟以除去溶液中的氧气。</li>
		<li>同时，将155 mg过硫酸钾（KPS）溶于5 ml过滤后的重蒸馏水中配制引发剂溶液，并向该溶液中通氮气以去除氧气。</li>
		<li>将全部5 ml KPS溶液转移至一支经氮气冲洗过的注射器中，并装上120 mm长的针头。</li>
		<li>将氮气针头提升至液面以上，通过橡胶隔垫迅速将KPS溶液注入反应器中。</li>
		<li>在60 °C、持续通氮气和缓慢搅拌条件下进行聚合反应1小时。</li>
		<li>使用布氏漏斗和滤纸过滤热反应液，以去除大颗粒聚集体，然后让分散液自然冷却。</li>
		<li>将分散液在257,000 × g条件下离心并重新分散三次，每次40分钟，最后将沉淀物重新分散于最小可行体积的重蒸馏水中，通常为2–4 ml。</li>
		<li>将分散液冷冻干燥后保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>无搅拌条件下合成荧光标记的聚(NIPAM)微凝胶
	<ol>
		<li>在玻璃容器中称取257.7 mg NIPAM、3.5 mg BIS和1.5 mg甲基丙烯酰氧乙基硫代氨基甲酰基罗丹明B（染料），加入10 ml过滤后的重蒸馏水。</li>
		<li>对染料–单体溶液进行15分钟超声处理，以使染料充分溶于水中。</li>
		<li>在另一个玻璃容器中配制不含染料的相同溶液。</li>
		<li>使用不含染料的单体溶液对含染料的单体溶液进行系列稀释，获得不同染料浓度的浓度梯度。本研究中染料浓度范围为0.02–0.1 mmol/L。</li>
		<li>将8.4 mg KPS溶于10 ml过滤后的重蒸馏水中，制备引发剂溶液。</li>
		<li>取0.5 ml上述浓度梯度溶液与0.5 ml KPS溶液分别加入直径为10 mm的试管中，得到最终反应液，并用橡胶隔垫密封。</li>
		<li>将连接加热循环器的双层玻璃容器中的油浴预热至63 °C。</li>
		<li>通过120 mm长的针头向各反应液中通入氮气20分钟，以去除氧气。</li>
		<li>将试管插入浮置平台，并将平台浸入预热的油浴中，将温度设定为60 °C。由于室温下的反应液会降低油浴温度，因此初始油浴温度需略高。为实现高精度的颗粒尺寸调控，反应初期的温度控制必须严格，通常控制在±0.1 °C范围内。</li>
		<li>让反应进行适当时间，通常1小时即可完成。</li>
		<li>迅速将反应管转移至60 °C的烘箱中，并取一滴热分散液加入10 ml已预热至高于PNIPAM体积相变温度（VPTT，32–34 °C）的过滤重蒸馏水中1，用于动态光散射（DLS）在收缩状态下的表征。</li>
		<li>让其余分散液冷却至室温，然后转移至离心管中。</li>
		<li>将溶液在257,000 × g条件下离心三次，每次40分钟，最后将微凝胶稀释于2 ml过滤后的重蒸馏水中，作为示踪颗粒使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 光散射表征
<ol>
	<li>通过动态光散射测定塌缩状态下的流体动力学半径
	<ol>
		<li>用丙酮蒸气清洗比色皿和玻璃器皿。</li>
		<li>加热10 ml过滤后的（例如， 200 nm 或更小的RC滤器）通过PNIPAM的VPTT的双蒸水。</li>
		<li>使用预热的针头（0.9 x 40 mm）和注射器（1 ml）将一滴热分散液转移至过滤水中。</li>
		<li>调节DLS测角仪的折射率匹配浴温 50 °C 并将样品转移至仪器中，过程中不得冷却。</li>
		<li>找到足够获得相关图的最大散射角，方法是通过执行测试测量来确定散射强度是否充分。
		<ol>
			<li>插入样品比色皿（直径10 mm的玻璃管，内含1 ml颗粒分散液）。将检测器臂移至小散射角（此处 30°).</li>
			<li>检查光束轮廓是否存在多重散射：主光束周围无辉光，无多重散射现象， 等等。 检查计数范围是否适合在最小散射角下进行测量（约 30 至 600 kHz；软件窗口右上角）。</li>
			<li>将测角仪臂移动至最高散射角（选择 120° 此处）。检查计数率是否仍足够高以进行测量（介于 30 至 600 kHz 之间）。如果强度过低，将臂移动至更低的散射角。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过甲苯浴的玻璃在最小散射角处目视检查光束，若观察到入射光束周围出现辉光，则表明发生了多重散射。此时应降低激光强度或采用更高稀释度的样品。</li>
		<li>在最小与最大散射角之间采集 20 个相关图例如, 30° - 140°最小采集时间为60秒。若在大散射角处信号强度较弱，可根据需要增加采集时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析 37
	<ol>
		<li>根据散射角计算散射矢量的模 <img alt="静态衍射方程，q = 4πn/λ₀ sin(θ/2)，用于散射分析的数学公式。" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 2">，其中 n 是分散体系的折射率， <img alt="λ₀，方程，物理学、光学和光谱分析中的波长参考符号。" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 3">激光在真空中的波长 <img alt="数学中的 Theta 符号，用于表示角度或相位。" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 4"> 散射角。</li>
		<li>如果测量软件提供了强度相关函数 <img alt="g^(2)(q,τ) 相关函数公式，用于动态光散射研究。" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 5">，将其转换为电场关联函数 <img alt="动态光散射；方程 \(g^{(1)}(q,\tau)\)；强度相关函数分析" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 6"> 根据 <img alt="数据处理中使用的平方根公式，见于瞬态吸收光谱方程" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 7">参数 <img alt="平方根β公式，代数方程，用于分析与计算的数学概念" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="式 8"> 是一个与探测器区域内散射光空间相干性程度相关的、不重要的仪器参数。</li>
		<li>对相关图进行累积量分析， 即，对每个电场相关函数的对数拟合二阶多项式 <img alt="静力平衡方程：ln(√βg(1)(q,τ))；数学分析图解。" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq9.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 9"> 通过线性最小二乘法。 <img alt="平方根β公式，代数方程，用于分析与计算的数学概念" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="式 8"> 表现为拟合的截距，其精确值对数据分析而言并不重要。将拟合限制在有意义的滞后时间内 τ 值, 例如，使得关联幅度为最大幅度的10–20%。一阶项的系数为关联函数的平均衰减速率。 <img alt="静力平衡公式 ΣFx=0 在力矢量图中的应用；教育，物理学，矢量分析" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq10.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 10">.</li>
		<li>找到平均扩散系数的最可能值 <img alt="静力平衡；ΣFx=0，ΣFy=0 方程；示意图；平衡分析，力矢量。" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq11.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 11"> 通过线性最小二乘法拟合颗粒的 <img alt="Γ₂=Dq² 方程；静态平衡概念；物理公式分析" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq12.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 12">。如果 <img alt="静力平衡公式 ΣFx=0 在力矢量图中的应用；教育，物理学，矢量分析" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq10.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 10"> 对抗 <img alt="二次方程公式 q²，代数表达式的数学符号。" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq13.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Eq 13"> 在误差范围内，若曲线不呈线性且不经过原点，则表明粒径分布较宽，流体动力学半径难以准确定义。 </li>
		<li>根据斯托克斯-爱因斯坦关系式计算平均流体动力学半径 <img alt="斯托克斯-爱因斯坦方程，RH=kBT/6πηD，扩散系数公式，科学计算。" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq14.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 14">, 其中 <img alt="玻尔兹曼常数符号 \( k_B \)，在热力学和统计力学中具有重要意义。" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq15.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 15"> 是玻尔兹曼系数， <img alt='表示物理学中张力的公式，符号为“T”。' src="/files/ftp_upload/54419/54419eq16.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 16"> 绝对温度和 <img alt="η 符号，希腊字母在方程中的应用，静力平衡计算，教学用途" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq17.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 17"> 分散液的黏度在 <img alt='表示物理学中张力的公式，符号“T”。' src="/files/ftp_upload/54419/54419eq16.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 16">. 传播标准偏差 <img alt="静力平衡；ΣFx=0，ΣFy=0 方程；示意图；平衡分析，力矢量。" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq11.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 11"> 至 <img alt="色谱方程 R_H，方法示意图，蛋白质分离分析，教学资源" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq18.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Eq 18">.   </li>
	</ol>
	</li>
	<li>静态光散射法测定颗粒结构
	<ol>
		<li>用丙酮蒸气清洗比色皿和玻璃器皿。使用直径20 mm或更大的比色皿，以尽量减少圆柱透镜效应。</li>
		<li>使用200 nm RC滤膜或更小孔径的滤膜过滤约20 ml双蒸水至玻璃小瓶中，并将一滴纯化后的分散液转移至该小瓶。在用于样品制备前，先用10 ml水冲洗滤膜，以去除生产过程中残留的杂质。</li>
		<li>检查样品是否受到任何环境光源的影响。若观察到蓝色色调，则样品浓度可能过高，应相应稀释。</li>
		<li>通过用过滤水多次冲洗比色皿来制备背景水样，然后根据比色皿类型及仪器中激光位置加入适量样品体积。激光必须穿过样品，且不被液面弯月面折射。</li>
		<li>使用甲苯样品校准仪器。</li>
		<li>在可用的角度范围内测量水的散射（背景）。</li>
		<li>在可获得的角范围内，优选在多个波长下测量样品的散射强度。将散射强度归一化至前向散射强度所得的散射图样称为形态因子。</li>
		<li>若已知颗粒结构，使用相应的模型表达式对在不同波长下测得的数据集进行全局拟合计算。</li>
		<li>对于未知粒子结构，使用正则化直接法（如 FitIt!） 33）或更通用的间接傅里叶逆变换 21,22 常规结合对径向分布函数的解卷积（仅适用于球形颗粒） 23,24 用于颗粒类型的粗略分类。</li>
		<li>若拟合或反演程序提供了粒子半径分布函数的估计值，则计算多分散指数（分布的标准差除以其平均值）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过宽场荧光显微镜进行颗粒追踪
注意：用于粒子追踪的示踪粒子和基质粒子在 20 °C 下的流体动力学半径分别为 465 ± 7 nm 和 405 ± 7 nm。
<ol>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>通过将已知量的冻干未标记微凝胶重新分散到已知量的双蒸水中，制备浓缩的基质微凝胶分散液。加入少量标记的示踪颗粒。</li>
		<li>在显微镜下确认示踪剂微凝胶的合适浓度。最佳浓度需在尽可能多同时获取粒子轨迹数量与足够低的示踪剂浓度之间取得平衡，以使在采集过程中示踪粒子轨迹交叉的概率可忽略不计。</li>
		<li>通过在烘箱中蒸发水分制备浓缩分散液。通过比较蒸发前后分散液的重量，确定其重量浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据采集与分析
	<ol>
		<li>使用具有所需放大倍数和孔径的物镜，用于激发示踪剂并同时收集样品的荧光信号。本研究中采用100X/1.3 NA油浸物镜。</li>
		<li>将保湿室放置在可适配商用显微镜的xyz压电平台上。</li>
		<li>为防止样品干燥，将经等离子清洗的盖玻片放入保湿室，并用移液器吸取10 µl所需浓度的聚(NIPAM)分散液滴加至盖玻片上。</li>
		<li>根据荧光染料的激发和发射光谱，选择合适的激光器进行激发，并适当调节激光功率。激光强度应足够低以避免染料快速光漂白，同时又需足够强以实现精确的单粒子定位（见下文）。本研究中使用561 nm二极管泵浦固体激光器，并在所有测量中将激光功率保持恒定在16 mW（ca. 0.5 kW cm-2，以样品处为准）。</li>
		<li>为获得均匀的样品照明，采用此处所述的关键照明装置。具体方法是将激光耦合进多模光纤（NA 0.22 ± 0.02，纤芯直径0.6 mm），使用涡旋振荡器摇动光纤以在时间上平均化激光散斑，然后将光纤末端投影至样品平面。</li>
		<li>通过盖玻片背面反射信号校准z方向距离，并将物镜略微上移，使焦点进入样品数微米深处，再使用z补偿器固定z位置。此操作可避免盖玻片界面效应。</li>
		<li>根据荧光信号强度调整探测器参数，如曝光时间。本实验中使用EMCCD相机，曝光时间为0.1秒，电子倍增模式，增益设为50。</li>
		<li>采集多段视频，每段包含适当数量的帧，以获得足够的滞后时间，用于计算样品不同区域微凝胶的均方位移。本研究中每段视频采集500或1,000帧。</li>
		<li>通过高斯拟合方法25对每帧中的粒子进行定位，并采用合适的粒子追踪算法26计算均方位移27。通过对所有视频中所有轨迹进行平均，计算均值和标准差。通过线性回归分析公式 <img alt="静态平衡公式 ⟨r²⟩=4Dτ；扩散系数；物理方程；教育用途" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq19.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Eq 19"> 计算长滞后时间下的扩散系数，其中 <img alt="均方位移公式 〈r²〉，用于粒子扩散分析和物理化学研究" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq20.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Eq 20"> 为均方位移，D 为平均扩散系数，τ 为滞后时间。</li>
		<li>根据反常扩散方程 <img alt="扩散方程 ⟨r²⟩=4Dτα；用于均方位移分析的公式" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq21.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Eq 21">，通过将数据转换为对数坐标得到 <img alt="扩散系数分析方程；对数转换后的均方位移" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq22.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Eq 22">，从而估算异常参数 γ。异常参数 <img alt="静态平衡公式 \(a(τ)\)；展示时间依赖角加速度的示意图" src="/files/ftp_upload/54419/54419eq23.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Eq 23"> 由该曲线的导数给出。导数可通过数据点的有限差分法估算，或通过多项式函数拟合数据点后解析求导获得。通过绘制不同多项式阶次下的拟合残差及残差范数，确定多项式拟合函数的适当阶次。</li>
		<li>对不同浓度的微凝胶基质重复上述相同步骤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

添加少量功能性共聚单体可显著影响由PNIPAM制备的微凝胶的粒径和结构。同时进行小规模试管聚合是评估此类变化的有效方法，有助于快速确定目标粒径所需的反应物配比，以便根据需要放大反应规模。当使用热分解引发剂（如KPS）时，颗粒质量与聚合温度大致呈指数关系 20，因此为保证良好的重复性，必须在反应器内建立稳定且精确的温度控制。如果能够尽量减少与批量合成相关的干扰因素（例如对反应混合物进行过于剧烈的搅拌以消除大型反应器中的温度梯度，或使用过量的引发剂溶液导致引发阶段反应温度发生变化），常规间歇反应与非搅拌反应所得的最终颗粒体积通常具有较好的一致性。
动态光散射是一种成熟且快速的方法，用于测定大量粒子的扩散行为 原位然而，必须在多个散射角度下采集数据。若仅在某一任意角度进行动态光散射（DLS）测量，而该角度恰好与形态因子的极小值重合，或在粒径分布较宽的情况下，所获得的表观扩散系数...

刺激响应性聚(N-异丙基丙烯酰胺) (PNIPAM) 微凝胶1,2在过去二十年中因其在多种智能应用中的潜力而持续受到关注。已展示的应用案例包括可切换的乳液稳定剂3-8、微透镜9、便于细胞收获的细胞培养基底10,11，以及用于小分子化合物和其他生物医学用途的智能载体12。从基础研究的角度来看，这些颗粒已被证明可用于研究胶体相互作用13-15和聚合物-溶剂相互作用16-18等课题。
在任何特定应用中成功使用PNIPAM微凝胶及其衍生物通常需要了解颗粒的平均粒径以及粒径分布的宽度。为了正确解读涉及PNIPAM微凝胶的实验结果，必须知晓可能受功能共聚单体影响的颗粒结构。动态光散射和静态光散射（DLS和SLS）特别适用于获取这些信息，因为这些方法快速且相对易于操作，并且能够在颗粒所处的原始环境（分散体系）中以非侵入方式探测其性质。DLS和SLS还能从大量颗粒中收集数据，避免了显微镜方法因样本量小而产生的偏差。因此，本工作的首要目标是为初次接触胶体表征的研究人员介绍光散射技术的良好实践规范。
通常，沉淀聚合在实验室规模下进行，而为特定颗粒性质寻找合适的反应条件可能十分耗时，且需要多次重复合成过程。与大规模批次合成不同，非搅拌沉淀聚合19,20是一种快速的方法，可同时聚合不同反应物组成的小批量样品，从而获得粒径分布较窄的颗粒。同时进行的聚合反应可最大限度减少实验误差，且高通量的产出意味着能够快速确定适合放大反应的合适反应条件。因此，我们的第二个目标是展示非搅拌沉淀聚合在原型开发以及不需要大量产物的应用中的实用性。
在荧光标记的聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAM）微凝胶应用于胶体相互作用研究的实例中，合成与表征的多个方面得以结合。本文采用高精度的单颗粒追踪技术，研究了标记示踪微凝胶在未标记基质微凝胶分散体系中的扩散行为，涵盖广泛的基质浓度范围，并揭示了浓胶体分散体系中的笼效应。宽场荧光显微镜非常适用于此目的，因为它能够在大量可能不同的基质组分中，表征少数示踪分子的特定行为。这与动态光散射（DLS）、静态光散射（SLS）和流变学等技术形成对比，后者测量的是系统的整体平均性质，因此无法分辨大体系中少量探针颗粒的行为。此外，在本具体实例中，由于粒子浓度较高，导致强烈的多重散射，使任何标准分析失效，因此传统的光散射方法也无法使用。通过采用自动化数据处理和统计方法，即使对于单颗粒追踪技术，当在大样本量上进行平均时，也能实现对整个系统行为的分析。

<table><tbody><tr><td>丙酮</td><td>VWR Chemicals</td><td>KRAF13455</td><td></td></tr><tr><td>双丙烯酰胺</td><td>AppliChem</td><td>A3636</td><td></td></tr><tr><td>正己烷</td><td>Merck</td><td>104374</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-异丙基丙烯酰胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC412785000</td><td>用正己烷重结晶</td></tr><tr><td>甲基丙烯酰氧乙基硫代氨基甲酰罗丹明B</td><td>Polysciences</td><td>23591</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸钾</td><td>Merck</td><td>105091</td><td></td></tr><tr><td>硅油 47 V 350</td><td>VWR Chemicals</td><td>83851</td><td></td></tr><tr><td>甲苯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>F12 制冷/加热循环器</td><td>Julabo</td><td>9116612</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>XY(Z) 压电系统</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-545.3R7</td><td></td></tr><tr><td>100倍油浸物镜</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO</td><td></td></tr><tr><td>四线分光镜</td><td>AHF Analysentechnik</td><td>F68-556T</td><td></td></tr><tr><td>Cobolt Jive 150 激光器</td><td>Cobolt</td><td>0561-04-01-0150-300</td><td></td></tr><tr><td>多模光纤</td><td>Thorlabs</td><td>UM22-600</td><td></td></tr><tr><td>iXON Ultra 897 EMCCD 相机</td><td>Andor</td><td>DU-897U-CS0-BV</td><td></td></tr><tr><td>激光测角仪</td><td>SLS Systemtechnik</td><td>Mark III</td><td></td></tr><tr><td>CF40 冷冻紧凑型循环器</td><td>Julabo</td><td>9400340</td><td></td></tr><tr><td>激光测角仪系统&amp;nbsp;</td><td>ALV GmbH</td><td>ALV / CGS-8F</td><td></td></tr><tr><td>多τ相关器</td><td>ALV GmbH</td><td>ALV-7004</td><td></td></tr><tr><td>光散射电子设备</td><td>ALV GmbH</td><td>ALV / LSE 5004</td><td></td></tr><tr><td>光子计数模块</td><td>PerkinElmer</td><td>SPCM-CD2969</td><td>2个单元以伪互相关模式运行</td></tr><tr><td>633 nm 氦氖激光器</td><td>JDS Uniphase</td><td>1145P</td><td></td></tr><tr><td>F32 制冷/加热循环器</td><td>Julabo</td><td>9312632</td><td></td></tr></tbody></table>

高度均一的聚(n-异丙基丙烯酰胺)微凝胶的可控合成与荧光示踪

Controlled Synthesis and Fluorescence Tracking of Highly Uniform Poly(N-isopropylacrylamide) Microgels

对刺激敏感的聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PNIPAM）微凝胶在基础研究和多种潜在实际应用中具有重要意义。本研究以荧光标记的PNIPAM微凝胶的单颗粒追踪为例，展示如何通过一种快速非搅拌沉淀聚合法调控微凝胶的尺寸。该方法特别适用于新型反应组分与条件的原型开发，或对产物用量要求不高的应用。本实验方案详细描述了微凝胶的合成过程，以及利用动态光散射和静态光散射测定颗粒尺寸与结构的方法。结果表明，引入功能性共聚单体对颗粒成核过程及最终结构具有显著影响。通过宽场荧光显微镜进行单颗粒追踪，可研究荧光标记的示踪微凝胶在未标记高浓度微凝胶基质中的扩散行为，而此类体系难以通过动态光散射等其他方法有效表征。

批次中 PNIPAM 微凝胶颗粒的数量，从而最终颗粒体积，在反应初期的成核阶段即已确定20。疏水性共聚单体染料甲基丙烯酰氧乙基硫代卡巴酰基罗丹明 B 通过降低批次中颗粒数密度来影响成核过程。对于两种不同初始 NIPAM 浓度，随着染料浓度增加，颗粒浓度降低表现为坍塌状态下平均最终颗粒体积增大，如图 1所示。体积的增大可归因于该疏水性共聚单体染料，它在反应早期促进微凝胶核的聚集，从而降低颗粒浓度并增大最终颗粒体积。
成功的动态光散射（DLS）测量结果如图2所示。对于体积最小的六个粒子批次，平均衰减率 Γ2 与 q2 呈线性关系，且在误差范围内 y 轴截距为零，表明这些批次的粒径分布相...

非搅拌沉淀聚合法提供了一种快速、可重复的原型制备方法，可用于合成粒径分布窄且对刺激敏感的聚（N-异丙基丙烯酰胺）微凝胶。本实验方案展示了在此类微凝胶合成过程中，利用宽场显微镜系统进行光散射表征及单颗粒荧光追踪的方法。

高度均一的聚(N-异丙基丙烯酰胺)微凝胶的可控合成与荧光示踪

对刺激敏感的聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PNIPAM）微凝胶在基础研究和多种潜在的实际应用中具有广泛用途。在本研究中……

本研究的总体目标是探究在玻璃化转变附近、不同粒子密度的分散体系中，软胶体粒子的动态行为及其相互作用。微凝胶是一类软物质，能够根据其所处环境调节自身的尺寸、形状和运动性。与刚性胶体粒子相比，软微凝胶的行为仍存在诸多尚未解决的问题。宽场荧光显微镜的主要优势在于能够高精度地定位单个微凝胶，直接追踪其在C2中的运动，并分析扩散量。为了研究致密体系中单个微凝胶的动力学行为，只需对少量微凝胶进行荧光标记。非搅拌沉淀聚合可实现多种反应条件下微凝胶的并行合成，从而方便地匹配标记与未标记微凝胶的尺寸。动态光散射可提供微凝胶的平均流体力学半径，精度在几纳米以内。在500毫升三颈圆底烧瓶中，加入1.8克NIPAM和24毫克BIS，并溶于245毫升过滤的双蒸水中，烧瓶配备回流冷凝器、搅拌器和橡胶隔膜。通过隔膜插入一支温度计和一根120毫米长的针头用于通入氮气。在搅拌的同时将溶液加热至 60 摄氏度。然后用氮气吹扫溶液 40 分钟以除去氧气。同时，将 155 毫克过硫酸钾（KPS）溶于 5 毫升过滤的重蒸水，配制成引发剂溶液，并向该溶液中通入氮气以除去氧气。接下来，用氮气冲洗一支注射器，并将全部5 mL的KPS溶液转移至一支已用氮气冲洗过的、配有120 mm针头的注射器中。将氮气针头提至三颈烧瓶中液面以上，通过橡胶隔膜迅速将KPS溶液注入反应器中。在60 °C条件下，持续通入氮气并缓慢搅拌，使聚合反应进行1小时。使用布氏漏斗和滤纸过滤热反应溶液，并弃去任何较大的聚集体。待分散液冷却后，在257,000 × g 条件下离心并重新分散三次，每次40分钟。最后，在冻干保存前，将沉淀物重新分散于最小可行量的双蒸水中。称取257.7毫克NIPAM、3.5毫克BIS和1.5毫克甲基丙烯酰氧乙基硫代氨基甲酰基罗丹明B染料于玻璃容器中，加入10毫升过滤后的双蒸水。在另一个玻璃容器中制备不含染料的相同溶液。将含染料的溶液超声处理15分钟，以使染料充分溶于水中。用含染料的单体溶液制备不同稀释度的溶液，获得一系列浓度梯度。此处使用浓度范围为 0.02 至 0.1 毫摩尔每升的染料。接下来，将 8.4 毫克过硫酸钾（KPS）溶解于 10 毫升过滤的重蒸馏水中，以制备引发剂溶液。取 0.5 毫升上述浓度系列溶液和 0.5 毫升 KPS 溶液，加入直径为 10 毫米的试管中，得到最终的反应溶液。用橡胶隔垫密封试管。将连接至加热循环器的双层玻璃容器中的油浴预热至63摄氏度。通过120毫米长的针头向反应溶液中通入氮气20分钟，以去除其中的氧气。然后，将试管插入浮式平台中，并将该平台浸入预热的油浴。设置温度为 60 摄氏度。对于高精度的粒径调控，初始反应期间的温度控制必须严格，通常为正负 0.1 摄氏度。让反应进行适当的时间，通常一小时即可。反应结束后，迅速将反应管转移至60摄氏度的烘箱中。取一滴热分散液加入10毫升已预热至聚-NIPAM体积相变温度以上的过滤双蒸水中，以测量颗粒在收缩状态下的流体动力学半径。将剩余分散液冷却至室温，转移至离心管中。离心溶液后，将微凝胶用2毫升过滤双蒸水稀释，作为示踪颗粒使用。为通过动态光散射测定塌缩状态下的流体动力学半径，首先用丙酮蒸气清洗比色皿和玻璃器皿。将约一毫升稀释后的颗粒分散液转移至测量用比色皿中。将动态光散射仪的折光率匹配浴温度调节至50摄氏度，并在不使样品冷却的情况下将其转移至仪器中。插入样品比色皿，并将检测器臂移动至小散射角位置。按照文本方案中所述检查光束轮廓和计数范围后，将测角仪臂移动至最大散射角。检查计数率是否仍足够高以进行测量。如果强度过低，将臂移动到更小的散射角。然后，在最小散射角处通过甲苯浴的玻璃目视检查光束。如果观察到入射光束周围有发光现象，则发生了多重散射。在最小与最大散射角之间采集20个相关函数图，每次采集时间至少为60秒。若必要，对弱强度的大散射角情况应延长采集时间。使用具有所需放大倍数和孔径的合适物镜，用于激发示踪粒子并同时收集样品的荧光信号。本实验中使用100倍、数值孔径为1.3的油浸物镜。将湿室放置在可插入显微镜的XYZ压电平移台上。为防止样品干燥，将经等离子清洗的盖玻片放入湿室中，并用移液器加入10 µL所需浓度的聚-NIPAM分散液。根据荧光染料的激发和发射光谱，选择合适的激光器进行激发，并适当调整激光功率。此处使用波长为 561 纳米的半导体泵浦固体激光器，激光功率恒定为 16 毫瓦。为获得均匀的样品照明，将激光耦合至多模光纤中，利用涡旋振荡器摇动光纤以暂时平均化激光散斑，再将光纤末端投影至样品平面。通过调节物镜略微上移，利用盖玻片背面反射信号校准Z轴距离，并将焦平面移入样品数微米深处，然后使用Z轴补偿器固定Z轴位置。这样可避免盖玻片界面效应。根据荧光信号强度调整探测器参数，例如曝光时间。本实验采用 EMCCD 相机，在电子倍增模式下以 0.1 秒的曝光时间及 50 倍增益进行成像。采集包含适当帧数的多个视频，以获得足够的滞后时间，用于计算样品不同区域中微凝胶的均方位移。共合成了八批带有标记的微凝胶。在六个批次中，相关图衰减速率随散射矢量大小的平方呈线性上升，表明粒径分布较窄。通过原点的拟合表明仅存在平移扩散。在两个批次中观察到非线性行为。偏差由较宽的粒径分布以及与散射矢量范围重合的颗粒形态因子极小值引起。为更准确地估算颗粒的平均扩散系数，应在拟合时排除这些数据点。高信噪比使得荧光微凝胶的追踪成为可能。它们的扩散受到未标记微凝胶基质的限制。右侧未标记微凝胶基质浓度较高，导致明显的笼效应，即荧光微凝胶被束缚在未标记的微凝胶基质中。在未标记微凝胶基质浓度较低时，示踪微凝胶表现出正常的扩散行为，这可通过均方位移随滞后时间呈线性增加推断得出。然而，在接近胶体玻璃化转变的高浓度条件下，它们表现出非线性扩散行为，表现为均方位移随时间呈非线性演化。当未标记微凝胶基质浓度更高时，示踪微凝胶会被周围未标记的邻近微凝胶暂时捕获形成笼状结构，如12个微凝胶的聚集轨迹所示。并行的小规模合成方法可实现对不同反应参数的快速实验。这还能最大限度地减少因反应温度差异导致的非预期实验偏差。结合精确的动态光散射表征，可快速确定获得理想微凝胶尺寸的反应条件。在本视频中，我们展示了如何通过可控的微凝胶合成，利用宽场荧光显微镜研究单个微凝胶在高浓度微凝胶溶液中的扩散行为。通过此实验步骤，将能够理解微凝胶的结构如何调控其性质，从而为设计新型软性相互作用物质开辟道路。

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Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

可控合成和高度统一聚荧光追踪（<em&gt;ñ</em&gt; -isopropylacrylamide）微凝胶

本研究描述了通过光聚合沉淀反应制备聚乙二醇（PEG）微凝胶的方法。增加PEG的分子量可提高微凝胶的直径和溶胀比。本文探讨了对PEG微凝胶沉淀反应的简单改进，以拓展其在未来作为药物递送载体和组织工程支架中的应用。...

反应物分子量调控聚乙二醇沉淀微凝胶的特性

本实验室开发了DNA交联的聚丙烯酰胺水凝胶，这是一种动态水凝胶系统，旨在更深入地理解调控组织刚度对细胞功能的影响。本文提供了制备此类水凝胶的示意图、说明及操作方案。...

DNA交联聚丙烯酰胺凝胶的制备

我们提出一种制备完全由同一种基础材料——聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAAm）构成的Janus微凝胶的方案，其结构具有明显的区室化特征，基于过饱和NIPAAm单体溶液的相分离形成。所合成的Janus微凝胶表现出独特的性质，如各向异性的热响应性以及亲油/亲水性负载能力。...

合成具有各向异性热响应性及亲油/亲水负载能力的聚(N-异丙基丙烯酰胺) Janus 微凝胶

展示了一种高效、三步合成基于RAFT的荧光糖聚合物的方法，包括糖单体的制备、共聚反应和后修饰。该方案可用于制备具有理想结构的基于RAFT的统计型糖聚合物。...

通过RAFT控制聚合简便高效地制备三组分荧光糖聚合物

本文介绍了一种在单分子水平上合成并表征环状聚合物扩散运动的实验方案。...

环状聚合物的合成及其在熔融态下单分子扩散运动的表征

本论文描述了一种通过温度诱导乳化法制备磁性和热敏性微凝胶的方法，该过程无需化学反应。这些敏感性微凝胶是通过混合聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAAm）、聚乙烯亚胺（PEI）和Fe3O4-NH2纳米颗粒制备而成，有望用于磁控和热触发的药物释放。...

磁性和热敏性聚(N-异丙基丙烯酰胺)基微凝胶用于磁控释放

在发育、伤口愈合和癌症转移过程中，集体细胞迁移通常由生长因子或信号分子的浓度梯度所引导。本文介绍了一种将牵引力显微镜与微流控系统相结合的实验体系，并演示了如何在生化梯度条件下定量分析集体迁移的力学机制。...

牵引力显微镜与微流控技术结合用于趋化性集体迁移

纳米凝胶是一种用于递送生物制剂的优良且多功能的纳米颗粒平台。采用一步交联共纳米聚合策略，在水相条件下合成了能够包载基于蛋白质的有效成分的响应性聚乙二醇基聚合物纳米凝胶。本文介绍了这些新型纳米颗粒的最佳制备方法及其表征过程。...

使用一步水相交联共纳米聚合方法合成刺激响应性纳米凝胶

通过微流控技术制备具有互补反应性基团的微凝胶棒，可在水溶液中相互连接。这些各向异性的微凝胶会堆积并相互连接，形成比基于球形系统的结构具有更大孔径的稳定构造。经GRGDS-PC修饰的微凝胶可形成可用于细胞培养的大孔三维结构。...

由微凝胶棒制备的互连大孔三维支架

本方案描述了一组用于合成微孔退火颗粒支架微凝胶构建单元的方法，该支架可用于多种再生医学应用。...

用于微孔退火颗粒支架的微凝胶构筑单元的微流控合成

本文介绍了两种无需外加液相即可将无细胞蛋白合成反应嵌入宏观水凝胶基质中的实验方案。...

将无细胞蛋白质合成反应嵌入宏观水凝胶的方法

了解聚N-异丙基丙烯酰胺微凝胶的可控合成方法，利用非搅拌沉淀聚合法制备高度统一的荧光标记微凝胶。通过宽场荧光显微镜追踪单颗粒运动，研究其在玻璃化转变附近的扩散动力学行为。

高度均一的聚(N-异丙基丙烯酰胺)微凝胶的可控合成与荧光示踪

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