小动物模型尿路感染的实验研究: 男性和女性的经尿道插管

这种实验方法的总体目标是研究对尿路感染的免疫反应，并防止雄性和雌性动物之间的直接比较。这种方法可以帮助回答粘膜免疫学中与男性和女性如何应对尿路感染有关的关键问题。主要优点是感染是通过天然根建立的。

在注意到经常有人说雄性小鼠的膀胱是不可能的之后，我们首先想到了这种方法。虽然这种方法将提供对尿路感染的见解，但它也可以应用于其他疾病研究，例如膀胱癌。首先，为每组要感染的小鼠准备一个儿科静脉通路插管。

使用内置的弹簧机构，按照制造商的指示剥离其针的每个套管。丢弃针头，仅保留塑料静脉插管。在层流罩中对导管进行消毒，进行一个大约 25 至 30 分钟的紫外线循环。

在尿路致病性大肠杆菌或 UPEC 过夜培养后，根据文本方案，在台式微量离心机中以 17， 000 次 g 的速度旋转细菌悬浮液 1 分钟，并在 PBS 中以 2 次 10 倍重悬至每毫升八分之一 CFU。连续稀释等分试样的悬浮液，并在适当的情况下用抗生素接种在 LB 琼脂上，以确定每种感染的确切接种物。将细菌接种物吸入 1 毫升注射器中，并将导管连接到注射器的末端。

轻敲注射器以去除任何空气，然后按下柱塞以填充导管中的死气空间，然后再开始滴注。根据批准的方案麻醉雌性小鼠后，将动物仰卧，并对下腹部施加中等压力以排空膀胱中的尿液。充盈的膀胱在髂嵴之间的皮肤下感觉像豌豆。

当膀胱排空时，用非惯用手将拇指放在鼠标尾巴上，将同一只手的手指放在鼠标的腹部，并向相反的方向轻轻按压，将鼠标牢牢固定在原位。接下来，将导管尖端垂直于小鼠放在尿道口，然后轻轻按压，将导管滑入尿道，直到集线器与尿道口相遇，同时降低注射器，使其平行于工作表面。导管就位后，用放在小鼠腹部的非惯用手的手指非常轻柔地将腹部皮肤拉向小鼠头部。

请注意，尿道口不会移动。但是，如果导管位于阴道中，组织会向上移动并远离导管。将导管的枢纽靠在尿道口上，缓慢分配 15 微升细菌接种物。

缓慢的安装速率可最大限度地减少膀胱输尿管反流到肾脏。慢慢取出导管以防止渗漏。然后将动物以仰卧姿势放在笼子里。

要接种雄性小鼠，请将两个拇指镊子放在小鼠外生殖器的颅侧和尾部。缩回包皮以完全暴露腺体的阴茎。然后，一旦阴茎位于外部位置，松开拇指镊子。

重新定位镊子以稳定垂直于动物的突出阴茎，轻轻但紧紧地握住器官。然后通过尿道口尖端的小开口，小心地引入导管，并使用镊子轻轻将其引导到阴茎中，以轻轻保持张力。一旦导管的枢纽接触到阴茎尖端，非常缓慢地分配 50 微升接种物，同时保持阴茎的位置。

根据预先确定的滴注质量分数记下滴注的质量，如此处所示。在 5 秒内缓慢缩回导管，以防止接种物泄漏。将鼠标仰卧放在笼子里。

动物应在麻醉剂后 30 至 45 分钟开始恢复。根据批准的方案处死小鼠后，使用 70% Epinal 彻底润湿腹部，以尽量减少皮毛的污染。使用剪刀在小鼠腹部的下三分之一处切开一个 2 厘米的切口，并在无菌条件下去除膀胱和任何其他所需的器官。

将器官转移到 5 毫升聚丙烯卡口管中，其中含有 1 毫升无菌 PBS，并将所有样品置于冰上。使用手持式匀浆器，对器官进行匀浆，直到几乎没有实体组织残留。丢弃任何不能很好地匀浆的有光泽的米白色脂肪组织。

然后，使用 Epinal，然后使用 PBS 在每个实验组或器官组之间洗涤匀浆器。在制备匀浆器官悬液的连续稀释液后，在 LB 琼脂平板上进行平板稀释，适当时使用抗生素，并在 37 摄氏度下孵育过夜。要对膀胱组织进行流式细胞术，如本视频前面所示，在分离膀胱后，使用剪刀将组织切碎。

每管含有消化缓冲液，加入一个切碎的膀胱。然后摇动试管，在消化缓冲液中洗涤切碎的组织，并将其放在冰上，直到所有膀胱都被解剖和切碎。将切碎的膀胱在 37 摄氏度下孵育 60 到 75 分钟，同时用手剧烈摇晃 5 秒，每 15 分钟一次。

当组织具有类似于湿薄纸的玻璃状透明外观时，消化完成。通过添加 2 至 3 mL 冰冷的流式细胞术缓冲液灭活消化酶，然后轻轻混合。然后将试管放在冰上。

为确保单细胞悬液并去除任何结缔组织，请将试管中的内容物通过放置在 15 毫升锥形管中的 100 微米过滤器。然后，用注射器柱塞的末端，轻轻地将任何剩余的组织压入过滤器。用另外 2 毫升流式细胞术缓冲液清洗过滤器，并将样品保存在冰上。

通过在 200 倍 g 和 4 摄氏度下离心 7 分钟来清洗样品。将沉淀重悬于 100 微升含有 Fc 块的流式细胞术缓冲液中，稀释至每毫升 5 微克，然后转移到 96 孔圆底板中。10 至 15 分钟后，向每个样品中加入 100 μL 所需的抗体混合物。

然后将样品在避光的冰上孵育 30 至 45 分钟。在 200 倍 g 和 4 摄氏度下离心 7 分钟，洗涤样品。最后，将细胞沉淀重悬于 200 μL 流式细胞术缓冲液中，并在流式细胞仪上采集之前，将样品通过 5 mL 聚苯乙烯管上的 40 μm 细胞过滤器。

该图显示了感染 24 小时的小鼠的代表性数据。感染后 24 小时，雄性和雌性小鼠的细菌负荷相当。为了确定感染时接种物的损失是否会影响感染的建立，每次滴注都按 1 到 5 的等级评分，其中 1 是最佳的。

感染后 24 小时确定细菌定植。通过非参数 Kruskal-Wallis 检验评估，将每列的平均秩与每其他列的平均秩进行比较，并使用 Dunn 检验校正多重比较，从具有不同滴注评分的动物获得的 CFU 之间未发现统计学显着差异。可以得出结论，次优滴注导致感染期间细菌接种物大量泄漏，不会显着影响 24 小时细菌定植。

重要的是，次优滴注的频率会随着练习而减少。最后，虽然雌性和雄性小鼠中存在的幼稚动物中存在的 CD45 阳性免疫细胞的数量没有差异，但感染的雌性小鼠膀胱的浸润量在统计学上显着增加。尝试导尿时，使用缓慢、轻柔的动作很重要。

随着它的发展，这项技术帮助我们探索了雄性和雌性动物膀胱中基于性别的免疫差异。