抗原驱动结肠炎模型的开发由抗原呈递细胞T细胞抗原研究的介绍
2016年9月18日
在这个抗原驱动的结肠炎模型中，表达红色荧光蛋白的 OT-II CD4+ T 细胞被过继转移到在单核吞噬细胞 （MPs） 中表达绿色荧光蛋白的 RAG-/- 小鼠中。用表达卵清蛋白 （OVA） 与青色荧光蛋白 （CFP） 融合的大肠杆菌 （E.coli） 攻击宿主。
这种抗原驱动的结肠炎模型的总体目标是确定在抗原特异性结肠炎期间 CX3、CR1 阳性单核吞噬细胞是否与 CD4 阳性 T 细胞相互作用并激活 CD4 阳性 T 细胞，以及这种单核吞噬细胞依赖性效应 T 细胞扩增是否发生在肠固有层内。这种方法可以帮助回答炎症性肠病领域的关键问题，例如抗原呈递细胞和结肠固有层中的效应 T 细胞内发生了哪些类型的相互作用。该技术的主要优点是它允许研究免疫细胞的相互作用和导致炎症性肠病致病性的因素。
该方法使用 T 细胞转移结肠炎模型，其中红色荧光抗原特异性幼稚 CD4 T 细胞被转移到免疫缺陷宿主，在单核细胞中表达绿色荧光蛋白。细胞转移之后是表达蓝色荧光抗原的细菌的口服强饲法。可以在疾病发展的各个阶段监测发生在宿主肠固有层的免疫事件。
使用解剖剪刀纵向打开结肠，并在含有 25 毫升 PBS 的培养皿中清洗组织，以去除任何碎屑和粘液。将结肠切成 5 到 8 毫米的小块，将所得碎片放入 20 毫升不含钙和镁的新鲜 DPBS 中，并补充有 10 毫摩尔 HEPES 和 5 毫摩尔 EDTA。以最大速度涡旋装有样品的试管 30 秒。
然后，在 37 摄氏度下孵育 10 分钟，轻轻摇晃以去除上皮细胞。孵育结束时，再次涡旋 30 秒。然后，丢弃含有上皮细胞的上清液。
将组织块转移到含有 20 毫升新鲜 PBS、HEPES 和 EDTA 缓冲液的新管中，并在前后重复孵育并采用涡旋步骤。第三次重复后，去除所有上皮细胞，上清液澄清。在 PBS 中轻轻洗涤组织碎片以去除任何残留的上皮细胞。
将组织片段切成 2 x 2 毫米的小块，然后将这些碎片转移到 10 毫米的 RPI 培养基中进行消化，补充有 0.5 毫克/毫升的 8 型胶原酶和每毫升 10 个单位的 DNAse 1。涡旋样品 30 秒。然后，将组织块在 37 摄氏度下振荡孵育 30 至 35 分钟，并在孵育期间每 5 分钟涡旋一次试管。
当组织被消化时，将所得浆液通过 70 微米的细胞过滤器过滤到 50 毫升锥形管中。洗涤细胞过滤器一次，然后离心使单细胞悬液离心。最后，在 PBS 中洗涤细胞一次并离心。
然后，通过台盼蓝排除法确定活细胞的数量。与 e 相比，产生青色荧光蛋白卵清蛋白的大肠杆菌在体外激活 OT-II 细胞中干扰素 γ 的产生。
仅表达 CFP 的大肠杆菌。用大肠杆菌 PCFP 卵饲养的转基因绿色荧光蛋白表达小鼠结肠组织的离体 3D 共聚焦成像表明，在肠上皮细胞附近的结肠隐窝内存在荧光蛋白表达细菌，并与宿主肠道吞噬细胞共定位。
在 OT-II 红色动物中，CD4 阳性 T 细胞的特征是它们共表达红色荧光蛋白和 V β 五点一。当用大肠杆菌 PCFP 卵攻击时，经过继移植 OT-II 红色 CD4 阳性 CD62 配体阳性 T 细胞的 BNT 淋巴细胞缺陷型绿色荧光蛋白表达转基因小鼠体重迅速减轻并出现结肠炎的临床症状。
细胞转移后 7 天，只有少数宿主吞噬细胞对大肠杆菌 PCFP 虫卵进行了采样，并且未检测到 OT-II 红细胞阳性细胞。细胞转移后 14 天，对 E.
大肠杆菌 PCFP 虫卵位于过继转移的 OT-II 红细胞附近。到细胞转移后 21 天，大量宿主细胞已经对大肠杆菌 PCFP 卵和分散在整个结肠固有层的供体 OT-II 红细胞进行了采样，与宿主肠道吞噬细胞密切接触。
掌握后，如果执行得当，这项技术可以在四个小时内完成。在此程序之后，可以进行其他方法，如肠道淋巴细胞染色和血清细胞因子分析，以回答有关 CD4 T 细胞活化状态的其他问题并确认结肠炎的严重程度。每次开发后，该技术为免疫学领域的研究铺平了道路，以探索导致小鼠模型中炎症性肠病的小事件。
观看此视频后，您应该对如何分离结肠固有层免疫细胞以进行下游离体分析有很好的了解。
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概述
本研究利用抗原驱动性结肠炎模型来研究CX3、CR1阳性单核吞噬细胞和CD4阳性T细胞之间的相互作用。该模型允许在疾病发展过程中监测肠黏膜下层的免疫事件。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 炎症性肠病
- 细胞相互作用
背景
- 了解单核吞噬细胞在T细胞活化中的作用。
- 探索结肠黏膜下层的免疫细胞相互作用。
- 研究炎症性肠病的致病机制。
- 利用荧光蛋白来追踪免疫反应。
研究目的
- 确定单核吞噬细胞和CD4 T细胞之间的相互作用。
- 评估肠黏膜下层效应T细胞的扩展。
- 提供对炎症性肠病机制的见解。
所用方法
- 将OT-II CD4 + T细胞移植到RAG -/-小鼠中。
- 使用荧光蛋白来标记免疫细胞。
- 口服给予表达卵白蛋白融合CFP的大肠杆菌。
- 监测不同疾病阶段的免疫事件。
主要结果
- 识别单核吞噬细胞和T细胞之间的相互作用。
- 提供肠黏膜下层效应T细胞扩展的证据。
- 提供对炎症性肠病致病性的见解。
- 展示T细胞转移结肠炎模型的实用性。
结论
- 该研究突出了结肠炎期间免疫反应中的关键相互作用。
- 研究结果有助于理解炎症性肠病的机制。
- 该模型为未来免疫学研究提供了框架。
常见问题
Executive Industry Relevance
This antigen-driven colitis model enables mechanistic interrogation of antigen-presenting cell and T cell interactions in a defined immunological context, supporting target validation in inflammatory bowel disease research. By providing a reproducible system to study pathogenic immune cell crosstalk in the lamina propria, it enhances predictive confidence in preclinical de-risking of immunomodulatory candidates. The model aligns with early discovery workflows focused on pathway clarification and biological target engagement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding antigen-specific T cell activation by mononuclear phagocytes.
- Operational Value: Provides a defined antigen-driven system to clarify biological pathways involved in colitis pathogenesis.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by isolating effector T cell expansion events in intestinal tissue.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems with fluorescently labeled immune cells for downstream ex vivo analysis.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of immune cell interactions and cytokine production in response to defined antigen exposure.
- Reproducibility: Standardized cell isolation and tissue processing support consistent immune event monitoring across experimental replicates.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models antigen-driven intestinal inflammation to study mechanisms relevant to subsets of inflammatory bowel disease.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase immune interaction data with preclinical validation of therapeutic candidates.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates evaluation of target engagement and mechanistic effects prior to lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports early discovery biology by enabling hypothesis testing of antigen-presenting cell functions in T cell activation, positioning it before lead identification stages. It generates quantitative immune event data useful for analytics-driven comparison of experimental conditions in immunology screening. The system is designed as a reusable platform for studying immune-mediated pathways across multiple target validation campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification of antigen-specific immune responses in the gut.
- Screening: Delivers reproducible immune cell isolation and stimulation protocols for compound or modulator evaluation.
- Analytics: Provides measurable readouts such as interferon gamma production and immune cell localization for condition comparison.
- Translational Research: Connects mechanistic insights to preclinical continuity through defined antigen-driven disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for studying APC-T cell interactions applicable to multiple immunology targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in immune cell interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined antigen challenge and cell transfer protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target-mediated biological effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on lamina propria immune event data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunology, flow cytometry, and fluorescent microscopy for immune cell isolation and analysis.
- Dependent on access to transgenic mouse models, fluorescent protein-expressing bacteria, and intestinal tissue processing equipment.
- Necessitates cross-team standardization of cell transfer timing, antigen dosing, and tissue harvest schedules.
- Adaptation considerations include model system compatibility with different antigen-specific T cell receptors and phagocyte markers.
- Practical limitations include the technical complexity of lamina propria cell isolation and the need for multi-day disease development monitoring.
