Name: 种测定和定量混合物中使用肽应用的MRM质谱肉认证 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学习使用多反应监测质谱技术鉴定和定量生肉混合物中的物种来源，该方法可检测牛肉中低至百分之一的马肉含量，为食品安全与防伪提供快速可靠的分析工具。

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我们感谢食品研究所BBSRC核心战略资助基金以及BBSRC项目BB/J004545/1提供的资金支持。

1. 参考肌红蛋白的蛋白水解与分析
<ol>
	<li>参考肌红蛋白的蛋白水解
	<ol>
		<li>制备纯化的参考肌红蛋白溶液（浓度范围为 0.2 - 0.5 mg/ml，溶于 25 mM 碳酸氢铵中）3。</li>
		<li>将每份样品 1 ml 分装至 2 ml 离心管中。</li>
		<li>通过将样品置于 95 °C 的金属浴中加热 30 分钟进行热变性。冷却样品约 15 分钟，直至达到室温。加入 30 mg 尿素（终浓度为 0.5 M）以增强消化效果，然后混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胰蛋白酶蛋白水解
	<ol>
		<li>制备 1 mg/ml 的胰蛋白酶溶液（溶于 25 mM 碳酸氢铵中），按需冰上保存。加入适量胰蛋白酶，使终酶活性为 420 BAEE（N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐）单位/mg 提取蛋白，轻柔涡旋混匀后于 37 °C 过夜进行蛋白水解。</li>
		<li>进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）17，以验证蛋白水解的完全性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白水解后样品的脱盐
	<ol>
		<li>用水按 1:2 体积比稀释样品。</li>
		<li>向含有 30 mg 反相（RP）材料的聚合物反相固相萃取小柱中加入 1 ml 甲醇以活化小柱，随后加入 1 ml 含 1% 甲酸的溶液进行平衡。</li>
		<li>在重力作用下将样品加载至小柱上。</li>
		<li>在重力作用下用 1 ml 含 5% 甲醇和 1% 甲酸的溶液洗涤小柱。</li>
		<li>在重力作用下用 1 ml 乙腈/水（90:10 v:v；含 0.1% 甲酸）洗脱肽段，收集至预先加入 5 µl 二甲基亚砜（DMSO）的 2 ml 微量离心管中。</li>
		<li>使用离心浓缩仪在 50 °C 下真空除去溶剂，持续 120 分钟，然后将残留物重新溶解于 250 µl 乙腈/水（3:97 v:v；含 0.1% 甲酸）中。</li>
		<li>将溶液转移至低体积自动进样瓶中。 
		注：样品可在 4 °C 下保存，直至进行液相色谱-质谱分析（LC/MS）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MRM 过渡列表的生成
	<ol>
		<li>从 UniProt 数据库中查找不同肉类来源的肌红蛋白序列。</li>
		<li>将肌红蛋白序列输入肽段与过渡预测软件（例如，Skyline）的“目标”框中。如有需要，可将鼠标悬停于某肽段以查看其碎片列表。</li>
		<li>点击“设置”并选择“肽段设置”。输入消化条件（即，胰蛋白酶）及漏切位点数量（0）。输入其他参数的设定值，特别是肽段长度（6 - 25）、N 端排除（0）以及假定的氨基酸修饰（无）。</li>
		<li>点击“设置”并选择“过渡设置”。选择用于 LC/MS 分析的仪器类型偏好设置。</li>
		<li>点击“导出”并选择“过渡列表”，以生成包含所建立 MRM 过渡及参数的电子表格。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LC/MS 分析
	<ol>
		<li>建立二元梯度系统（A 相为水，B 相为乙腈，均含 0.1% 甲酸 v:v），配备自动进样器的高效液相色谱仪（HPLC），连接 C18 核壳型 HPLC 色谱柱（10 cm × 2.1 mm，2.6 µm 粒径），并与三重四极杆质谱仪联用，质谱仪工作于正离子电喷雾模式，并采用 MRM 检测方式。</li>
		<li>在数据采集软件（例如，Analyst）中，选择“文件”和“新建”，在弹出框中点击“采集方法”，然后点击“确定”。 
		注：此操作将打开仪器方法编辑器，其中列出已连接的设备，可用于建立新的 LC/MS 方法。</li>
		<li>点击“二元泵”，在表格中输入流速（300 µl/min）和梯度时间，设置二元梯度程序：在 22 分钟内从 3% B 升至 30% B，23 分钟时升至 100% B 并清洗 5 分钟，随后恢复初始条件并再平衡 6 分钟。</li>
		<li>点击“自动进样器”，输入进样体积（5 µl）。启用“针清洗循环”，输入“清洗时间”（30 秒），并选择“冲洗端口”。</li>
		<li>点击“温控柱箱”，在“柱箱属性”中设置“左侧温度”和“右侧温度”（40 °C）。</li>
		<li>点击“质谱仪”，然后点击“编辑参数”以输入源气体条件。将“扫描类型”设为“MRM(MRM)”，“极性”设为“正离子”。进入“周期摘要”，输入“持续时间”，即 LC 分析与平衡的总时间（35 分钟）。</li>
		<li>在表格中右键点击，选择“去簇电压（DP）”和“碰撞能量（CE）”，将这些列添加到表格中。输入所有过渡的 Q1、Q3、时间（msec）、ID、DP 和 CE 值，这些值来自为单一肉类物种建立的过渡列表（见步骤 1.4.5）。 
		注：时间（msec）指驻留时间，即质谱仪扫描每个过渡所花费的时间，所有驻留时间之和不应超过 3 秒。</li>
		<li>保存采集方法文件（文件扩展名为 .dam）。 
		注：步骤 1.5.2 - 1.5.8 需为每种肉类物种重复进行。这将为每种肉类物种在屏幕模式下创建单独的方法文件，以备后续分析使用。</li>
		<li>在数据采集软件中，点击“采集”并选择“平衡”。在打开的窗口中，选择所需的采集方法以启动仪器平衡。</li>
		<li>将样品瓶放入自动进样器的样品架中。</li>
		<li>点击“文件”并选择“新建”，然后选择“采集批次”。在“样品”选项卡中选择“添加集合”，然后选择“添加样品”。输入待分析样品数量，点击“确定”。在“采集”框中，从下拉菜单中选择用于分析的方法文件。</li>
		<li>在表格中选择“板代码”，从下拉菜单中选择合适的托盘配置。左键点击“板代码”列标题，然后右键点击并选择“向下填充”。在“进样瓶位置”中，于各行输入各样品在自动进样器中的位置。</li>
		<li>在“数据文件”中输入采集文件名，然后左键点击列标题，再右键点击并选择“向下填充”。在“样品名称”中输入每个待分析样品的身份信息。保存为采集批次文件（文件扩展名为 .dab）。</li>
		<li>点击“提交”选项卡，然后高亮显示需在 LC/MS 上分析的样品。点击“提交”。点击“采集”和“开始样品”以启动分析。 
		注：每个采集方法将针对单一肉类物种，在整个色谱运行期间扫描所有 MRM 过渡。MRM 采集的质谱仪设置因仪器类型和肽段而异。</li>
		<li>使用数据浏览软件查看生成的数据文件。点击 XIC（提取离子流图），在下拉列表中高亮显示某一前体离子（Q1）的所有碎片（Q3 值）。将打开一个新窗口，仅显示所选过渡。</li>
		<li>记录共洗脱过渡组的保留时间（Rt），因为这些过渡对应于同一条肽段。</li>
		<li>对每组过渡重复上述两个步骤，以将峰归属至各肉类物种相应的肽段。</li>
		<li>记录适用于物种鉴定的标记肽段（例如，马源标记肽段 HPGDFGADAQGAMTK，前体 m/z = 752，Rt = 12.0 分钟），连同其保留时间，并注明哪些肽段可形成适合相对定量的配对。 
		注：例如，马标记肽段（前体 m/z = 752）对应一条牛源肽段 HPSDFGADAQAAMSK（前体 m/z = 767，Rt = 13.2 分钟）。</li>
		<li>为创建一个涵盖所有肉类物种的单一动态方法，在数据浏览软件中依次打开每种肉类物种的 XIC 过渡数据（对应于步骤 1.5.8 中分配给特定肽段的前体）。</li>
		<li>通过左键点击并拖动光标至峰簇下方，放大选定保留时间处的峰簇。通过右键点击峰标签识别最强的过渡。</li>
		<li>手动在电子表格中记录过渡及其保留时间。</li>
		<li>要在 LC/MS 软件中将参数输入为新的动态方法，点击“质谱仪”，然后点击“编辑参数”以输入源气体条件。将“扫描类型”设为“MRM(MRM)”，“极性”设为“正离子”。</li>
		<li>进入“周期摘要”，输入持续时间（设为 LC 分析与平衡的总时间）。在表格中右键点击，选择“去簇电压（DP）”和“碰撞能量（CE）”，将这些列添加到表格中。 
		注：“时间”列现在表示每个过渡的预期保留时间（分钟）。</li>
		<li>在 LC/MS 数据采集软件的“编辑参数”部分，勾选“Scheduled MRM”（定时 MRM）选项。输入电子表格（1.5.21）中创建的过渡的 Q1、Q3、时间（min）、ID、DP 和 CE 值，并保存采集方法（文件扩展名为 .dam）。 
		注：该方法通常将每个肽段的 MRM 过渡数量减少至最强的 4 个，并仅在每个肽段峰的保留时间窗口内进行扫描，从而提高数据的灵敏度和质量。“动态”方法即“引导式保留时间窗口”方法，有时也称为“调度”方法。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 校准样品的制备与分析
<ol>
	<li>肉类混合物的提取
	<ol>
		<li>使用先前冷冻并研磨成粉末的肉类，通过称取相应量的肉类（总质量约为 300 mg）加入到 15 ml 塑料离心管中，制备一系列肉类混合物。</li>
		<li>加入 4 ml 提取缓冲液（0.15 M 氯化钾 + pH 6.5 的 0.15 M 磷酸盐缓冲液）。涡旋振荡 30 秒，在室温下以 250 周/分钟在实验室摇床上提取 2 小时。 
		注：周/分钟指往复振荡运动。</li>
		<li>将 2 ml 提取液转移至 2 ml 微量离心管中，在 4 °C、17,000 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>取上清液 200 µl 等分试样（保留少量用于蛋白质测定，见步骤 2.2）转移至 2 ml 离心管中，使用离心浓缩仪干燥（预设程序：50 °C，无通气，持续 120 分钟）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质测定
	<ol>
		<li>将保留的上清液（见步骤 2.1.4）取 7 µl 等分试样，每份设三个重复，加入 96 孔板的孔中。</li>
		<li>将一系列蛋白质标准品（0 - 1.0 mg/ml 牛血清白蛋白，BSA）各取 7 µl 等分试样，每份设三个重复，加入同一块 96 孔板中。</li>
		<li>向每个孔中加入 200 µl 考马斯亮蓝 Plus 蛋白质测定试剂。</li>
		<li>目视比较样品孔与蛋白质标准品孔的颜色，检查样品是否处于标准曲线范围内。如有必要，对样品进行稀释后重新测定，使其落入检测范围。</li>
		<li>让 96 孔板静置 3 分钟。</li>
		<li>用皮下注射针头刺破形成的气泡。</li>
		<li>使用酶标仪，按照标准终点法在 595 nm 波长下分析 96 孔板。</li>
		<li>利用蛋白质标准品的校准数据确定样品的蛋白质浓度。 
		注：此步骤用于计算胰蛋白酶消化中所用胰蛋白酶的用量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肉类混合物的蛋白酶解
	<ol>
		<li>将步骤 2.1.4 中干燥的残渣重新溶解于 1 ml 25 mM 碳酸氢铵溶液中，在旋转混合器上充分混匀。</li>
		<li>按照步骤 1.1.3 至 1.3.7 的操作流程进行后续处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>液相色谱-质谱（LC/MS）分析
	<ol>
		<li>按照先前设定（步骤 1.5.1）配置 LC/MS 系统。</li>
		<li>按照先前所述方法（步骤 1.5.9 - 1.5.14）创建新的采集批次，选择在步骤 1.5.24 中建立的采集方法，该方法采用动态 LC/MS 方法整合所有肉类物种，并对酶解后的肉类样品进行数据采集。</li>
		<li>在数据查看软件中显示完整的色谱图，依次显示每个跃迁组的提取离子色谱图（XIC）。目视确认每个峰簇在预期保留时间处包含规定数量的钟形峰，从而确认目标肽段的存在。</li>
		<li>在导航栏中双击“构建定量方法”（Build Quantitation Method），使用数据查看软件对目标跃迁的峰面积进行积分，完成定量分析。</li>
		<li>在“选择样品”（Select Sample）面板中，选择“数据文件”（Data File）和待分析的“样品”（Sample），生成“分析物”（Analytes）表格。</li>
		<li>点击“积分”（Integration）标签，显示第一个待积分的跃迁（分析物）。</li>
		<li>点击“分析物”（Analyte）框，显示跃迁的下拉列表。依次选择每个跃迁，查看其色谱图，并目视确认用于积分的峰正确无误。如需修改或强制积分，用鼠标左键拖动光标覆盖目标峰（该峰会以绿色高亮显示），点击“选择峰”（Select Peak）按钮，然后点击“应用”（Apply）。</li>
		<li>将工作区保存为方法文件（.qmf）。 
		注：此操作将生成一个定量方法文件，用于后续计算样品的峰面积。</li>
		<li>在导航栏中双击“定量向导”（Quantitation Wizard）。在“选择样品”（Select Samples）窗口中，通过选择单个“数据文件”（Data File）和一个或多个“可用样品”（Available Samples）创建“定量集”（Quantitation Set）。点击“下一步”进入“选择设置和查询”（Select Settings and Query）界面，保持默认设置，再点击“下一步”进入“选择方法”（Select Method）界面。在下拉菜单“方法”（Method）中选择在步骤 2.4.8 中创建的“积分方法”文件，然后点击“完成”（Finish）。 
		注：此操作将生成一个“结果表”（Results Table），其中包含来自肉类混合物的各跃迁峰面积。</li>
		<li>保存“结果表”（文件扩展名为 .rdb），导出为文本文件（.txt），并在电子表格软件中打开以查看数据。</li>
		<li>针对选定肽段中对应的 MRM 跃迁，绘制一种肉类在另一种肉类中所占百分比（基于跃迁峰面积）与两种肉类实测质量百分比（w/w）之间的关系图，重点关注两个片段从 C 末端起始的氨基酸数目相同的案例。 
		注：具有相同断裂位点的相同片段可获得最佳结果。</li>
		<li>分析步骤 2.4.11 中得到的图表。通过目视判断或使用绘图软件中的趋势线工具，识别出一组线性良好且斜率相近的图表。选择其中一种或多种 CPCP 及其片段组合，用于实际肉类样品的校准。 
		注：若某图表斜率异常，可能表明存在肽段或片段抑制，导致信号强度降低；非线性图表可能提示峰检测不佳或其他问题。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 肉类样品
<ol>
	<li>从目标肉类样品中提取蛋白质
	<ol>
		<li>如适用，使用刮勺去除样品中非肉类的多余物质。例如，从冷藏的千层面中刮除酱汁和意大利面。</li>
		<li>称取20 g肉类放入金属烧杯中。</li>
		<li>加入100 ml pH为6.5的0.15 M氯化钾/0.15 M磷酸一钾缓冲液。</li>
		<li>使用高速匀浆机将肉类匀浆1分钟，以提取蛋白质。</li>
		<li>按照步骤2.1.4至2.3.2的方案进行操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过液相色谱-质谱法（LC/MS）分析样品
	<ol>
		<li>重复步骤2.4.2，使用动态LC/MS方法获取数据。</li>
		<li>如步骤2.4.3所述，鉴定每种肉类肌红蛋白的肽段。</li>
		<li>进行定量时，使用定量软件对每个目标跃迁（transition）的峰面积进行积分，具体操作如步骤2.4.9所述。</li>
		<li>对于混合物中物种的鉴定，记录满足预定标准的标记肽段，包括跃迁数量及跃迁的信噪比。</li>
		<li>进行定量时，采用步骤2.4.12中约定的积分跃迁峰面积，并根据跃迁峰面积百分比，计算混合物中两种物种来源肌红蛋白的百分比。</li>
		<li>结合文献18中关于各类肉类中肌红蛋白含量的已有知识，估算样品中两种肉类的相对重量比（w/w）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

选择合适的靶蛋白至关重要。理想的靶蛋白需在目标物种中具有对应的蛋白形式，具备足够的物种间序列差异性、物种特异性，并且在生物体内含量可及。对于经过加工处理（例如热处理）的混合物，宜选择对该处理方式具有较强抗性的蛋白序列。肌红蛋白是红肉（包括熟制红肉）检测的良好候选靶蛋白，但并非唯一选择。一旦确定靶蛋白，实验方案中最关键的步骤便是蛋白质的蛋白酶解。若靶蛋白不同于肌红蛋白，则可能需要采用不同的蛋白酶解方案。
所述方案包含基于参考纯化蛋白的一个环节，旨在确定保留时间窗口以及合适的前体离子和碎片离子。该环节非常有帮助，但并非必需。
尽管无需实验即可列出两种目标物种对应的肽段对，但有时序列差异会对消化谱产生显著影响。例如，肽段对 VLGFHG（牛）和 ELGFQG（马）会产生异常的定量结果（如图2中斜率小于1所示）。这是因为后一肽段来源于相对受抑制的K-E切割，导致对混合物中马源成分含量的低估。因此，最好避免使用起始氨基酸不同的对应肽段。通常情况下，两个对应肽段产生的片段具有相同的氨基酸序列且行为良好，但并非总是如此，在方法开发过程中需要加以验证。与相对定量相比，物种鉴定对这些问题的敏感性要低得多。
该方案已针对四种红肉进行了验证3。虽然可纳入其他肉类物种，但如果过多的标记肽共洗脱，可能导致过渡峰形质量下降，有效减少驻留时间，最终影响相对定量结果的准确性。已有更先进的仪器可改善这一问题。另一个相关问题是，并非所有肉类的肌红蛋白都不同。例如，马、驴和斑马的肌红蛋白完全相同，因此严格来说，该方法仅能检测牛肉中是否含有马、驴或斑马成分。在某些情况下，即使肌红蛋白不完全相同，某些关键肽段仍可能一致。例如，部分来源于羔羊肉肌红蛋白的标记肽段也会出现在山羊肉中。
该方法及其他任何基于蛋白质的定量方法面临的一个问题是，若要将蛋白质或多肽水平直接等同于混合物中肉类的含量，则必须假设所有物种中的蛋白质含量恒定。然而，对于肌红蛋白和这四种红肉而言，这一假设并非普遍成立。总体而言，肌红蛋白含量具有物种依赖性，其中猪肉的含量在四种肉类中最低。此外，肌红蛋白含量还随肉的部位和动物年龄而变化。因此，尽管质谱过渡峰面积的比值能够可靠地反映肌红蛋白的比值，但将其转换为实际肉类比例时仍需依赖于对混合物中肉类来源的假设，因而仅为估算结果。
本研究提出的方法在多个方面与其他已发表的研究有所不同。一种更为常见的途径是采用蛋白质组学方法鉴定出多种不同的、依赖于物种的标志肽，这种情况下，不同物种的标志肽彼此之间并无特定关联8-12,14,19。相比之下，我们选择的是在所有目标物种中均存在的蛋白质，仅在物种依赖性的序列变异位点上有所不同3。除了在我们的相对定量策略中处于核心地位外，这种方法的优势还在于可对样品制备策略进行优化。此外，这类对应的蛋白质在提取过程或样品的商业加工（如烹饪或罐装）中可能表现出相似的行为。通常情况下，物种鉴定通过检测不同的标志肽来实现，而在CPCP方法中，物种鉴定则是通过检测具有通常一至两个序列差异的密切相关的肽段来完成。最后，为估算一种物种在另一种物种中所占的重量百分比，传统方法通常基于已知标准品对每种蛋白质分别进行绝对定量7,14,15。然而，使用CPCP方法则无需校准步骤，而是通过比较来自两个物种的两个对应肽段的信号强度来估算相对含量，从而完全绕过绝对测量阶段。由于最终目标是获得一种物种在另一种物种中的重量百分比（即相对定量），因此CPCP方法相较于比较两次绝对定量结果更为直接且简便。这些特点使得实验时间显著缩短，预计采用优化后的方案仅需约两小时，从而使该技术在食品欺诈检测领域成为一种高效的快速监测工具。

2013年欧洲马肉冒充牛肉事件中，多家超市销售的牛肉产品被检出含有未申报的马肉1，这一事件凸显了开发能够检测和量化肉类食品欺诈行为的检测方法的必要性。已有多种技术被用于此目的，尤其是酶联免疫吸附测定（ELISA）和基于DNA的方法2。另一种替代方法基于质谱技术，其靶向的是来源于物种特异性蛋白的物种特异性肽段。本文概述了一种基于肽段的检测方法，可实现对肉类混合物中掺假物种的鉴定及其相对定量3。
本方案以红肉为研究背景，旨在检测一种红肉在另一种红肉中以重量计达到1%水平的掺入情况，该水平被一些研究视为食品欺诈性掺假而非偶然污染的界限4。该方法首先依赖于识别在所有目标肉类中名义上“相同”的蛋白质。肌红蛋白是肉类呈现红色的来源蛋白，是一种理想候选物，因其含量丰富、具有相对较高的耐热性且可溶于水，并已被先前研究用于肉类物种鉴定5,6。例如，牛肉（Bos Taurus）、猪肉（Sus scrofa）、马肉（Equus caballus）和羊肉（Ovis aries）3的肌红蛋白在名义上是相同的，符合要求，但它们的氨基酸序列并不完全一致。这类“相似但不同”的蛋白质，如上述四种肌红蛋白，可方便地统称为“对应蛋白质”。这四种肌红蛋白的序列差异具有物种特异性：例如，牛肉和马肉的完整肌红蛋白（分别为P02192和P68082）均由154个氨基酸组成，两者之间存在18处序列差异。经胰蛋白酶（trypsin）消化后，这些蛋白质产生两组肽段，其中部分肽段完全相同，另一些则显示一个或多个物种特异性的氨基酸差异：因此，对应蛋白质会产生对应的肽段。
因此，CPCP 方法首先旨在鉴定来自两个或更多物种的蛋白质，这些蛋白质具有有限的物种特异性序列变异，即为对应蛋白质。在蛋白质水解之后，这些对应蛋白质会产生肽段，其中部分肽段同样表现出从亲本蛋白质遗传而来的物种特异性序列变异，即为对应肽段。通过检测对应肽段的水平，CPCP 方法可用于比较混合物种样品中两种对应蛋白质的表达水平。
检测已知肽段的常用技术是多反应监测质谱法（MRM-MS7）。物种特异性肽段可产生前体离子，这些前体离子及其质谱碎片离子可通过软件工具预先明确列出。这些列表随后用于指导质谱仪仅记录特定的前体离子与碎片离子对，即“跃迁”。因此，特定目标肽段不仅可通过其在质谱分析前的色谱保留时间进行鉴定，还可通过共享同一前体离子的一组跃迁加以确认。这种检测已知肽段的方法具有高度选择性，且能高效利用质谱仪资源。
其他研究人员已采用质谱法通过肽类标志物检测肉类掺假，但这些标志物来源于不同的蛋白质8-14。然而，采用对应蛋白质与对应肽段（CPCP）策略，可优化实验条件，有助于根据已知的物种特异性跃迁反应鉴定混合物中的物种。此外，对应蛋白质及其肽段在提取、蛋白酶解和检测过程中通常具有相似的行为。由于跃迁峰面积具有定量性和可重复性，来自不同物种的对应肽段对所产生的峰面积比值可直接估算混合物中两种肉类的相对含量。相比之下，更传统的定量方法依赖于参考物质的校准曲线来实现绝对定量14,15。
尽管本方案是在肌红蛋白和肉类的背景下阐述的，但除肌红蛋白外的其他蛋白质也可通过CPCP策略用于肉类混合物中的鉴定和相对定量，尽管可能需要对方案进行适当修改。此外，该策略同样适用于含有一个或多个同源蛋白质的其他物种的二元混合物。
本实验方案的起始材料是纯化的“参考”肌红蛋白，某些物种的肌红蛋白可直接购买获得，而其他物种则需通过常规的凝胶过滤色谱法进行制备。参考肌红蛋白的制备步骤未包含在本方案中，但已有其他文献进行描述3。使用软件工具16列出目标肌红蛋白可能产生的候选肽段及相应的质谱跃迁（transition）。每种参考肌红蛋白均需进行蛋白酶解，并将所得肽段通过液相色谱-电喷雾电离串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）分析，以确定哪些候选前体离子及其跃迁最具实用性，并测定相应肽段的保留时间。该阶段的结果是一份更新后的目标肽段及其跃迁列表，适用于物种鉴定；同时获得一份CPCP配对列表，适用于相对定量分析。为检测实际肉类样品，需先制备样品提取物，再进行蛋白酶解，以产生来自肌红蛋白及其他外源蛋白的肽段。随后，基于已列出的跃迁信息，通过LC-ESI-MS/MS对肌红蛋白来源的肽段进行监测。混合样品中存在的物种通过标记肽段对应的跃迁峰进行鉴定。二元混合物中两种肉类相对含量的估计值，可通过相应跃迁峰面积的比值计算得出。一组已知比例的肉类混合测试样品可用于检验并校准特定跃迁对的峰面积比值与实际混合比例之间的关系。

<table><tbody><tr><td>Uniprot 数据库</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.uniprot.org/">www.uniprot.org&lt;/a&gt;</td><td></td><td>免费开放的蛋白质序列数据库</td></tr><tr><td>Skyline 软件</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.skyline.gs.washington.edu/">www.skyline.gs.washington.edu&lt;/a&gt;</td><td></td><td>可免费下载的软件，用于建立蛋白质组学研究的靶向分析方法，以及肽段和碎片预测&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma-Aldrich Co Ltd, 吉林厄姆, 英国 www.sigmaaldrich.com</td><td>O9830</td><td></td></tr><tr><td>甲醇，HPLC 级</td><td>Fisher Scientific, 洛夫伯勒, 英国 www.fisher.co.uk</td><td>10674922</td><td></td></tr><tr><td>乙腈，HPLC 级</td><td>Fisher Scientific, 洛夫伯勒, 英国 www.fisher.co.uk</td><td>10010010</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich Co Ltd, 吉林厄姆, 英国 www.sigmaaldrich.com</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶（经 TPCK 处理的牛胰腺来源）</td><td>Sigma-Aldrich Co Ltd, 吉林厄姆, 英国 www.sigmaaldrich.com</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>甲酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co Ltd, 吉林厄姆, 英国 www.sigmaaldrich.com</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Plus 蛋白质检测试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com</td><td>1856210</td><td></td></tr><tr><td>蛋白质标准品</td><td>Sigma-Aldrich Co Ltd, 吉林厄姆, 英国 www.sigmaaldrich.com</td><td>P0914</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Turrax 匀浆器 T25</td><td>Fisher Scientific, 洛夫伯勒, 英国 www.fisher.co.uk</td><td>13190693</td><td></td></tr><tr><td>Edmund 和 Buhler KS10 实验室摇床</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Fresco 17 离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com</td><td>75002420</td><td></td></tr><tr><td>真空离心机 RC 1022</td><td>Jouan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strata-X 33μm 聚合物反相固相萃取柱（60 mg/3 ml 管）</td><td>Phenomenex, 麦克尔斯菲尔德, 英国</td><td>8B-S100-UBJ</td><td></td></tr><tr><td>4000 QTrap 三重四极杆质谱仪</td><td>AB Sciex, 沃灵顿, 英国 www.sciex.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1200 快速分离液相色谱系统</td><td>Agilent, 斯托克波特, 英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XB C18 反相毛细管色谱柱（100 mm × 2.1 mm，2.6 &amp;micro;m 粒径）</td><td>Phenomenex, 麦克尔斯菲尔德, 英国 www.phenomenex.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analyst 1.6.2 软件</td><td>AB Sciex, 沃灵顿, 英国 www.sciex.com</td><td></td><td>用于 QTrap 的数据采集与分析，包括峰面积积分</td></tr><tr><td>自动进样瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用肽段的多反应监测质谱法进行混合物中物种鉴定与定量——应用于肉类真实性检测

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

我们描述了一种简单的方法，用于鉴定并定量含有一个或多个相似蛋白质的两种物种二元混合物中的各组分。该方法的核心是识别目标物种中的“对应蛋白质”，即名义上相同但具有物种特异性序列差异的蛋白质。在发生蛋白水解时，这些对应蛋白质会产生一些同样相似但带有物种特异性变异的肽段，即“对应肽段”。物种特异性肽段可作为物种鉴定的标记物，而对应肽段的成对信号则可用于混合物中两种物种的相对定量。通过多重反应监测（MRM）质谱法检测这些肽段，这是一种高度特异的技术，即使在复杂体系中也能实现基于肽段的物种鉴定。此外，来自对应肽段的MRM峰面积之比可用于支持相对定量分析。由于对应蛋白质和对应肽段在样品处理、实验提取及样品制备过程中通常表现出相似的行为，因此相对定量结果具有较好的稳健性。同时，该方法无需绝对定量方法所需的标样和校准过程。本方案以红肉为例进行说明，因其各自肌红蛋白可作为理想的对应蛋白质。该应用与食品欺诈检测密切相关：该方法可检测出牛肉中按重量占比1%的马肉成分。利用MRM峰面积比进行对应蛋白质-对应肽段（CPCP）相对定量，能够准确估算马肉与牛肉混合物的重量比组成。

在一次动态模式 MRM 实验中，每个预设的跃迁均在指定的保留时间窗口内被独立记录（以每秒检测器计数，cps 表示）。因此，从单次实验采集的所有数据中，可分别提取出每个跃迁的峰强度。此时，仅有该跃迁所对应的保留时间窗口内存在有限信号；在窗口之外，信号按定义为零。对于任意一个跃迁信号，例如来自马源蛋白的 752 → 1269（肽段单一同位素质量为 1,501.66 道尔顿，前体离子 m/z 为 751.84 道尔顿，电荷态 = 2，碎片离子 y13），其信号通常仅需与测量噪声竞争，而无需与其他可能来自不同物质的跃迁峰相互干扰。因此，输出结果是一组清晰的峰，每个跃迁对应一个峰，且共享同一前体离子的跃迁具有相同的保留时间。
图1展示了1% w/w马肉掺入牛肉混合物中四条特征离子跃迁（752 → (1269, 706, 248, 1366)）的检测结果。由于显示的四条离子跃迁均与马源性成分相关，而在纯牛肉、羊肉或猪肉样品中不存在，因此这些峰表明样品中存在马源性成分。根据方法稳健性标准，当两条或以上离子跃迁的信噪比均超过某一设定阈值时，即可确认目标成分的存在。因此，本图证实了该牛肉混合物中含有1% w/w的马肉。
偶尔会检测到单个孤立的跃迁信号。这表明前体离子与单个碎片离子偶然匹配，该碎片可能来源于外源性蛋白质，其与系统预期并在质谱仪中预设的信号相符。这种峰呈单一性，且出现在非预期的保留时间，是偶然跃迁的特征，可予以忽略。
每个转换峰下的面积可分别单独计算。基于合适的片段，马肉与牛肉转换峰面积之比（例如，752 → 1269（马）与 767 → 1299（牛））将与混合物中实际肉类比例成正比。图2展示了这两种转换的峰面积百分比与马肉在马-牛混合物中按重量计百分比之间的关系图。若转换峰面积的百分比与肉类重量百分比一致，则斜率为1。本图中斜率为1.03，表明对于这些转换及CPCP配对，转换峰面积可可靠地反映混合物中两种肉类的相对含量。如果样品中马肉的肌红蛋白含量是牛肉的两倍，而其他因素保持不变，则该直线的斜率将大于1。
<img alt="色谱图，显示分离分析中多种化合物的保留时间与强度关系。" src="/files/ftp_upload/54420/54420fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 1%（w/w）马肉掺入牛肉中MRM跃迁强度随保留时间的变化 转变分别为 752 → (1269, 706, 248, 1366)，依次以橙色、黑色、蓝色和绿色表示。标记肽为 HPGDFGADAQGAMTK。这四个转变片段可记为 y13，y7，y2 和 y14，其中 yn 表示计数在 n 从肽段的C末端释放氨基酸。在四个 transitions 中，信噪比介于23至53之间。一条额外的红线表示0%马源、100%牛源的752 → 1269 transition，用于对比。仅显示保留时间的非零区域。该图已根据Watson修改 等3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54420/54420fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="马肉检测图；马肉在牛肉混合物中的过渡峰面积与重量百分比的关系。" src="/files/ftp_upload/54420/54420fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 马肉掺入牛肉中的重量百分比与马肉过渡峰面积百分比的关系图。 该图使用牛肉肽段（767）和马肉肽段（752），并针对两者均采用 y13 碎片离子。若以 A 表示峰面积，则纵坐标为 100AH / (AH + AB)。最佳拟合直线的斜率为 1.03（R2 = 0.99）。本图改编自 Watson et al.3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54420/54420fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

我们提出了一种用于鉴定和定量含有相似蛋白质的物种混合物中各组分的方案。质谱法通过检测肽段实现鉴定，并通过峰面积比值进行相对定量。作为一种用于食品欺诈检测的工具，该方法可检测出牛肉中1%的马肉成分。

我们描述了一种简单的方案，用于鉴定并定量含有一个或多个相似蛋白质的物种所组成的二元混合物中的两个组分。

本方法的总体目标是利用多反应监测质谱技术鉴定并定量生肉混合物中的物种成分，从而作为食品欺诈检测的工具。该方法有助于回答食品真实性领域中的关键问题，例如确认香肠或汉堡等产品中所含的物种。我们的方法基于对蛋白质组分的质谱分析。该技术的主要优势在于能够提供快速且定量的结果。我们最初产生此方法的想法，是由于注意到尽管不同物种中同名的蛋白质实际上存在足够差异以实现物种鉴定，但它们又足够相似从而允许进行定量分析。通过将样品在95摄氏度的加热块中加热30分钟，使纯化的参考肌红蛋白发生热变性。将样品冷却约15分钟，直至达到室温。然后加入30毫克尿素以促进消化，并混匀。按酶与底物质量比1:30的比例，向样品中加入胰蛋白酶溶液。然后轻轻涡旋混匀，并在37摄氏度下孵育过夜以进行蛋白酶解。接下来，通过将蛋白酶解后的样品与水按1:2的体积比稀释，对样品进行脱盐处理。使用1毫升甲醇活化装有30毫克反相材料的聚合物反相小柱。然后加入1 mL的1%甲酸，对固相萃取柱进行平衡。在重力作用下将样品加载到固相萃取柱上。接着用1 mL含有1%甲酸的5%甲醇溶液洗涤。用一毫升乙腈水溶液将肽洗脱至预先装有五微升二甲基亚砜（DMSO）的二毫升微量离心管中。随后，在50摄氏度下使用离心浓缩仪减压除去溶剂，持续120分钟。然后将残留物重新溶解于250微升乙腈水溶液中。将溶液转移至低体积自动进样瓶中。在UniProt数据库中查找不同肉类的肌红蛋白序列。将肌红蛋白序列输入肽段和过渡预测软件的靶标框中。如有需要，将鼠标悬停在肽段上可显示其碎片列表。按照文本方案中所述输入参数后，单击“导出”并选择“转换列表”，以生成包含所创建的 MRM 转换及参数的电子表格。建立一套配备自动进样器和C18核壳HPLC色谱柱的二元梯度高效液相色谱（HPLC）系统，并将其连接至三重四极杆质谱仪，质谱仪在正电喷雾模式下运行，并采用MRM检测方式。在液相色谱-质谱数据采集软件的编辑参数部分，选择扫描类型为 MRM，极性为正离子模式。输入在电子表格中创建的各离子对转换对应的 Q1、Q3、时间、ID、DP 和 CE 值，并保存采集方法。按照文本方案中所述设置方法参数后，进入数据采集软件，点击“采集”并选择“平衡”。在打开的对话框中，选择所需的采集方法以开始仪器平衡。然后将样品瓶放入自动进样器的样品架中。点击“文件”菜单，选择“新建”，然后选择“采集序列”。在样本名称中输入待分析各样本的身份信息。有关如何可视化获取的数据的详细信息，请参见文本方案。使用经过预先冷冻并研磨成粉末的肉类。通过将相应重量的肉类称量至15毫升塑料离心管中，制备一系列肉样混合物。向肉粉中加入4毫升提取缓冲液。涡旋振荡30秒后，在室温下以每分钟250个循环的速度在实验室摇床上提取2小时。将两毫升提取物转移至一个两毫升的微量离心管中，在四摄氏度、17,000 G 条件下离心五分钟。取200微升上清液分装至两毫升离心管中。使用离心浓缩仪将样品干燥，然后按照文本方案所述测定样品的蛋白质浓度。为进行肉类混合物的蛋白质水解，将干燥的残留物重新溶解于一毫升25毫摩尔的碳酸氢铵溶液中。充分涡旋混匀后，按前述方法进行蛋白水解。随后以类似方式设置并运行液相色谱-质谱联用仪，采用预定的多反应监测模式（scheduled MRM）。在数据浏览软件中显示完整的色谱图。依次显示每组转换对应的提取离子。通过目视确认每个峰簇在预期的保留时间内均包含相应数量的钟形峰，从而确认所选肽段的存在。接下来，在导航栏中双击“Quantiation Wizard”。在“Select Samples”窗口中，通过选择单个数据文件来创建定量集，然后选择一个或多个可用的样本。选择“下一步”以显示选定设置和查询框。保留默认设置，然后选择“下一步”以显示“选择方法”。在下拉的“方法”框中选择整合方法文件，最后选择“完成”。保存结果表格，将其导出为文本文件，并在电子表格中打开以查看数据，具体操作如文本方案中所述。该图显示了从马与牛肉按重量百分之一比例混合样品中获得的最强MRM跃迁。相比之下，当样品中不含马成分时，红线显示了牛肉的跃迁信号。这是测得的马肉在牛肉中的含量与实际添加量的比值关系图。该图清晰地展示了本方法可用于进行定量检测。一旦掌握该方法并采用批量处理，每天 24 小时内可检测的样本量可达 20 个。在进行该实验操作时，重要的是要记住选择适合提取分析的蛋白质。肌红蛋白是检测红肉物种的良好候选蛋白，因为它含量丰富、可溶于水且具有热稳定性。该方法还可进一步扩展，以同时鉴定和定量更多物种。最大数量仅受限于质谱扫描速度。该技术正在为研究人员将肽指纹图谱应用于消费者和品牌保护等领域铺平道路。

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