采用触摸诱发反应和运动测定以评估在斑马鱼肌肉性能和功能

该程序的总体目标是使用触摸诱发反应和游泳测定来评估斑马鱼的肌肉性能和功能。这种方法可以帮助回答神经肌肉研究领域的问题，例如识别斑马鱼患病模型中受损的肌肉性能或神经退行性缺陷。该技术的主要优点是它提供了一种自动化的高通量方法来评估斑马鱼患病模型中的肌肉性能。

要进行测定，请将装有约 25 毫升胚胎培养基的培养皿放在设置为约 28 摄氏度的照明温控载物台上。将高速摄像机安装在培养皿上方。启动视频录制软件并将捕获速度设置为每秒 1， 000 帧，以确保可以捕获快速的游泳速度。

将胚胎放置在培养皿的中心，在视野中清晰可见。按记录，然后用钝针轻轻触摸头顶的胚胎，从而提供机械感应刺激。一旦胚胎游出视野或返回休息，就停止记录。

在某些患病模型中，重复测试相同的幼虫主要是为了适应或促进肌肉无力，导致对触觉刺激的反应降低，因此，每个胚胎只应测试一次。要量化游泳行为，请启动软件并使用我们的背景减法模块选择单个幼虫的运动以打开 AVI 视频文件。从菜单栏中选择手绘或多边形工具，然后选择电影的区域，该区域同时包含鱼的原始位置和鱼游到的区域，同时不包括用于传递机械感觉刺激的探针。

单击 Menu bar 中的 Experiment 并选择 Execute。在提示符下，将 PHR 格式的原始数据分析文件保存到所需位置。接下来，单击 Start 开始 开始分析。

一旦鱼游出视野或视频剪辑结束，点击实验菜单下的停止结束分析，将出现一个显示结果的窗口。滚动到窗口右侧以获取最大加速度值。通过单击 Results 下拉菜单下的 Export Instantaneous Results 按钮来导出数据。

选择相应的 Raw Data Analysis 文件，然后单击以打开。这会在目标文件夹中保存一个文本文件，该文件可以在电子表格程序中打开。将测试幼虫放入 48 孔板中，每孔 1 孔。

接下来，将井装满水，直到井顶部略低于井的顶部，确保没有气泡。将板在 28 摄氏度下存放 1 小时。将板放入装有红外数码相机的记录室中，该相机可以在黑暗中检测幼虫。

昼夜节律和外部环境刺激可能会显着影响斑马鱼的游泳行为。需要标准化一天中的时间和照明条件，并且需要严格控制水温。启动软件并选择 跟踪模块.

在 File（文件）下，单击 Generate New Protocol（生成新方案）并编辑用于实验的孔数，在本例中为 48。接下来，单击 Parameters 并选择 Protocol Parameters 然后选择 Time 以将实验持续时间和集成周期设置为 10 分钟。此外，在 Protocol Parameters 中，单击 Options 并确保选中 numeroscope 复选框。

要设置录制区域，请突出显示整个网格并双击其中一个井。单击 Draw Areas（绘制区域）按钮，在左上角、右上角和左下角的井周围绘制，然后单击 Build（构建）。然后，软件将确定每个孔的位置。

此时，还要绘制比例尺，然后单击 Apply to Group.完成后，单击 绘制区域 按钮。接下来，选择鱼的颜色（在本例中为黑色），并将 Detection Threshold （检测阈值） 栏滑动到仅突出显示鱼的运动而没有背景的级别。

输入 Movement Thresholds （移动阈值） 以检测不活动和小的、扩大的移动。在此示例中，使用了每秒 6 毫米的非活动阈值和 30 毫米/秒的活动突发阈值。单击参数菜单，然后单击 Light Driving 设置，并将暗室的光强度设置为 0%关闭录制暗室门并开始视频录制。

实验将在 10 分钟内完成，如屏幕上的计时器所示。完成后，单击 实验 下拉菜单，然后选择 停止。将显示一个包含结果的对话框。

要使用 Excel 检查结果，请单击 Open Containing folder 并打开结果文件夹中显示的文件。最后，可以重播视频以查看记录的运动值是否准确描述了鱼的游泳运动。这可以通过将视频文件中观察到的运动与软件生成的运动曲线进行比较来实现。

在触摸诱发电断试验期间拍摄的斑马鱼胚胎快照图像显示了个体在施加刺激后的前 0.2 秒内的典型运动。在这里，该图显示了野生型个体与肌病个体爆发性游泳逃逸反应前 0.2 秒的加速度曲线。在此时间窗口内，两种应变的加速度都达到峰值，峰值最大加速度与骨骼肌的发力能力成正比。

对野生型和肌病菌株的最大加速度值进行平均。肌病鱼的最大加速度显着降低，表明肌肉功能下降。胚胎的 10 分钟运动测定记录了野生型和肌病性胚胎的运动模式和类型，并生成了游泳运动的图解表示。

绘制了由绿线表示的缓慢移动周期和由红线表示的快速移动周期，以及由黑线表示的不活跃周期。野生型个体表现出高活动水平，相对没有不活跃期，而肌病个体在测试期间不太活跃。这反映在野生型鱼与肌病性鱼的平均运动次数和移动距离的显着差异上。

一旦掌握，可以在 15 分钟内对 15 条鱼进行触摸诱发反应测定，在大约 10 分钟内对多达 48 条鱼进行运动测定。在尝试此过程时，小心处理胚胎很重要，因为这可能会影响它们的活动。在此程序之后，可以执行其他技术，例如免疫标记或电子显微镜检查，以回答与肌肉病理学相关的其他问题。

看完这个视频，你应该对如何测量斑马鱼早期发育中的肌肉表现有一个很好的了解。