在气动操纵液滴平台多核苷酸多态性的视觉比色法检测
September 27th, 2016
这项工作提出了一个简单直观的方法来检测气动操纵液滴平台的多核苷酸多态性。与所提出的方法中，在整个实验，包括液滴操作和多核苷酸多态性检测，可以接近23°C不先进仪器的帮助下进行。
该程序的总体目标是将一种用于视觉检测多核苷酸多态性的简单方法与气动液滴作平台相结合。DNA 检测平台位于开放表面上，直接供生化研究人员使用。我们研究了一种重复检测基因突变和遗传疾病的简单工具。
它有更大的潜力帮助我们了解遗传变异如何导致疾病。我们结合了两种新颖而简单的方法。多核苷酸多态性可以在气动液滴作平台上用肉眼检测，无需任何其他仪器。
检测多核苷酸多态性的方法将由我们小组的博士后 Tzu-Ming Wang 演示。要开始此过程，请按照文本方案中的指示制备 100 微摩尔的探针 DNA 溶液。然后，将探针 DNA 添加到每毫升 1 OD 的金纳米颗粒溶液中。
使 SDS 的最终浓度为 0.01%，PBS 的最终浓度为 0.01 摩尔。让溶液孵育 20 分钟。接下来，通过添加 2 摩尔氯化钠和 0.01 摩尔 PBS 的溶液，将氯化钠的浓度增加到 0.05 摩尔。
将 SDS 浓度保持在 0.01%，让溶液孵育 20 分钟。在 20 分钟内以 0.1 摩尔的增量增加氯化钠的浓度，直到达到 1 摩尔的最终浓度。将溶液在 23 摄氏度下在旋转器上孵育过夜。
DNA 样品和金纳米颗粒偶联后，以 7， 000 倍 g 离心溶液 30 秒。去除上清液。接下来，通过将沉淀重悬于去离子水中来制备 25 纳摩尔的金纳米颗粒探针溶液。
按照文本方案中的概述制备目标 DNA 样品。向每个含有氯化钠的 DNA 样品中加入 6 μL 金纳米颗粒探针溶液。使用涡旋混合器，在 23 摄氏度下摇动每个样品溶液 5 分钟。
然后，向每个 DNA 样品溶液中加入 6 微升 400 毫摩尔羟基胺和 6 微升 25.4 毫摩尔氯金酸。将这些样品放在一边，因为在接下来的一小时内颜色将发生稳定变化。纳米颗粒的大小、形状依赖性的光学特性、样品 DNA 片段中的典型错配数量可以通过肉眼辨别。
要开始制造液滴作平台，请使用配备 0.5 毫米钻头的计算机数控机器来生产具有微结构的基于 PMMA 的母模。对于钻头，使用每秒 7 毫米的进给速度和 26， 000 rpm 的转速，并在钻孔后检查模具。使用鼓风机和去离子水清洁母模表面并去除任何 PMMA 废料。
在此之后，制备 PDMS 碱和固化剂的 10：1 混合物。在干燥器中对混合物进行脱气，直到去除所有气泡。然后，将 PDMS 混合物倒入母模中。
在 60 摄氏度下烘烤 3 小时，以获得气室和空气通道中的反向微观结构。烘烤完成后，从母模中取出 PDMS 层，并在其上为吸气口打孔。使用氧气等离子体处理系统清洁 PDMS 膜和 PDMS 层。
处理后，将 PDMS 膜和 PDMS 层粘合，然后在该共轭结构上打孔。接下来，使用 90 摄氏度的热板将 PDMS 和玻璃基板粘合在一起 10 分钟。将各层粘合在一起后，将复合板放入激光切割机 PDMS 膜面朝上。
导入 dwg 文件以定义超疏水区域，请注意，这将直接刻在 PDMS 膜上。用去离子水清洁新雕刻的超疏水表面。这将洗掉任何碳化残留物。
清洁表面后，通过电磁阀连接吸气口和真空泵。然后，将电磁阀连接到计算机，通过数字 IO USB 模块进行控制。建立气球液滴作平台后，在超疏水区域添加 10 μL 的 0.5 μmol 靶 DNA。
接下来，在目标 DNA 滴旁边添加 10 微升新鲜杂交的 25 纳摩尔金纳米颗粒探针溶液。使用一个简单的程序来控制通过电磁阀吸入平台的空气。将压力设置为负 80 千帕，将驱动频率设置为 5 赫兹。
沿液滴的振动路径提供吸力，使它们发生碰撞和聚结。接下来，通过纵吸力将样品滚动 3 分钟，混合聚结的液滴。将 2 微升 400 毫拉羟胺和两微升 25.4 毫拉氯金酸添加到气动液滴作平台的超疏水区域。
纵吸力，使液滴碰撞并合并。然后，将合并的液滴滚动 1 分钟以混合。用肉眼观察最终液滴的颜色。
在这项研究中，使用 DNA 杂交介导的金纳米颗粒探针生长通过比色法检测多核苷酸多态性。在这里，DNA 样品与探针 DNA 具有不同的亲和力，导致金纳米颗粒的生长存在差异，被视为颜色变化。与完全互补的 DNA 相比，三个碱基对错配的 DNA 样品的杂交作用更少，这可以看作是明显的颜色差异，尤其是在较高浓度下。
6 个碱基错配的 DNA 与探针的杂交亲和力较弱，因此金纳米颗粒的生长大小较小。当通过气动抽吸平台作样品时，这种比色分析被证明是可重复的，因为 DNA 错配的结果很容易通过肉眼观察到。一旦掌握，从添加样品和试剂到获得结果的整个过程只需不到五分钟，这比传统方法快得多。
每次作的总量仅为 10 微升，这明显低于大型系统所需的量。按照这个程序，一旦 DNA 片段空间的序列变异被确认是导致特定疾病的原因。专门设计的产品可用于获取样品 DNA 的许多错配。
气动液滴作平台比其他方法（如光学加权、染料电荧光、电加权和 shoomoo 毛细管驱动）更具生物相容性。所提出的多核苷酸多态性检测方法是在气动液滴作平台下进行的，这意味着样品和试剂可以直接用移液器加载和收集。开发后，该技术在 DNA 筛选以及其他化学和生物应用方面具有很大的潜力。
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概述
本研究提出了一种简单且可视化的方法，用于在气动液滴操控平台上检测多核苷酸多态性。该方法无需高级仪器即可进行检测，使其对生物化学研究人员来说更为便捷。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 遗传学
- 生物技术
背景
- 多核苷酸多态性是可能导致疾病的遗传变异。
- 理解遗传突变对于疾病研究至关重要。
- 目前的方法通常需要复杂的仪器。
- 一种更简单的方法可以提高研究人员的可及性。
研究目的
- 开发一种简单的方法来检测遗传突变。
- 利用气动液滴操控平台进行此目的。
- 促进对遗传变异及其对健康影响的理解。
所用方法
- 气动液滴操控平台。
- 多核苷酸多态性的可视化检测。
- 在接近室温（23 °C）下进行实验。
- 检测无需高级仪器。
主要结果
- 该方法成功地以可视化方式检测了多核苷酸多态性。
- 它简化了研究人员的实验过程。
- 展示了在遗传学研究中的潜在应用。
- 增强了对与疾病相关的遗传变异的理解。
结论
- 所提出的方法是有效且用户友好的。
- 它为不需要复杂工具的遗传学研究开辟了新途径。
- 未来的研究可以扩展该方法的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables rapid, instrument-free visual detection of multi-nucleotide polymorphisms, supporting early-stage target validation in genetic disease research. By reducing assay time to under five minutes and sample volume to 10 µL, it enhances screening efficiency in discovery workflows. The approach provides a low-cost, biocompatible platform for hypothesis testing in preclinical target de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables visual discrimination of DNA mismatch levels via AuNP probe growth, supporting therapeutic hypothesis interrogation.
- Operational Value: Facilitates rapid assessment of genetic variants linked to disease mechanisms without complex instrumentation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates size- and shape-dependent optical readouts that correlate with nucleotide mismatch count for quantitative screening.
- Operational Value: Uses pneumatic droplet manipulation for precise, simultaneous reagent mixing on an open surface, improving assay reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by detecting sequence variations confirmed to drive specific pathologies.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation through repeatable, naked-eye detection of polymorphism effects.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification stages, providing functional validation of genetic targets prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking DNA hybridization efficiency to nanoparticle growth and colorimetric output.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized droplet coalescence and mixing under controlled pneumatic suction.
- Analytics: Enables visual comparison of AuNP aggregation states as a proxy for hybridization fidelity and mismatch tolerance.
- Translational Research: Connects genetic variant detection to phenotypic outcomes in disease-relevant contexts when sequence variation is pathogenically validated.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for nucleic acid screening applicable across multiple target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of polymorphism effects on probe-nanoparticle interactions.
- Operational Value: Standardization and scalability via programmable pneumatic control and minimal reagent consumption.
- Strategic Value: Reduces biological de-risking timelines, enabling faster go/no-go decisions in target prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by confirming genetic drivers of disease before investment in therapeutic development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid hybridization and nanoparticle functionalization.
- Depends on pneumatic control systems, vacuum pumps, and solenoid valves for droplet manipulation.
- Necessitates standardization of PDMS membrane surface properties and air suction parameters across teams.
- Adaptation to other model systems may require optimization of probe concentration and incubation conditions.
- Practical limitations include dependence on visual color interpretation, which may benefit from standardized lighting conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
Detecting Multi-nucleotide Polymorphisms by Hybridization-mediated Growth of Gold Nanoparticles
3:36
Fabrication of the Pneumatic Droplet Manipulation Platform
5:58
Detecting Multi-nucleotide Polymorphisms on the Pneumatic Droplet Manipulation Platform
7:21
Results: Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms
8:24
Conclusion
