种测定和定量混合物中使用肽应用的MRM质谱肉认证

该方法的总体目标是使用多反应监测质谱法来鉴定和定量生肉混合物中存在的物种，以用作食品欺诈检测工具。这种方法可以帮助回答食品完整性领域的关键问题，例如确认香肠或汉堡等产品中存在的物种。我们的方法基于蛋白质成分的质谱法。

这种技术的主要优点是它可以给出快速和定量的结果。当我们注意到已知具有相同名称和不同物种的蛋白质实际上差异足以进行物种鉴定，但又足够相似以进行定量时，我们第一次有了这种方法的想法。通过在 95 摄氏度的热块中加热样品 30 分钟，使纯化的参比肌红蛋白热变性。

将样品冷却约 15 分钟，直至达到室温。然后加入 30 毫克尿素以增强消化并混合。向样品中加入胰蛋白酶溶液，酶与底物的重量比例为 1：30。

然后通过轻轻涡旋混合，并使其在 37 摄氏度下蛋白水解过夜。接下来，先用水将样品稀释 1 至 2 体积，对蛋白水解后样品进行脱盐。通过添加 1 毫升甲醇来激活填充有 30 毫克反相材料的聚合物反相小柱。

然后通过添加 1 毫升 1% 的甲酸来平衡小柱。在重力作用下将样品加载到小柱上。现在用 1 毫升含 1% 甲酸的 5% 甲醇洗涤。

用 1 毫升乙腈水洗脱肽，放入两个预装有 5 μL DMSO 的微量离心管中。接下来，使用离心蒸发器在 50 摄氏度的真空下去除溶剂 120 分钟。然后将残留物重新溶解在 250 μL 乙腈水中。

将溶液转移至小容量自动进样器样品瓶中。在 UniProt 数据库中找到不同会议的肌红蛋白序列。将肌红蛋白序列输入肽和转换预测软件的目标框中。

如果需要，将鼠标悬停在肽上以显示其片段列表。按照文本方案中的说明输入首选项后，单击 Export 并选择 Transition List 以创建一个包含生成的 MRM 离子对和参数的电子表格。使用自动进样器和 C18 核壳 HPLC 色谱柱设置二元梯度的高效液相色谱或 HPLC 系统，该系统连接到在正离子电喷雾模式下运行且具有 MRM 检测功能的三重四极杆质谱仪。

在液相色谱质谱数据采集软件的编辑参数部分中，选择扫描类型作为 MRM，选择极性作为正。输入在电子表格中创建的转换的 Q1、Q3、时间、ID、DP 和 CE 值，然后保存采集方法。按照文本方案中的说明设置方法参数后，导航到数据采集软件，单击 Acquire 并选择 Equilibrate。

在打开的框中，选择所需的采集方法以开始仪器均衡。接下来，将样品瓶放在自动进样器的架子上。单击 File 并选择 New，然后选择 Acquisition Batch。

在 sample name （样品名称） 中，插入要分析的每个样品的标识。有关如何可视化采集数据的详细信息，请参阅文本协议。使用之前冷冻过然后磨成粉末的肉。

将相应量的肉类称量到 15 毫升塑料离心管中，制备一系列肉类混合物。向肉粉中加入 4 毫升提取缓冲液。涡旋 30 秒后，在实验室摇床上以每分钟 250 次循环的速度提取 2 小时。

将 2 毫升提取物转移到 2 毫升微量离心管中，并在 4 摄氏度和 17， 000 克下离心 5 分钟，将 200 微升等分试样的上清液转移到两毫升离心管中。在确定样品的蛋白质浓度之前，使用离心蒸发器干燥样品，如文本方案中所述。为了对肉类混合物进行蛋白水解，将干燥的残留物重新溶解在一毫升 25 毫摩尔碳酸氢铵溶液中。

涡旋充分混合，并像以前一样进行蛋白分析。然后使用计划的 MRM 以类似的方式设置和运行 LCMS。在数据查看软件中显示完整的色谱图。

依次显示每个跃迁集的提取离子。目视确认每个簇在预期保留时间下包含所需数量的钟形峰。从而确认所选肽的存在。

接下来，双击导航栏中的 Quantiation Wizard。在 Select Samples （选择样品） 窗口中，通过选择单个数据文件来创建定量组。然后选择一个或多个可用示例。

选择 下一步 以显示选择设置和查询框。保留默认设置，然后选择 Next 以显示 Select Method （选择方法）。从下拉 方法 框中，选择集成方法文件，最后选择 完成。

保存结果表，导出为文本文件，然后在电子表格中打开它，以按照文本协议中的说明查看数据。该图显示了从 1% 的体重对体重与牛肉混合物中获得的马最强烈的 MRM 通道。相比之下，红线表示在没有马时从牛肉的过渡。

这是牛肉中马的测量量与制备量的图，以比率表示。该图清楚地显示了如何使用该方法进行定量测量。一旦掌握并使用批处理，该方法的通量可达每 24 小时 20 个样品。

在尝试此程序时，请务必记住选择合适的蛋白质进行提取分析。肌红蛋白是检查红肉物种的良好候选者，因为它丰富、水溶性和热稳定性。该程序可以扩展到包括要同时识别和定量的其他物种。

最大数量仅受质谱扫描速度的限制。这项技术为研究人员在消费者和品牌保护等领域使用 pepto 指纹识别铺平了道路。