基于气动液滴操控平台的多位点核苷酸多态性可视化比色检测

本实验的总体目标是将一种用于可视检测多位点核苷酸多态性的简便方法与气动式液滴操控平台相结合。该DNA检测平台位于开放表面，生化研究人员使用起来简单直接。我们研究了一种可重复检测基因突变和遗传性疾病的简易工具。

它在帮助我们理解遗传变异如何导致疾病方面具有更大的潜力。我们结合了两种新颖且简单的方法，可在气动液滴操控平台上通过肉眼直接检测多核苷酸多态性，无需任何额外仪器。

多核苷酸多态性检测方法将由本课题组的博士后王紫明演示。开始此操作前，按照文本方案中的说明配制100微摩尔的探针DNA溶液。然后，将探针DNA加入每毫升1 OD的金纳米颗粒溶液中。

将SDS的终浓度调至0.01%，PBS的终浓度调至0.01摩尔。让溶液孵育20分钟。接着，通过加入2摩尔氯化钠和0.01摩尔PBS的溶液，将氯化钠浓度提高至0.05摩尔。

保持SDS浓度为0.01%，使溶液再孵育20分钟。每20分钟将氯化钠浓度逐步增加0.1摩尔，直至最终浓度达到1摩尔。将溶液在23摄氏度下于旋转仪中孵育过夜。

DNA 样品与金纳米颗粒结合后，将溶液在 7,000 × g 条件下离心 30 秒。移去上清液。随后，通过将沉淀重悬于去离子水中，制备 25 纳摩尔的金纳米颗粒探针溶液。

按照文本方案中的说明制备目标 DNA 样品。向每份含氯化钠的 DNA 样品中加入六微升金纳米粒子探针溶液。使用涡旋混合器，在 23 摄氏度下将每个样品溶液振荡五分钟。

然后，向每份DNA样品溶液中加入6 µL 400 mmol/L的羟胺和6 µL 25.4 mmol/L的氯金酸。将这些样品静置，接下来一小时内将逐渐发生颜色变化。根据纳米颗粒的尺寸和形貌依赖性光学特性，可通过肉眼辨别样品DNA片段中错配数量的典型差异。

开始制备液滴操控平台时，使用配备0.5毫米钻头的数控机床加工具有微结构的PMMA基母模。钻头的进给速度为每秒7毫米，转速为26,000 rpm，钻孔后检查模具。使用气流吹扫和去离子水清洁母模表面，以去除所有PMMA碎屑。

随后，制备10:1的PDMS基础剂与固化剂混合物。将混合物置于真空干燥器中脱气，直至所有气泡完全去除。然后，将PDMS混合物倒入母模中。

在 60 摄氏度下烘烤三小时，以在气室和气流通道中获得倒置的微结构。烘烤完成后，将 PDMS 层从母模上取下，并在上面打孔，用于空气抽吸入口。使用氧气等离子体处理系统清洁 PDMS 膜和 PDMS 层。

处理后，将PDMS膜与PDMS层键合，然后在此复合结构上打孔。接着，使用90摄氏度的加热板将PDMS与玻璃基底键合10分钟。待各层完全键合后，将复合板放入激光切割机中，PDMS膜面朝上。

导入 dwg 文件以定义超疏水区域，注意该区域将直接刻蚀到 PDMS 膜上。使用去离子水清洗新刻蚀的超疏水表面，以去除任何碳化残留物。

表面清洁后，通过电磁阀将气流吸入口与真空泵连接。然后，将电磁阀连接至计算机，利用数字IO USB模块对其进行控制。气动液滴操控平台搭建完成后，在超疏水区域加入10 µL的0.5 µmol/L目标DNA溶液。

接下来，在目标 DNA 液滴旁加入 10 µL 新近杂交的 25 nmol 金纳米粒子探针溶液。使用一个简单程序通过电磁阀控制对平台施加空气负压。将压力设置为 -80 kPa，驱动频率设置为 5 Hz。

沿着液滴的振动路径提供吸力，使其发生碰撞并融合。接着，通过调控吸力使融合后的液滴滚动，从而混合样品，持续三分钟。向气动液滴操控平台的超疏水区域加入 2 µL 的 400 mmol/L 盐酸羟胺溶液和 2 µL 的 25.4 mmol/L 氯金酸溶液。

调节吸力使液滴相互碰撞并融合。然后，将融合后的液滴滚动混合一分钟。用肉眼观察最终液滴的颜色。

本研究中，通过DNA杂交介导的金纳米粒子探针生长，以比色法检测多位点核苷酸多态性。此处，不同DNA样本与探针DNA的结合亲和力不同，导致金纳米粒子生长程度存在差异，从而表现为颜色变化。相较于完全互补的DNA样本，存在三个碱基对错配的DNA样本杂交程度较低，这在较高浓度下会呈现出明显的颜色差异。

六碱基错配的DNA与探针的杂交亲和力较弱，因此金纳米颗粒的生长尺寸较小。当通过气动吸力平台操作样品时，该比色分析显示出良好的重复性，因为DNA错配的结果可通过肉眼轻易观察到。一旦掌握，整个实验流程从样品和试剂的添加到结果读取耗时不到五分钟，远快于传统方法。

每次操作的总体积仅为10 µL，远低于大型系统所需体积。按照此流程，一旦确认DNA片段序列变异与特定疾病相关，即可使用专门设计的产物检测样本DNA中的错配数量。

气动液滴操控平台相较于其他方法（如光镊、染料电致荧光、电镊以及毛细管驱动的Shoomoo技术）具有更高的生物相容性。所提出的多位点核苷酸多态性检测方法在气动液滴操控平台上进行，这意味着样品和试剂可通过移液器直接加载和收集。该技术在开发完成后，有望广泛应用于DNA筛查及其他化学与生物信息学相关领域。