Name: 抗原驱动结肠炎模型的开发由抗原呈递细胞T细胞抗原研究的介绍 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 了解抗原驱动结肠炎模型，用于研究CX3CR1阳性单核吞噬细胞与CD4阳性T细胞的相互作用。该方法通过过继转移T细胞至免疫缺陷宿主，结合荧光蛋白标记技术，实时监测肠道固有层免疫事件，揭示炎症性肠病发病机制。

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JHN 获得瑞士国家科学基金会（SNSF 310030_146290）的支持。

小鼠在乌尔姆大学（德国乌尔姆）动物实验中心的无特定病原体（SPF）条件下进行繁育和饲养。所有动物实验均依照当地动物使用与护理委员会的指南及国家动物福利法的规定进行。
1. pCFP-OVA 质粒的构建
<ol>
	<li>使用引物 Ova_SpeI_fw（3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5'）和 Ova_ClaI_rev（3'-GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5'）扩增全长 OVA 基因37 使用质粒 pCI-OVA（氨苄青霉素抗性）42 作为模板。克隆PCR产物（即 使用引物和载体的 SpeI 和 ClaI 限制性酶切位点，将编码 OVA 的序列克隆至一种市售的噬菌体中间载体中，从而获得特异性的 OVA 质粒。</li>
	<li>扩增编码CFP的基因及其强组成型启动子 P高 使用质粒 pAD1-cCFP（氯霉素抗性） 43 以 CFP_SacII_fw（3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5'）和 CFP_SpeI_rev（3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5'）为引物，质粒为模板37.</li>
	<li>使用引物和载体的 SpeI 和 SacI 限制性酶切位点，将编码 CFP 的基因克隆至特定的 OVA 质粒（氨苄青霉素抗性）中37这在OVA编码序列的CFP编码区之间引入了由6个甘氨酸残基组成的间隔序列。</li>
</ol>
2. 构建 E.coli pCFP-OVA
<ol>
	<li>培养 E.coli 在37 °C下，于100 ml LB（Luria Bertani）培养基中，将DH10B菌株在旋转摇床上有氧培养过夜。</li>
	<li>将800 µl细菌培养物与200 µl甘油混合制备甘油菌种，并于-80 °C保存。</li>
	<li>从甘油菌种中取50 µl大肠杆菌DH10B菌株接种于5 ml LB培养基中，37 °C有氧条件下在摇床中过夜培养。</li>
	<li>将培养物转移至含有250 ml LB培养基的1 L带挡板锥形瓶中，在37 °C下于摇床中振荡培养。</li>
	<li>将细菌培养至600 nm处的光密度（OD600) OD值为0.5时，将菌液置于冰上冷却30分钟。在4 °C条件下，以5,000 × g离心10分钟。</li>
	<li>用100 ml预冷的无菌H2在4°C下以5,000 × g离心细菌10分钟。用100 ml预冷的10%甘油重悬细菌，于4°C下以5,000 × g离心10分钟。重复此步骤两次。</li>
	<li>最后一次洗涤步骤后，将细菌重悬于700 µl 10%甘油溶液中。取50 µl分装，液氮冷冻后于-80 °C保存。</li>
	<li>在冰上解冻50 µl样品，转移至预冷的电穿孔比色皿（电极间距2 mm）中。</li>
	<li>加入5 µl质粒DNA（100 ng）至50 µl中 E. coli 分装。以25 µF、200欧姆（Ω）和2.5 kV的参数进行单次脉冲电穿孔。</li>
	<li>将细菌重悬于1 ml预热的SOC培养基（5 g/L酵母提取物，2 g/L胰蛋白胨，10 mM氯化钠，2.5 mM氯化钾，10 mM氯化镁，10 mM硫酸镁）中，于37 °C有氧条件下孵育1小时。</li>
	<li>在含有氨苄青霉素（100 µg/ml）的LB琼脂平板上接种细菌（将100 µl浓度为100 mg/ml的氨苄青霉素储存液加入100 ml LB琼脂中），于37 °C有氧条件下过夜培养。</li>
	<li>挑取单菌落，接种于含氨苄青霉素100 µg/ml的LB琼脂平板上划线培养。37 °C有氧条件下过夜培养。</li>
	<li>挑取单克隆菌落，接种于 10 ml 含氨苄青霉素（100 µg/ml）的 LB 培养基中，过夜培养，用于质粒提取。使用 commercially available 质粒小提试剂盒，用 30 µl dH₂O 洗脱质粒 DNA。2O（蒸馏水）按照制造商方案操作。通过限制性酶切分析和DNA测序验证质粒。37,42,43.</li>
	<li>建立阳性克隆的培养 E. coli 在含100 µg/ml氨苄青霉素的100 ml LB培养基中接种pCFP-OVA，于37 °C恒温摇床中需氧培养过夜。</li>
	<li>将800 µl细菌培养物与200 µl纯甘油混合，于-80 °C保存。</li>
	<li>将剩余的过夜培养物在室温下以 5,000 x g 离心 10 分钟，用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬沉淀。取 10 µl 悬液滴加到玻片上，盖上盖玻片。</li>
	<li>在标准荧光显微镜下观察样品，以确认CFP-OVA的荧光表达（CFP激发波长450 nm，发射波长480 nm）。从400倍放大开始分析细菌。</li>
	<li>在5,000 × g下离心1 ml过夜培养的细菌，10分钟，室温。将沉淀重悬于40 µl PBS中，95 °C煮沸10分钟。</li>
	<li>将样品在30,000 × g离心10分钟，取上清液用于Western blot分析37使用兔源抗OVA多克隆抗体，按1:400比例稀释。</li>
</ol>
3. OT-II/Red 小鼠的制备
<ol>
	<li>将雄性/雌性 OT-II 小鼠与表达红色荧光蛋白的雌性/雄性小鼠（两种品系均可商业获得）杂交，以获得 OT-II/Red 小鼠37。</li>
</ol>
4. 脾脏细胞分离
<ol>
	<li>使用市售的卤代醚类麻醉剂（诱导浓度最高可达5%）进行吸入麻醉后，通过颈椎脱臼法处死OT-II/Red小鼠。</li>
	<li>使用剪刀剪开小鼠左上腹部。在此部位下方可见脾脏（呈深红色椭圆形结构）。使用剪刀和镊子将其取出。
	<ol>
		<li>取出OT-II/Red小鼠的脾脏，将其置于装有50 ml离心管的100 µm细胞筛网上，用1 ml注射器的推杆研磨，以获得单细胞悬液。用10 ml含1%热灭活胎牛血清（FBS）的PBS冲洗筛网两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞悬液在室温下以390 × g离心5分钟。弃上清后，加入5 ml预热的裂解缓冲液（144 mM NH4Cl，17 mM Tris，pH = 7.2），以裂解红细胞。37 °C孵育10分钟。</li>
	<li>用25 ml含1% FBS的PBS洗涤样本，在室温下以390 × g离心5分钟。将沉淀重悬于10 ml含1% FBS的PBS中。</li>
	<li>使用血细胞计数板（Neubauer计数室）进行细胞计数。取10 µl细胞悬液与10 µl 0.4%台盼蓝溶液混合，孵育1–2分钟。
	<ol>
		<li>取10 µl染色后的细胞悬液加入血细胞计数板腔室。在显微镜下计数其中一个计数室的四个1 × 1 mm2方格内的细胞，计算每个方格的平均细胞数。活细胞呈白色，死细胞呈蓝色。计算每毫升细胞数量时，将计数所得细胞数乘以稀释倍数；若计数了2–4个象限，则需除以所计象限的数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. CD4+ CD62L+ T 细胞富集
<ol>
	<li>通过磁珠分离试剂盒，利用阴性或阳性选择原理富集脾细胞中的 CD4+ CD62L+ T 细胞。此处，先采用阴性选择法分离 CD4+ T 细胞，再通过阳性选择法进一步富集 CD4+ T 细胞群体中的 CD62L+ 亚群。 
	注：在阴性选择过程中，非目标细胞（此处为所有 CD4 阴性细胞）会被连接磁性微珠的特异性抗体标记；在过柱洗涤步骤中，未标记的 CD4+ T 细胞将流经柱体，从而易于收集。在阳性选择过程中，目标细胞被连接磁性微珠的合适抗体标记；在过柱洗涤步骤中，标记细胞将滞留在柱体内，通过将柱体移出磁场并用缓冲液冲洗，即可收集目标细胞。</li>
	<li>进行阴性选择时，将 107 个总脾细胞重悬于 40 µl 含 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）的冷 PBS 中。加入磁珠分离试剂盒提供的 10 µl 生物素标记抗体混合物（特异性结合非 CD4+ T 细胞的抗体），冰上孵育 15 分钟。
	<ol>
		<li>加入 30 µl 含 0.5% BSA 的冷 PBS 和 20 µl 抗生物素微珠，冰上孵育 20 分钟。</li>
		<li>向样品中加入 10 ml 含 0.5% BSA 的 PBS，以 390 × g 离心 5 分钟。重复此步骤两次。将细胞重悬于 1 ml 含 0.5% BSA 的冷 PBS 中。</li>
		<li>将适用于阴性选择的柱子置于磁场中，用 3 ml 含 0.5% BSA 的冷 PBS 冲洗柱子。将细胞悬液加入柱中，并用 3 ml 含 0.5% BSA 的冷 PBS 洗涤 3 次。</li>
		<li>将流出液以 390 × g 离心 5 分钟。流出液中包含未标记的 CD4+ T 细胞。将沉淀重悬于 1 ml 含 0.5% BSA 的 PBS 中，并计数细胞。</li>
		<li>使用血球计数板（Neubauer 计数室）进行细胞计数。取 10 µl 细胞悬液与 10 µl 0.4% 台盼蓝溶液混合，孵育 1–2 分钟。
		<ol>
			<li>取 10 µl 染色后的细胞悬液填充血球计数室，在显微镜下计数一个计数室中四个 1 × 1 mm2 方格内的细胞数，计算每个方格的平均细胞数。活细胞呈无色，死细胞呈蓝色。计算每毫升细胞数时，将细胞数乘以稀释倍数。若计数了 2–4 个象限，则需除以象限数。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行阳性选择时，每 107 个预富集的 CD4+ T 细胞组分中加入 10 µl CD62L 微珠，冰上孵育 15 分钟。
	<ol>
		<li>向样品中加入 10 ml 含 0.5% BSA 的 PBS，以 390 × g 离心 5 分钟。重复此步骤两次。将细胞重悬于 500 µl 含 0.5% BSA 的冷 PBS 中。</li>
		<li>将适用于阳性选择的柱子置于磁场中，用 500 µl 含 0.5% BSA 的冷 PBS 冲洗柱子。将细胞悬液加入柱中，并用 500 µl 含 0.5% BSA 的冷 PBS 洗涤 3 次。</li>
		<li>将柱子移出磁场，置于合适的收集管上。向柱中加入 1 ml 含 0.5% BSA 的 PBS，用力推动柱塞，将滞留在柱内的 CD4+ CD62L+ T 细胞冲洗出来。 
		注：分离得到的 CD4+ CD62L+ T 细胞现已可用于后续实验，例如 in vivo 实验。根据 CD4+ CD62L+ T 细胞分离试剂盒说明书，所用微珠无毒性。由于微珠尺寸极小（约 50 nm），不会激活细胞，也不会占据细胞表面表位，因此分离的细胞可直接转移至免疫缺陷小鼠以诱导结肠炎37,44,45。</li>
		<li>使用血球计数板（Neubauer 计数室）进行细胞计数。取 10 µl 细胞悬液与 10 µl 0.4% 台盼蓝溶液混合，孵育 1–2 分钟。
		<ol>
			<li>取 10 µl 染色后的细胞悬液填充血球计数室，在显微镜下计数一个计数室中四个 1 × 1 mm2 方格内的细胞数，计算每个方格的平均细胞数。活细胞呈无色，死细胞呈蓝色。计算每毫升细胞数时，将细胞数乘以稀释倍数。若计数了 2–4 个象限，则需除以象限数。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 抗原诱导性结肠炎的诱导
<ol>
	<li>向 CX3CR1GFP/+ x RAG-/- 小鼠腹腔注射 3 × 105 个 OT-II/Red CD4+ CD62L+ T 细胞。为诱导抗原特异性结肠炎，每隔一天通过灌胃或门齿后口服接种方式，每只小鼠给予 100 µl 含 1 × 108 菌落形成单位（CFU）的 E. coli pCFP-OVA。</li>
	<li>每周两次监测移植小鼠的体重及其临床状况（粪便中是否带血、粪便性状以及小鼠活动能力）。</li>
</ol>
7. 用于组织病理学检查的组织样本
<ol>
	<li>取小鼠大肠组织样本，用中性缓冲福尔马林（10%）固定，并按先前所述方法进行石蜡包埋36,46。</li>
	<li>使用切片机对石蜡包埋的样本进行切片，载片后进行苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色47,48。</li>
	<li>根据既往文献报道的方法对大肠组织学进行分类47,48：正常（评分0）；轻度结肠炎（评分1）；中度结肠炎（评分2）；重度结肠炎（评分3）。</li>
</ol>
8. 结肠固有层细胞的分离
<ol>
	<li>使用市售的卤代醚类麻醉剂（诱导时浓度最高可达5%）进行吸入麻醉后，通过颈椎脱位法处死移植小鼠。</li>
	<li>将动物仰卧放置。用镊子夹住尿道口前方的皮肤，用剪刀沿腹侧中线从腹股沟剪至胸部，然后将两侧皮肤向后拉开。</li>
	<li>剪开透明的腹膜肌层以打开体腔。识别从肛门延伸至盲肠49的结肠组织。切断结肠两端，并去除附着的脂肪组织。</li>
	<li>使用解剖剪纵向切开结肠。用镊子在含有25 ml PBS（补充1% FBS）的培养皿中轻轻振荡结肠组织，以去除碎片和黏液。将结肠切成5–8 mm的小段。</li>
	<li>将结肠节段放入含有20 ml洗涤缓冲液的50 ml离心管中。洗涤缓冲液的成分为500 ml DPBS、10 mM Hepes和5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）。</li>
	<li>以最大速度涡旋震荡管子30秒。</li>
	<li>将装有结肠节段的管子置于37 °C水浴中，以200 rpm振荡孵育10分钟。</li>
	<li>孵育结束后，以最大速度涡旋震荡管子30秒。</li>
	<li>弃去上清液，将组织样本转移至另一个含有20 ml洗涤缓冲液的50 ml离心管中。重复步骤6–9共三次。</li>
	<li>弃去上清液，将组织样本放入含有25 ml PBS的培养皿中。用镊子在培养皿中轻轻振荡组织样本数秒钟，以去除残留的上皮细胞。此步骤重复三次。</li>
	<li>将结肠组织切成2 × 2 mm2的小块，并在10 ml Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基中消化，培养基中含0.5 mg/ml来自Clostridium histolyticum的胶原酶VIII型和10 U/ml DNaseI。</li>
	<li>以最大速度涡旋震荡管子30秒。</li>
	<li>将结肠碎片置于37 °C水浴中，以200 rpm振荡孵育35分钟，每隔5分钟涡旋震荡30秒。</li>
	<li>孵育结束后，以最大速度涡旋震荡管子30秒。</li>
	<li>将消化后的组织碎片通过置于新50 ml离心管上的70 µm细胞滤筛进行过滤收集。</li>
	<li>加入20 ml DPBS洗涤样本，400 g离心5分钟。然后将细胞重悬于1 ml DPBS中。</li>
	<li>使用Neubauer计数板对细胞进行计数。取10 µl细胞悬液与10 µl 0.4%台盼蓝溶液混合，孵育1–2分钟。
	<ol>
		<li>取10 µl染色后的细胞悬液填充至血细胞计数室。在显微镜下计数计数室中四个1 × 1 mm2方格内的细胞数，计算每个方格的平均细胞数。活细胞呈白色，死细胞呈蓝色。根据稀释倍数乘以细胞数计算每毫升细胞数量。若计数了2–4个象限，则需除以象限数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 用于流式细胞术分析的细胞外染色
<ol>
	<li>将cLP细胞在390 × g条件下离心5分钟。用1 ml FACS A缓冲液（PBS中添加1% BSA和0.1%叠氮化钠）重悬细胞。 
	注意：叠氮化钠具有高毒性，可引起低血压、低体温、头痛、惊厥甚至死亡。稀释的叠氮化钠溶液（0.1至1.0%）通常对使用者不构成特殊危险，但对眼睛和皮肤具有刺激性。因此，使用叠氮化钠时必须在通风橱内操作，并穿戴实验服及双层一次性丁腈手套。</li>
	<li>在室温下，用FACS A缓冲液稀释抗FcγRIII/II CD16/CD32的单克隆抗体2.4G2（每106个细胞使用0.5–1 µg抗体），与细胞孵育15分钟。</li>
	<li>向细胞中加入200 µl FACS A缓冲液，在390 × g条件下离心5分钟。重复此步骤两次。随后在4 °C条件下，用适量单克隆抗体（每106个细胞0.5 ng）孵育细胞20分钟。抗体需用FACS A缓冲液稀释。</li>
	<li>向细胞中加入200 µl FACS A缓冲液，在390 × g条件下离心5分钟。重复此步骤两次。最后将样品用100 µl FACS A缓冲液重悬。</li>
	<li>通过流式细胞仪分析经OT-II/Red CD4 T细胞重建的CX3CR1GFP/+ × RAG-/-小鼠的T细胞37。</li>
	<li>使用商业软件进行数据分析。</li>
</ol>
10. 共聚焦显微镜分析
<ol>
	<li>分析经或未经OT-II/Red CD4+CD62L+ T细胞重建、且每隔一天经口饲喂1 × 108 CFU E. coli DH10B pCFP-OVA菌株的CX3CR1GFP/+小鼠的结肠组织。</li>
	<li>使用剪刀和镊子从小鼠体内取出结肠，并用解剖剪沿纵轴切开。</li>
	<li>用剪刀截取一段5–8 mm的结肠样本，置于载玻片上，并加盖盖玻片。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜以40/1.30倍率分析结肠样本。</li>
	<li>使用激发波长488 nm、发射波长509 nm的滤光片组，检测被绿色荧光蛋白（GFP）标记的CX3CR1+巨噬细胞（MPs）。</li>
	<li>使用激发波长554 nm、发射波长586 nm的滤光片组，检测表达红色蛋白的CD4+ T细胞。</li>
	<li>使用激发波长450 nm、发射波长480 nm的滤光片组，检测E. coli pCFP-OVA。</li>
	<li>定义感兴趣区域，并如前所述50生成散点图以进行共定位分析。采用两种不同公式：Manders重叠系数和Pearson相关系数。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

与其他所有模型一样，上述抗原诱导的结肠炎模型可能存在一些问题，操作该技术的研究人员必须对此保持警惕。在将OT-II/Red+ CD4+ T CD62L+细胞注射入宿主时，研究人员必须非常轻柔并小心地将针头插入腹腔。若操作不当，可能导致小鼠肠道撕裂，进而引起死亡，或导致细胞被注射至皮下，无法诱导疾病发生。
通常，小鼠在细胞转移后的第一周内会增重。研究者应在每次称重时间点的同一时间进行称重，并在整个实验过程中使用同一台称重天平。有时，实验小鼠（尤其是实验开始时体重低于18 g的小鼠）可能不会出现消耗综合征的任何症状。然而，这些动物在宏观评估下仍可能出现明显的肠道炎症。
在操作基因修饰细菌时，可能会发生污染。为避免此类问题，强烈建议使用荧光显微镜检测表达CFP-OVA的E.coli，以分析细菌是否具有荧光且呈杆状（典型的E.coli形态）。
所提出的抗原驱动型结肠炎依赖于以下观...

肠道是人体暴露于外部环境的最大表面。大量定植微生物在人体肠道内寄居，形成肠道微生物群（或称肠道菌群）。据估计，其包含多达10万亿个微生物细胞，是生物学中已知最密集的细菌栖息环境之一1-3在胃肠道中，细菌定植于肠道生态位，并在此存活和增殖4相反，微生物群赋予宿主一些其基因组未编码的额外功能特性1例如，微生物群可刺激上皮细胞增殖，产生宿主自身无法合成的维生素，调节代谢，并抵御病原体4-6鉴于这种有益的关系，一些作者提出，人类是 &#34;超级生物体&#34; 或 &#34;全生物体&#34; 包含细菌和人类基因的混合体7,8鉴于微生物群对（人类）宿主具有有益影响，肠道免疫系统需要耐受共生微生物，以允许其在肠腔内存在，同时清除从肠腔侧入侵的病原体。9-11肠道免疫系统已进化出能够区分无害和潜在有害管腔微生物的机制；然而，这些机制尚未被充分阐明。12维持肠道完整性需要严格调控的免疫稳态，以保持耐受与免疫之间的平衡13免疫稳态失衡可导致炎症性肠病（IBD）等肠道疾病的发生。3,14.
炎症性肠病（IBD）主要有两种类型：克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。患有这些疾病的患者通常会出现便血、严重腹泻和腹痛15,16。IBD 的确切病因尚不明确，但遗传因素、环境影响以及免疫反应失调的共同作用可能是疾病发生的关键因素15。
炎症性肠病（IBD）的动物模型已使用了50多年。在过去的几十年中，为了验证关于IBD发病机制的各种假说，研究人员开发了多种新的IBD模型系统17,18。其中特征最明确的慢性结肠炎模型是T细胞转移模型，该模型可诱导T细胞稳态失衡19,20。该模型的操作包括将来自免疫功能健全小鼠的初始T细胞转移至缺乏T细胞和B细胞的宿主（如RAG-/-和SCID小鼠）中16,21。在此模型中，通过评估腹泻、体力活动减少和体重下降等表现，可在3至10周内监测疾病的发展，这种现象被称为消耗综合征16。与健康小鼠相比，接受细胞移植的宿主其结肠组织更厚、更短且更重16。利用T细胞转移模型，可以研究不同T细胞群体在IBD发病机制中的作用22。然而，该模型并未以抗原特异性方式分析抗原呈递细胞（APC）与T细胞在疾病过程中的相互作用。已有研究表明，髓系细胞与淋巴系细胞之间的相互作用可能在肠道炎症的发生中起关键作用23。尽管IBD的许多方面已得到阐明，但导致疾病发生的初始事件仍需进一步明确。
已证明，在缺乏微生物群转移的情况下，无法建立结肠炎模型24最近，一些理论认为，炎症性肠病（IBD）可能是机体对共生细菌产生免疫反应的结果。25作者还提出，共生细菌对于诱导远端肠道的炎症反应至关重要。26在无菌（GF）动物中，肠道免疫系统通常存在功能缺陷。27,28，但若用无特定病原体细菌混合物定植这些小鼠，则可促使其发育出功能完备的肠道免疫系统29因此，肠道微生物群似乎是炎症性肠病发病机制中的关键因素，可能作为易感机制促进肠道炎症的发生，也可能具有保护作用以抵御肠道炎症的发展30,31目前的理论认为，炎症性肠病（IBD）是遗传易感患者肠道微生物失衡（称为菌群失调）所致的结果。32但目前尚不清楚菌群失调是疾病的原因还是结果12考虑到微生物在炎症性肠病（IBD）发展中的作用， 体外 实验表明，CD4+ T细胞可被经肠道细菌刺激的抗原提呈细胞激活33,34.
此外，已有研究表明，来自不同共生菌物种的抗原，例如 大肠杆菌，拟杆菌属，真杆菌属 和 变形杆菌属，能够激活 CD4+ T细胞35这表明细菌抗原向T细胞的呈递在炎症性肠病（IBD）的发生中具有重要意义。为了降低肠道微生物群在疾病过程中产生的多种抗原所带来的复杂性，一种 大肠杆菌 已构建出可表达OVA抗原的小鼠品系。通过向RAG小鼠体内注射OVA特异性T细胞以诱导转移性结肠炎。-/- 表达OVA的动物定植 E. coli.
该模型基于最近的研究证据，表明在结肠固有层（cLP）中占主导地位的细胞亚群CX3CR1+ MPs36，在转移性结肠炎过程中会与CD4+ T细胞发生相互作用37。MPs通过其树突从肠腔中摄取颗粒性抗原（如细菌）36,38,39。先前的研究表明，MPs也能摄取进入肠腔的可溶性抗原，例如卵清蛋白（OVA）40,41。鉴于cLP中CX3CR1+ MPs数量丰富，这些细胞有可能摄取肠腔内的细菌并与其特异性的CD4 T细胞发生相互作用。在移植了OVA特异性CD4+ T细胞并定植了表达CFP-OVA的E. coli的小鼠中进行共聚焦成像显示，CX3CR1+ MPs在抗原驱动的结肠炎发展过程中与OT-II型CD4+ T细胞发生接触。该模型可用于研究肠道抗原呈递细胞（APC）与仅针对肠腔内特定抗原表达细菌的T细胞之间的抗原呈递过程。

<table><tbody><tr><td>LB肉汤，Miller型（Luria-Bertani）</td><td>Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>Reiss Laborbedarf e. K.</td><td>Model 3020 GFL</td><td></td></tr><tr><td>2 mm 间隙比色皿&amp;nbsp;</td><td>Peqlab Biotechnologie GmbH</td><td>71-2020</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell 系统&amp;nbsp;</td><td>BioRad Laboratories GmbH</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>LB琼脂，Miller型（Luria-Bertani）</td><td>Difco</td><td>244510</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-5G</td><td></td></tr><tr><td>SOC培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1797-100ML</td><td></td></tr><tr><td>High Pure 质粒提取试剂盒</td><td>Roche</td><td>11754777001</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Carl Roth GmbH &amp; Co</td><td>3810.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>537020&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳槽&amp;nbsp;</td><td>PEQLAB Biotechnology GmbH</td><td>40-0708</td><td></td></tr><tr><td>上样缓冲液</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA Marker&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM0312</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭溶液</td><td>Carl Roth GmbH &amp; Co. KG</td><td>2218.3</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统&amp;nbsp;</td><td>Decon Science Tech GmbH</td><td>DeVision G&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNA测序&amp;nbsp;</td><td>MWG-Biotech GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Biochrom</td><td>L182-50</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>HBO 100</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra 电泳系统</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1658005</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler 预染蛋白Marker&amp;nbsp;</td><td>Fermentas, St. Leon-Rot, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IstanBlue 溶液</td><td>Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜&amp;nbsp;</td><td>Macherey-Nagel GmbH &amp; Co. KG</td><td>741280</td><td></td></tr><tr><td>电转印仪&amp;nbsp;</td><td>Biometra GmbH</td><td>846-015-600</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003-25G</td><td></td></tr><tr><td>抗卵清蛋白抗体&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab181688</td><td></td></tr><tr><td>抗兔IgG&amp;nbsp; HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0545&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Plus 西部印迹底物</td><td>Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc</td><td>32132</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Abbott</td><td>2594.00.00</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 细胞筛</td><td>Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254134-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; CD62 L&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T细胞分离试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-227&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS 柱&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS 柱&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand 支架</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>饲喂针头 20G</td><td>SouthPointe Surgical Supply, Inc</td><td>FN-7903</td><td></td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林溶液，10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1496904</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9627</td><td></td></tr><tr><td>伊红Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230251&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶VIII型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2139</td><td></td></tr><tr><td>罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）培养基</td><td>AppliChem</td><td>A2044, 9050</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>438456</td><td></td></tr><tr><td>小鼠BD Fc阻断剂</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记的mAb，识别V&amp;szlig; 5.1, 5.2&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>553189</td><td></td></tr><tr><td>APC标记的mAb，识别CD4 GK1.5&amp;nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-0041-83</td><td></td></tr><tr><td>FACS Calibur&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FCS Express V3 软件</td><td>DeNovo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meta 扫描共聚焦显微镜&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 工作站</td><td>Zeiss</td><td>LSM 7</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss ZEM 软件&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>v4.2.0.121</td><td></td></tr><tr><td>Maxisorp 免疫板&amp;nbsp;</td><td>NUNC, Roskilde</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素偶联的碱性磷酸酶</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>016-050-084</td><td></td></tr><tr><td>碱性磷酸酶底物：4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71768-5G</td><td></td></tr><tr><td>mAb R4-6A2</td><td>BD Biosciences</td><td>551216</td><td></td></tr><tr><td>mAb XMG1.2&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>554410</td><td></td></tr><tr><td>TECAN 微孔板ELISA读板仪</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasyWin 软件</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNase I 重组酶</td><td></td><td>4536282001</td><td></td></tr></tbody></table>

开发一种抗原驱动的结肠炎模型以研究抗原呈递细胞向t细胞呈递抗原的过程

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

炎症性肠病（IBD）是一种影响胃肠道（GIT）的慢性炎症性疾病。研究该疾病发生过程中涉及的免疫学机制的最佳方法之一是T细胞转移性结肠炎模型。在该模型中，将来自健康野生型供体的初始CD4+ T细胞移植到免疫缺陷型小鼠（RAG-/-受体）体内以重建其免疫系统。
该模型可用于研究导致疾病和慢性炎症的最早期免疫学事件，此时肠道炎症持续存在，但不依赖于特定抗原。为了研究抗原呈递细胞（APCs）在疾病过程中的潜在作用，建立一个由抗原驱动的疾病模型将非常有帮助，其中明确的共生菌来源抗原可引发结肠炎。因此，已开发出一种抗原驱动型结肠炎模型。在此模型中，将能够特异性识别卵清蛋白（OVA）中特定表位的OT-II CD4+ T细胞转移至RAG-/-宿主，并用表达CFP-OVA的E. coli进行攻击。该模型可用于研究固有层中抗原呈递细胞与T细胞之间的相互作用。

为建立一种抗原驱动的结肠炎模型，需进行以下操作： E. coli 菌株 已构建一种质粒，其中编码CFP的基因与鸡卵清蛋白蛋白的编码序列融合，该融合结构在强组成型启动子的调控下表达 P高 (图1A。荧光显微镜显示，该重组蛋白 E. coli pCFP-OVA，而非亲本 E. coli DH10B，表达CFP（图1B）。产生CFP-OVA的 E. coli 能够激活 OT-II 细胞 体外 并诱导IFN-γ的产生，与之相反的是 E. coli 仅表达CFP的菌株（图2). 图 3A 显示 离体 CX结肠组织的三维共聚焦成像3CR1GFP/+ 喂食的小鼠 E. coli pCFP-OVA E. ...

在此抗原驱动的结肠炎模型中，表达红色荧光蛋白的OT-II CD4+ T细胞被过继转移至单核吞噬细胞（MPs）表达绿色荧光蛋白的RAG-/-小鼠体内。随后，用表达卵清蛋白（OVA）与青色荧光蛋白（CFP）融合蛋白的大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）对宿主小鼠进行攻击。

开发一种抗原驱动的结肠炎模型以研究抗原呈递细胞向T细胞呈递抗原的过程

炎症性肠病（IBD）是一种影响胃肠道（GIT）的慢性炎症性疾病。研究其免疫学机制的最佳方法之一是……

该抗原驱动型结肠炎模型的总体目标是确定在抗原特异性结肠炎过程中，CX3CR1阳性的单核吞噬细胞是否与CD4阳性T细胞发生相互作用并激活这些T细胞，以及这种依赖于单核吞噬细胞的效应T细胞扩增是否发生在肠黏膜固有层内。该方法有助于解答炎症性肠病领域中的关键问题，例如结肠黏膜固有层内抗原呈递细胞与效应T细胞之间发生了哪些类型的相互作用。该技术的主要优势在于，它能够用于研究免疫细胞之间的相互作用以及导致炎症性肠病致病性的相关因素。该方法采用T细胞转移性结肠炎模型，将红色荧光抗原特异性初始CD4 T细胞转移至免疫缺陷型宿主，该宿主的单核细胞表达绿色荧光蛋白。细胞转移后，通过口服灌胃给予表达蓝色荧光抗原的细菌。可在疾病发展的不同阶段，监测宿主肠道固有层中发生的免疫事件。使用解剖剪纵向切开结肠，并在含有 25 毫升 PBS 的培养皿中冲洗组织，以去除任何碎片和黏液。将结肠切成 5 至 8 毫米大小的片段，并将所得组织片段放入 20 毫升不含钙和镁的新鲜 DPBS 中，DPBS 中添加 10 毫摩尔 HEPES 和 5 毫摩尔 EDTA。将样品管在最大转速下涡旋振荡 30 秒。然后，在37摄氏度下轻轻振荡孵育10分钟，以去除上皮层。孵育结束后，再次涡旋振荡30秒。随后，弃去含有上皮细胞的上清液。将组织块转移至含有20毫升新鲜PBS、HEPES和EDTA缓冲液的新离心管中，并在涡旋振荡前后重复孵育步骤。第三次重复后，所有上皮细胞均已被去除，上清液变得澄清。用PBS轻轻洗涤组织碎片，以去除残留的上皮细胞。将组织碎片切成2×2毫米大小的块状，转移至含有10毫升RPI培养基的容器中进行消化，该培养基中添加了0.5毫克/毫升的VIII型胶原酶和10单位/毫升的DNA酶I。将样品涡旋振荡30秒。随后，在37°C条件下振荡孵育组织块30至35分钟，孵育期间每5分钟涡旋振荡试管一次。组织消化完成后，将所得悬液通过70微米细胞滤筛过滤至50毫升锥形管中。用PBS洗涤滤筛一次，然后通过离心沉淀单细胞悬液。最后，用PBS重悬细胞洗涤一次，并进行离心。然后，通过台盼蓝排斥法确定活细胞数量。产生青色荧光蛋白卵清蛋白的 e. coli 可在体外激活 OT-II 细胞的干扰素 γ 产生，而 e.仅表达CFP的大肠杆菌。对饲喂表达CFP的大肠杆菌卵的转基因绿色荧光蛋白小鼠结肠组织进行离体三维共聚焦成像，结果显示，在靠近肠上皮细胞的结肠隐窝内存在表达荧光蛋白的细菌，并与宿主肠道吞噬细胞共定位。在OT-II红色动物中，CD4阳性T细胞的特征是共表达红色荧光蛋白和Vβ5.1。当用大肠杆菌PCFP-OVA攻击时，已过继移植了OT-II红色CD4阳性CD62配体阳性T细胞的BNT淋巴细胞缺陷型绿色荧光蛋白表达转基因小鼠会迅速减轻体重，并出现结肠炎的临床症状。细胞转移7天后，仅有少数宿主吞噬细胞摄取了大肠杆菌PCFP卵抗原，且未检测到OT-II红色阳性细胞。细胞转移14天后，已摄取大肠杆菌大肠杆菌PCFP卵抗原位于过继转移的OT-II红色阳性细胞附近。在细胞转移后21天，大量宿主细胞已摄取大肠杆菌PCFP卵抗原，而供体OT-II红色阳性细胞则分散分布于结肠固有层中，并与宿主肠道吞噬细胞紧密接触。如果操作得当，熟练掌握该技术后可在四小时内完成。在完成该步骤后，可进一步开展其他方法，如肠道淋巴细胞染色和血清细胞因子分析，以探究CD4 T细胞的活化状态，并确认结肠炎的严重程度。随着该技术的不断完善，它将为免疫学领域的研究铺平道路，有助于探索小鼠模型中导致炎症性肠病的细微事件。观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离结肠固有层免疫细胞，以用于后续的离体分析。

development-an-antigen-driven-colitis-model-to-study-presentation

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

抗原驱动结肠炎模型的开发由抗原呈递细胞T细胞抗原研究的介绍

本文详细介绍了一种快速分离小鼠肠道树突状细胞（DCs）和巨噬细胞的方法。通过多色流式细胞术对肠道树突状细胞和巨噬细胞进行表型鉴定，同时采用磁珠富集联合细胞分选技术，获得高纯度的细胞群体用于功能研究。...

从小鼠肠道中分离与鉴定树突状细胞和巨噬细胞

本视频展示了一种通过化学诱导建立小鼠结肠炎模型的技术——结肠炎是一种炎症性肠病。让小鼠饮用右旋糖酐硫酸钠（DSS）溶液足够时间。摄入后，DSS会破坏结肠中的黏液层和上皮屏障，使肠道微生物进入下方组织，被局部免疫细胞识别，从而引发过度的免疫反应，导致炎症发生。...

一种建立右旋糖酐硫酸钠诱导小鼠结肠炎模型的技术

DNBS/TNBS 诱导的结肠炎为研究炎症性肠病的发病机制提供了一种替代且经济的方法。本文讨论的实验方案概述了成功应用 DNBS...

DNBS/TNBS 结肠炎模型：揭示炎症性肠病及膳食脂肪影响

本文介绍了一种通过将同基因型CD4+CD45RBhigh...

通过将效应性CD4+CD45RBhigh T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠诱导小鼠肠道炎症

不同的树突状细胞亚群作为稀有群体存在于淋巴器官中，因此难以分离出足够数量和高纯度的细胞用于免疫学实验。本文介绍一种高效、高产量的方法，用于分离目前所知的所有小鼠脾脏树突状细胞主要亚群。...

一种高效且高得率的小鼠树突状细胞亚群分离方法

本文介绍了一种转基因报告小鼠模型，用于可视化小鼠不同组织中产生IL-22的细胞。该方法可用于追踪小鼠体内其他细胞因子或分泌蛋白的定位。...

利用报告基因小鼠可视化表达 IL-22 的淋巴细胞

小鼠远端结肠造口术为人类分流性结肠炎提供了一种小鼠模型，该模型表现为粪流绕行的结肠节段中以淋巴细胞性为主的结肠炎。...

小鼠远端结肠造口术：C57BL/6 小鼠分流性结肠炎的新模型

本方案介绍了一种完整的、经过验证的由TNBS诱导的克罗恩病小鼠模型，以及利用免疫荧光法对石蜡包埋的甲醛固定结肠组织切片进行雌激素受体免疫组织化学可视化的实验方法。...

利用免疫荧光技术观察三硝基苯磺酸诱导的克罗恩病小鼠结肠中的雌激素受体

本方案描述了一种针对肠道微生物群抗原特异性T细胞的过继转移结肠炎模型。从CBir1 TCR转基因小鼠中分离CD4+...

通过将CBir1 TCR转基因CD4+ T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠诱导肠道炎症

介绍了一种新的无需树突状细胞的抗原特异性T细胞诱导与扩增方法。基于HLA...

基于HLA-Ig的人工抗原呈递细胞用于高效 离体 人类CTL的扩增

了解抗原驱动结肠炎模型，用于研究CX3CR1阳性单核吞噬细胞与CD4阳性T细胞的相互作用。该方法通过过继转移T细胞至免疫缺陷宿主，结合荧光蛋白标记技术，实时监测肠道固有层免疫事件，揭示炎症性肠病发病机制。

开发一种抗原驱动的结肠炎模型以研究抗原呈递细胞向T细胞呈递抗原的过程

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