设计和使用低成本自动化病态恒定器在抗生素药物选择压力下进行细菌的适应性进化

本实验的总体目标是利用莫里博斯塔特（Morbidostat）来表征抗生素耐药性的进化途径，该装置可持续监测细菌生长，并在细菌获得药物耐药性时动态调整抗生素浓度。该技术的主要优势在于其装置由低成本且易于获取的电子元件构成，且可根据特定需求轻松重新配置。实验操作将由本实验室的研究生刘柏成（Po Cheng Liu）和李奕台（Yi Tai Lee）进行演示。

组装Morbidostat时，首先使用18号针头在培养瓶瓶盖上打三个孔。将三段聚乙烯管（每段长约七厘米）插入瓶盖的孔中。用胶带包裹瓶盖边缘，作为聚二甲基硅氧烷（PDMS）混合物的模具。

然后，在一个150毫升的塑料容器中加入五克PDMS的A组分和0.5克B组分，用牙签手动搅拌。将混合物装入10毫升注射器中。接着，用该注射器将PDMS混合物注入瓶盖上。

将整个盖子在 70 摄氏度下烘烤八小时，以固化 PDMS。接下来，使用电烙铁将 LED 阳极与 24 号导线焊接，并将 LED 阴极与碳膜电阻焊接。然后将一个 680 欧姆的碳膜电阻与另一根 24 号导线焊接。

使用电工胶带绝缘导线连接处。将光电探测器的集电极与24号导线焊接，将光电探测器的发射极与一个100欧姆碳膜电阻焊接。然后使用电工胶带绝缘导线连接处。

将发光二极管放置在培养瓶支架中。根据此处所示的电路图，连接发光二极管，并使用5伏电源供电。通过使用能够检测红外光的数码相机，确认LED正常工作。现在将光电探测器放置在培养瓶支架中。

然后根据示意图连接光电探测器，并使用5 V电源为其供电。将导线连接至光电探测器电阻两侧，以测量电子控制板两端的电压。在散热风扇的转轴上粘贴一块磁铁，作为磁力搅拌装置使用。

由于磁力搅拌装置由磁铁和冷却风扇构成，因此必须将风扇的支架与培养管对齐。同时，培养管与磁铁之间的距离也非常关键，以确保设备稳定运行。将培养管的每一段聚乙烯管分别连接到对应微泵、培养基瓶和废液瓶的硅胶管上。

打开泵并运行一小时，测量从培养基瓶泵入培养管的总体积，以确定泵速。典型的泵送速率应约为每小时四毫升，对应于培养管工作体积为12毫升时的稀释速率D = 0.33每小时。装置组装完成后，将整个装置置于中等尺寸的摇床培养箱中。

为预先测试 Morbidostat，将散热风扇的电源电压设置为 5 伏，以启动电机并测试磁力搅拌子。在按照文本方案制备一系列大肠杆菌样品并绘制校准曲线后，准备培养小瓶，并使用三段长度均为 7 厘米、内径为 1/32 英寸、外径为 3/32 英寸的超耐化学腐蚀 Tygon 软管作为进样口，以组装装置。制备含 0.2% 葡萄糖的 M9 最小培养基，以及含有药物甲氧苄啶（Trimethoprim 或 TMP）的 M9 培养基。

然后在121摄氏度下使用高压灭菌器对培养基、培养基瓶、加药培养基瓶、废液瓶和培养小瓶进行灭菌。实验第一天，在室温下解冻一毫升冷冻的野生型大肠杆菌MG1655细胞五分钟，并将120微升细胞转移至含有约12毫升M9生长培养基的培养小瓶中。打开摇床培养箱，将温度设置为30摄氏度，不进行振荡。

通过启动微型泵、磁力搅拌装置和光密度测量系统来开始莫比多恒化器的操作。大约23小时后，通过关闭微型泵的供电电压使其停止运行，并取出培养管。向培养管中加入15%甘油，并将样品在-80摄氏度下冷冻保存。

在每项实验开始时更换新的培养管也非常重要，以避免生物素的形成。否则，生物素可能在两到三天内形成。将每日冷冻的样品在室温下解冻五分钟，然后接种至含有新鲜M9培养基的新试管中。

将样品置于37摄氏度摇床培养箱中过夜。次日，用M9培养基将微生物样品稀释十倍，并通过在五PSI压力下加压微生物样品容器，将其加载至微流控装置中。随后，在五PSI压力下加压含TMP的M9培养基容器，将含TMP的培养基加载至芯片中。

通过启动微流控芯片上两个腔室之间的微机械阀，使微生物与药物混合反应15分钟。最后将微流控芯片置于倒置显微镜载物台上的显微镜培养箱中，利用CCD相机每小时在生长腔内采集一次细胞图像，持续八小时。

根据文本方案计算细胞数量数据。常见的莫比ostat操作包括实验性进化、抗生素敏感性测试和细胞形态检查，这些操作使用暴露于抗生素TMP的大肠杆菌MG1655培养物进行验证。TMP会诱导药物抗性出现明显的逐步升高，且突变集中在二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）基因周围。每天，微生物预期生长超过预设的光密度阈值，并触发药物注入，如此处所示。

药物注射预计会抑制细菌生长，从而降低光密度。该图显示了在测定IC50的实验中，抗生素耐药性随时间增加的情况。在约12天内，耐药性增加了约1500倍，达到每毫升1,000微克。

与先前的研究结果一致。通过Sanger测序检测了最后一天突变体中的DHFR点突变，结果列于本表中。多种突变导致药物抗性的获得，证明了Morbidostat系统的实用性。

由于在含有药物的琼脂平板上进行筛选通常仅能获得单个突变，本图展示了在不同浓度甲氧苄啶（TMP）条件下芯片上的生长曲线。突变样本表现出显著增强的抗生素耐药性。

该技术开发完成后，为研究人员在真实可控的实验室环境中研究抗生素耐药性问题奠定了基础。在此方法基础上，还可开展其他检测，例如微流控单细胞检测，以回答更多问题，如细菌在暴露于抗生素药物后形态是否仍会发生改变。一旦掌握，该装置可轻松重新配置，用于所有细菌培养实验，例如培养特定细菌或提高细菌菌株的耐药性水平。

观看本视频后，您应能充分理解如何在真实的受控适应性实验室进化实验中研究抗生素耐药性的获得过程。请务必根据微生物实验的生物安全规范来处理耐药细菌。涉及细菌基础培养的实验可能需要获得特殊许可。