利用肽段的多反应监测质谱法进行混合物中物种鉴定与定量——应用于肉类真实性检测

本方法的总体目标是利用多反应监测质谱技术鉴定并定量生肉混合物中的物种成分，以此作为食品欺诈检测的工具。该方法有助于回答食品真实性领域的关键问题，例如确认香肠或汉堡等产品中所含的物种。我们的方法基于对蛋白质组分的质谱分析。

该技术的主要优势在于能够提供快速且定量的结果。我们最初产生此方法的想法，是由于注意到尽管不同物种中名称相同的蛋白质实际上存在足够差异以实现物种鉴定，但又具有足够的相似性以允许定量分析。通过将样品在95摄氏度的加热块中加热30分钟，使纯化的参考肌红蛋白发生热变性。

将样品冷却约15分钟，直至达到室温。然后加入30毫克尿素以促进消化，并混匀。按酶与底物质量比1:30的比例，向样品中加入胰蛋白酶溶液。

然后轻轻涡旋混匀，并在37摄氏度下孵育过夜以进行蛋白酶解。接下来，通过向样品中加入一到两倍体积的水稀释样品，对蛋白酶解后的样品进行脱盐。通过加入一毫升甲醇活化填充有30毫克反相材料的聚合物反相柱。

然后加入1 mL含1%甲酸的溶液平衡小柱。将样品在重力作用下加载到小柱上。用1 mL含1%甲酸的5%甲醇溶液洗涤小柱。

用1毫升乙腈水溶液将肽段洗脱至预先装有5微升DMSO的2毫升微量离心管中。随后，在50摄氏度下使用离心浓缩仪真空除去溶剂，持续120分钟。然后将残留物重新溶解于250微升乙腈水溶液中。

将溶液转移至低体积自动进样瓶中。在UniProt数据库中查找不同肉类的肌红蛋白序列。将肌红蛋白序列输入肽段和过渡态预测软件的靶标框中。

如有需要，将鼠标悬停在肽段上可显示其碎片列表。按照文本方案中所述输入偏好设置后，点击“导出”并选择“过渡列表”，以生成包含所创建 MRM 转换及参数的电子表格。建立一套配备自动进样器和 C18 核壳型 HPLC 柱的二元梯度高效液相色谱（HPLC）系统，并将其连接至在正电喷雾模式下以 MRM 检测方式运行的三重四极杆质谱仪。

在液相色谱-质谱数据采集软件的编辑参数部分，选择扫描类型为 MRM，极性为正离子模式。输入在电子表格中创建的各离子对所对应的 Q1、Q3、时间、ID、DP 和 CE 值，并保存采集方法。在按照文本方案中所述设置好方法参数后，进入数据采集软件，点击“采集”并选择“平衡”。

在打开的对话框中，选择所需的采集方法以开始仪器平衡。接下来，将样品瓶放入自动进样器的样品架中。单击“文件”，选择“新建”，然后选择“采集序列”。

在样本名称中输入待分析各个样本的身份信息。有关如何可视化获取数据的详细信息，请参见文本方案。使用经过预先冷冻并研磨成粉末的肉类。

通过将相应重量的肉类称量至15毫升塑料离心管中，制备一系列肉样混合物。向肉粉中加入4毫升提取缓冲液。涡旋振荡30秒后，在室温下以每分钟250次的频率在实验室摇床上提取2小时。

将两毫升提取物转移至一个两毫升的微量离心管中，在四摄氏度、17,000 G 条件下离心五分钟。取200微升上清液等分试样转移至两毫升离心管中。使用离心浓缩仪干燥样品，然后按照文本方案中所述方法测定样品的蛋白质浓度。为进行肉类混合物的蛋白质水解，将干燥的残余物重新溶解于一毫升25毫摩尔的碳酸氢铵溶液中。

通过涡旋充分混匀，并按之前方法进行蛋白水解。然后采用设定的多反应监测模式（scheduled MRM）以类似方式设置并运行液相色谱-质谱联用仪（LCMS）。在数据查看软件中显示完整的色谱图。

依次显示每组转换对应的提取离子。通过视觉确认每个峰簇在预期的保留时间处包含相应数量的钟形峰，从而确认所选肽段的存在。

接下来，在导航栏中双击“Quantiation Wizard”。在“Select Samples”窗口中，通过选择单个数据文件来创建定量集，然后选择一个或多个可用的样本。

选择“下一步”以显示选定设置和查询框。保留默认设置，然后选择“下一步”以显示“选择方法”。在下拉的“方法”框中选择整合方法文件，最后选择“完成”。

保存结果表格，将其导出为文本文件，并在电子表格中打开以查看数据，具体操作如文本方案中所述。该图显示了从马与牛肉按重量百分之一比例混合样品中获得的最强MRM跃迁信号。相比之下，红色线条显示了在不存在马成分时牛肉的跃迁信号。

这是测得的马肉在牛肉中的含量与实际添加量的比值关系图。该图清楚地展示了该方法如何用于进行定量检测。一旦掌握并采用批量处理，该方法的检测通量可达每24小时20个样品。

在进行该实验操作时，重要的是要记住选择适合提取分析的蛋白质。肌红蛋白是检测红肉物种的良好候选，因为它含量丰富、水溶性好且具有热稳定性。该方法可进一步扩展，以同时鉴定和定量更多物种。

最大数量仅受限于质谱扫描速度。该技术正在为研究人员将肽指纹图谱应用于消费者保护和品牌保护等领域铺平道路。