Name: 小动物模型尿路感染的实验研究: 男性和女性的经尿道插管 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学习小鼠经尿道插管技术建立尿路感染模型，用于比较雄性与雌性免疫应答差异。该方法通过自然途径感染，可应用于膀胱癌等疾病研究，为泌尿病理学提供新工具。

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感谢 Matthieu Rousseau 博士对本文稿的审阅，以及树突状细胞免疫生物学实验室在本方案和项目开发过程中提供的有益见解。本工作部分得到了欧盟第七框架计划玛丽·居里行动项目（PCIG11-GA-2012-3221170）和免疫肿瘤学实验室卓越计划（MAI）的资金支持。

小鼠实验根据动物实验伦理委员会（Comité d'éthique en expérimentation animale Paris Centre et Sud）批准的第2012-0024号实验方案进行，符合欧盟2010/63号指令的要求。
1. 导管的制备
<ol>
	<li>为每组待感染的小鼠准备一个儿科静脉穿刺导管。按照制造商说明，利用内置弹簧装置将每个导管的针头卸下。丢弃针头，仅保留塑料静脉导管部分。</li>
	<li>在超净工作台中对导管进行紫外线（U.V.）照射灭菌，通常持续 25 - 30 分钟。 
	注意：导管可重复用于多只小鼠，但在不同实验组、不同性别或不同细菌菌株之间应使用新的导管。</li>
</ol>
2. 用于感染的尿路致病性 E. coli 的制备
<ol>
	<li>感染前至少两天，使用无菌接种环从冻存的细菌菌种中挑取尿路致病性大肠杆菌（UPEC），划线接种于含有适当抗生素的Luria肉汤（LB）琼脂平板上。在37 °C下培养过夜。平板可在4 °C下保存最多一周。</li>
	<li>在100 ml无菌锥形瓶中，用LB平板上的单个菌落接种10 ml含适当抗生素的LB液体培养基，并于37 °C静置培养过夜（约16–18小时）。 
	注意：静置培养有利于表达I型菌毛，而I型菌毛是感染所必需的23。振荡培养的菌液中菌毛表达效率较低，从而导致感染率不稳定。</li>
	<li>测定过夜培养物在600 nm处的光密度（OD）600，并利用预先确定的生长曲线计算每毫升中的细菌数量。例如，对于UPEC菌株UTI89，OD600 = 0.35相当于每毫升2 × 108 CFU，因此，OD600 = 2.4的过夜培养物相当于每毫升13.7 × 108 CFU。每次使用新的感染菌株时，均应通过实验确定OD600与活菌数之间的关系。</li>
	<li>根据拟感染动物数量确定所需细菌量，每只小鼠需在50 μl PBS中接种约107菌落形成单位（CFU）。计算时应包括导管和注射器乳头部分约130 µl的死体积，以及用于测定接种量的100 µl额外体积。
	<ol>
		<li>将细菌悬液在台式微量离心机中以17,000 × g离心1分钟，弃上清后将菌体沉淀重悬于PBS中，调整浓度至每毫升含2 × 108 CFU。取部分悬液进行系列稀释，涂布于含适当抗生素的LB琼脂平板，以确定每次感染的准确接种量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细菌接种液吸入1 ml注射器中，并将导管连接至注射器末端。轻弹注射器以排除气泡，推动活塞以填充导管内的死腔空间，然后开始灌注操作。</li>
</ol>
3. 小鼠的准备
<ol>
	<li>麻醉小鼠 通过 腹腔注射 100 mg/kg 氯胺酮和 5 mg/kg 赛拉嗪。可提供辅助加热。&#160;</li>
	<li>通过中等力度捏压小鼠足垫，确保每只小鼠完全镇静。当小鼠无反应时，表明其已完全镇静，达到该状态通常需要 3 - 5 分钟。</li>
	<li>将小鼠仰卧放置，对下腹部施加中等压力以排空膀胱中的尿液。充盈的膀胱在髂嵴之间的皮下触感类似于一颗豌豆。 
	注意：已使用吸入式异氟烷对雌性小鼠进行插管15,22然而，尚未验证吸入异氟烷是否能使雄性小鼠在此操作中达到充分的麻醉效果。</li>
</ol>
4. 雌性小鼠的经尿道灌注
<ol>
	<li>用非优势手将拇指放在小鼠尾部，同一只手的一根手指放在小鼠腹部，向相反方向施加轻柔压力，以牢固固定小鼠。</li>
	<li>将导管尖端垂直于小鼠尿道口放置。施加轻柔压力，将导管滑入尿道，直至导管接头处到达尿道口，同时缓慢降低注射器，使其与操作台面平行。导管无需润滑。切勿推挤或强行插入导管。导管应能顺畅、轻松地滑入尿道，几乎无阻力。
	<ol>
		<li>在注入接种物（步骤4.3）之前，一旦导管就位，用非优势手上已置于小鼠腹部的手指，非常轻柔地将腹部皮肤向小鼠头部方向牵拉。如果导管位于尿道内，构成尿道口的组织不会移动；而如果导管误插入阴道，则该组织会随牵拉向上并远离导管。此快速检测应在每只小鼠上进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当导管接头处到达尿道口时，缓慢注入50 µl细菌接种液。缓慢注入可最大程度减少膀胱输尿管反流至肾脏。在数5下时间内缓慢撤出导管，以防泄漏。将小鼠以仰卧位放回笼中。</li>
</ol>
5. 雄性小鼠的经尿道灌注
<ol>
	<li>用两把镊子分别夹住小鼠外生殖器的头侧和尾侧。向后退缩包皮，充分暴露阴茎头。当阴茎完全外露后，松开镊子。</li>
	<li>重新放置镊子，将突出的阴茎固定成与动物体垂直的方向，轻柔但稳固地夹持阴茎。观察尿道外口，小心地将导管插入阴茎顶端的小开口中。轻柔地将导管沿阴茎向小鼠体内方向推进，同时用镊子保持轻微张力。导管无需润滑。切勿强行插入导管；导管应能顺畅滑入尿道，此为正确插入的标志。</li>
	<li>当导管接头处到达阴茎尖端时，缓慢注入50 µl接种液，同时保持阴茎位置稳定。此时可根据预先设定的灌注质量评分标准（如图2所示）评估灌注质量。</li>
	<li>缓慢撤出导管，用约5秒时间完成，以防止接种液泄漏。将小鼠仰卧放置于笼中。动物通常在麻醉给药后30–45分钟开始恢复。</li>
</ol>
6. 感染器官中菌落形成单位（CFU）的测定
<ol>
	<li>在预定的时间点，按照批准的标准操作程序（例如，颈椎脱位或二氧化碳过量）处死小鼠。用70%乙醇充分润湿腹部，以减少毛发污染。</li>
	<li>使用剪刀在小鼠腹部下三分之一处做一切口，长度至少2 cm，并无菌取出膀胱及其它所需器官（包括但不限于肾脏、睾丸、精囊、包皮腺），放入含有1 mL无菌PBS的5 mL聚丙烯 snap-cap 管中。所有样本均需保持在冰上。</li>
	<li>使用手持式匀浆器对器官进行匀浆，直至几乎无固体组织残留，时间约为15–60秒，具体时长取决于器官类型。脂肪组织不易匀浆，通常呈现有光泽的浅黄白色，易于识别。在匀浆前或匀浆后应将其弃去。每次处理不同实验组或器官组之间，需先用乙醇清洗匀浆器，再用PBS冲洗。 
	注意：通常使用手持式匀浆器或珠磨式匀浆器。尽管通过感染后24小时细菌CFU的直接比较表明，这些系统均可获得相似结果，但在常规开展本方案前，应通过实验确定在保持细菌活性的前提下匀浆宿主组织的最佳条件。</li>
	<li>对匀浆后的器官悬液进行系列稀释。将稀释液接种至LB琼脂平板（如需要可含抗生素），于37 °C培养过夜（约15小时）。尿路致病性大肠杆菌（UPEC）菌株倍增速度极快，因此需注意避免培养时间过长，以免影响单个菌落的计数。</li>
</ol>
7. 膀胱组织的流式细胞术分析
<ol>
	<li>在 PBS 中配制含有 34 单位/mL 胶原酶和 100 µg/mL DNase 的消化缓冲液，置于冰上。为每只待分析的小鼠准备一个 15 ml 锥形管，并向每管中分装 1 ml 消化缓冲液。</li>
	<li>在预定时间点，按照批准的标准操作程序（例如，颈椎脱位或过量二氧化碳）处死小鼠。用 70% 乙醇充分润湿腹部，以最大限度减少毛发污染。</li>
	<li>使用剪刀在小鼠腹部下三分之一区域做至少 2 cm 的切口，并完整取出膀胱。用剪刀充分剪碎膀胱组织，将其切成 2 - 3 mm2 大小的碎片，通常约为 8 块。
	<ol>
		<li>将每份剪碎的膀胱组织加入含有消化缓冲液的管中。轻轻振荡，使组织沉入消化缓冲液中。所有膀胱组织解剖和剪碎完成前，保持样品置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将剪碎的膀胱组织在 37 °C 下孵育 60 - 75 分钟，每隔 15 分钟手动剧烈振荡 5 秒。当组织呈现透明玻璃样、类似湿滤纸的外观时，表明消化完成。过度消化会去除细胞表面用于鉴定的关键蛋白，应避免。</li>
	<li>通过加入 2 - 3 mL 冰冷的流式细胞术缓冲液（含 2% 胎牛血清（FBS）和 0.2 mM EDTA 的 PBS）来灭活消化酶，并轻轻混匀。将试管置于冰上。</li>
	<li>为确保获得单细胞悬液并去除任何结缔组织，将管内液体通过置于 15 mL 锥形管上的 100 µm 滤膜过滤。用注射器活塞末端轻轻压挤残留组织通过滤膜。再用额外 2 mL 流式细胞术缓冲液冲洗滤膜。样品始终保持在冰上。</li>
	<li>在 200 × g、4 °C 条件下离心洗涤样品 7 分钟。将沉淀重悬于 100 µL 含 Fc 封闭剂（稀释至 5 µg/mL）的流式细胞术缓冲液中，并转移至 96 孔圆底板。10 - 15 分钟后，向每个样品中加入 100 µL 所需的抗体混合液。将样品在冰上避光孵育 30 - 45 分钟。 
	注：Fc 封闭剂是一种用于防止抗体 Fc 段与表达 Fc 受体的细胞结合的试剂，其目的是减少非特异性抗体结合。所用抗体的选择取决于实验中检验的假设，应参考文献并结合研究目的进行选择。在 图 3 中，为检测整体免疫细胞浸润情况，使用了抗 CD45 抗体，该抗体识别一种泛免疫细胞蛋白。</li>
	<li>在 200 × g、4 °C 条件下离心洗涤样品 7 分钟。将细胞沉淀重悬于 200 µL 流式细胞术缓冲液中，并在上机前通过置于 5 ml 聚苯乙烯管上的 40 µm 细胞筛网过滤。</li>
	<li>在流式细胞仪上采集全部样品。良好的消化通常可从正常小鼠膀胱中获得 200,000 - 400,000 个细胞，其中包含 8,000 - 10,000 个 CD45+ 免疫细胞，而感染器官中的细胞数量更多16（图 3）。 
	注：用于流式细胞术分析的样品不能用于评估菌落形成单位（CFU）。不建议将膀胱一分为二进行处理，因为目前尚无证据表明尿路致病性大肠杆菌（UPEC）定植或免疫细胞浸润在组织内分布均匀。</li>
</ol>

<ol><li>Hooton, T. M., Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+uncomplicated+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Dis+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection.</a> Infect Dis Clin North Am. 11 (3), 551-581 (1997).</li>
<li>Harper, M., Fowlis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+urinary+tract+infections+in+men%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Urology%2C+Gynaecology+%26+Sexual+Health%22%5BJournal%5D)">Management of urinary tract infections in men.</a> Trends in Urology, Gynaecology & Sexual Health. 12 (1), 30-35 (2007).</li>
<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Urol%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nat Rev Urol. 7 (12), 653-660 (2010).</li>
<li>Lipsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+tract+infections+in+men.+Epidemiology%2C+pathophysiology%2C+diagnosis%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Urinary tract infections in men. Epidemiology, pathophysiology, diagnosis, and treatment.</a> Ann Intern Med. 110 (2), 138-150 (1989).</li>
<li>Conway, L. J., Carter, E. J., Larson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+Factors+for+Nosocomial+Bacteremia+Secondary+to+Urinary+Catheter-Associated+Bacteriuria%3A+A+Systematic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Urol+Nurs%22%5BJournal%5D)">Risk Factors for Nosocomial Bacteremia Secondary to Urinary Catheter-Associated Bacteriuria: A Systematic Review.</a> Urol Nurs. 35 (4), 191-203 (2015).</li>
<li>Markle, J. G., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeXX+matters+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">SeXX matters in immunity.</a> Trends Immunol. 35 (3), 97-104 (2014).</li>
<li>Yu, C. Y., Whitacre, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex%2C+MHC+and+complement+C4+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sex, MHC and complement C4 in autoimmune diseases.</a> Trends Immunol. 25 (12), 694-699 (2004).</li>
<li>Castelao, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender-+and+smoking-related+bladder+cancer+risk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Gender- and smoking-related bladder cancer risk.</a> J Natl Cancer Inst. 93 (7), 538-545 (2001).</li>
<li>Donsky, H., Coyle, S., Scosyrev, E., Messing, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+incidence+and+mortality+of+bladder+and+kidney+cancers%3A+national+estimates+from+49+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Urol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Sex differences in incidence and mortality of bladder and kidney cancers: national estimates from 49 countries.</a> Urol Oncol. 32 (1), 40-e31 (2014).</li>
<li>Garg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+Disparities+in+Hematuria+Evaluation+and+Bladder+Cancer+Diagnosis%3A+A+Population-Based+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Gender Disparities in Hematuria Evaluation and Bladder Cancer Diagnosis: A Population-Based Analysis.</a> J Urol. , (2014).</li>
<li>Dobruch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+and+Bladder+Cancer%3A+A+Collaborative+Review+of+Etiology%2C+Biology%2C+and+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">Gender and Bladder Cancer: A Collaborative Review of Etiology, Biology, and Outcomes.</a> Eur Urol. , (2015).</li>
<li>Hsu, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+tumorigenesis+and+mortality+from+bladder+cancer+in+mice+lacking+urothelial+androgen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Decreased tumorigenesis and mortality from bladder cancer in mice lacking urothelial androgen receptor.</a> Am J Pathol. 182 (5), 1811-1820 (2013).</li>
<li>El Behi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+decorin+in+bladder+cancer+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">An essential role for decorin in bladder cancer invasiveness.</a> EMBO Mol Med. 5 (12), 1835-1851 (2013).</li>
<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+urinary+tract+infections%3A+incidence%2C+morbidity%2C+and+economic+costs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs.</a> Am J Med. 113, Suppl 1A. 05S-13S (2002).</li>
<li>Ingersoll, M. A., Kline, K. A., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-CSF+induction+early+in+uropathogenic+Escherichia+coli+infection+of+the+urinary+tract+modulates+host+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">G-CSF induction early in uropathogenic Escherichia coli infection of the urinary tract modulates host immunity.</a> Cell Microbiol. 10 (12), 2568-2578 (2008).</li>
<li>Mora-Bau, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+Subvert+Adaptive+Immunity+to+Urinary+Tract+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Macrophages Subvert Adaptive Immunity to Urinary Tract Infection.</a> PLoS Pathog. 11 (7), e1005044(2015).</li>
<li>Oliveira, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Report%3A+Technique+of+Bladder+Catheterization+in+Female+Mice+and+Rats+for+Intravesical+Instillation+in+Models+of+Bladder+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22%28Conference+Title%2939th+Scand-LAS+and+ICLAS+Joint+Meeting%22%5BJournal%5D)">Technical Report: Technique of Bladder Catheterization in Female Mice and Rats for Intravesical Instillation in Models of Bladder Cancer.</a> (Conference Title)39th Scand-LAS and ICLAS Joint Meeting. 36, 5-9 (2009).</li>
<li>Seager, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravesical+delivery+of+rapamycin+suppresses+tumorigenesis+in+a+mouse+model+of+progressive+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Prev+Res+%28Phila%29%22%5BJournal%5D)">Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer.</a> Cancer Prev Res (Phila). 2 (12), 1008-1014 (2009).</li>
<li>Hagberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascending%2C+unobstructed+urinary+tract+infection+in+mice+caused+by+pyelonephritogenic+Escherichia+coli+of+human+origin%29%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin).</a> Infect Immun. 40 (1), 273-283 (1983).</li>
<li>Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgens+Enhance+Male+Urinary+Tract+Infection+Severity+in+a+New+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model.</a> J Am Soc Nephrol. , (2015).</li>
<li>Knipper, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-4+Receptor+alpha+Signaling+in+Myeloid+Cells+Controls+Collagen+Fibril+Assembly+in+Skin+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-4 Receptor alpha Signaling in Myeloid Cells Controls Collagen Fibril Assembly in Skin Repair.</a> Immunity. 43 (4), 803-816 (2015).</li>
<li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1230-1243 (2009).</li>
<li>Wright, K. J., Seed, P. C., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intracellular+bacterial+communities+of+uropathogenic+Escherichia+coli+depends+on+type+1+pili%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of intracellular bacterial communities of uropathogenic Escherichia coli depends on type 1 pili.</a> Cell Microbiol. 9 (9), 2230-2241 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

雄性小鼠经尿道灌注为研究性别对膀胱黏膜疾病的影响提供了许多新的研究机会，但也存在若干挑战。首要的局限在于，该操作最初可能在技术上较为困难，导致导管插入时引发过度炎症反应。可通过使用染色溶液（如伊文思蓝染料）对死亡小鼠进行灌注练习，以提高操作技术。为确认灌注是否成功，应肉眼检查膀胱，并可通过结核菌素注射器抽取液体以评估灌注体积。缓慢、轻柔操作的重要性再怎么强调也不为过：插入导管时不应有任何阻力，也切勿施加外力，否则将导致过度炎症和组织损伤。若操作正确，导管应能无阻力地顺利滑入尿道。若感到阻力或阻塞，最佳做法是退出导管并重新尝试插入。
通过将灌注质量与感染后24小时的细菌负荷相关联，我们证明了即使在感染时损失少量细菌接种物的不完美操作技术，仍可导致膀胱中出现显著的细菌定植。在使用本方案时，研究者应力求实现无泄漏的灌注。然而，该实验方法的稳健性确保了即使灌注操作不够完美，仍可获得有用的数据和可解释的结果。
与目前唯一已发表的雄性膀胱感染替代方法相比，我们的技术具有显著优势，即采用非侵入性、非手术的方式。我们通过经尿道灌注的方法，遵循...

尿路感染（UTI）是发达国家最常见的感染性疾病之一1。在新生儿和老年人群中，女性与男性的感染率相似2。然而，育龄期成年女性社区获得性尿路感染的发病率远高于男性2,3。鉴于该疾病主要影响女性，基础与临床研究长期以来主要集中于女性尿路感染。然而，男性尿路感染是一个重要但研究不足的医疗挑战4。事实上，由于男性尿路感染常伴随更高的发病率，此类感染通常被定义为复杂性感染4,5。
随着人们对性別差异在生理学和病理学中核心作用的认识不断深入，探索这一长期被忽视的疾病特征需要新的方法。性別差异在免疫和感染中起着至关重要的作用；女性自身免疫性疾病的发病率更高，而男性则更容易感染某些传染病，例如结核病、疟疾和艾滋病病毒6,7。膀胱癌是另一种泌尿系统疾病，其在男性中的发病率显著高于女性，多项研究已表明雄激素在恶性肿瘤发生中具有重要作用8,9,10,11,12。然而值得注意的是，由于无法对雄性小鼠进行反复导尿，目前膀胱癌的膀胱内治疗研究仅在雌性动物中开展13。
尿路感染发病机制的研究在很大程度上依赖于啮齿类动物感染模型（例如，小鼠和大鼠）。尿路感染的啮齿类动物模型可采用最初从人类感染中分离的尿路致病菌，例如尿路致病性 E. coli （尿路致病性大肠杆菌，UPEC）， 克雷伯菌, 肠球菌, 金黄色葡萄球菌，或 变形杆菌属14通常，细菌会被引入膀胱 通过 尿道插管。感染后，可取出膀胱和肾脏以评估感染的特定参数，如细菌定植、组织损伤或宿主免疫反应15,16然而，普遍而言，尿路感染研究仅使用雌性动物。事实上，许多研究指出，由于解剖学原因，雄性小鼠无法进行导尿管插入13,17,18,19最近描述了一种用于雄性动物灌注的外科手术方法，即打开腹部，通过轻柔按压腹腔开口处将膀胱外置，并向膀胱内注射细菌。20该方法能够实现雄性感染，但需要进行外科手术干预。因此，该方法的主要局限性在于炎症的影响，例如切口可能诱发抗炎性伤口愈合反应，从而影响感染的结果。21由于我们的研究兴趣包括探讨疾病反应中的性别差异，我们建立了一种雄性小鼠膀胱内细菌灌注方法，该方法更接近于长期以来用于雌性啮齿类动物的非手术经尿道灌注技术。22.
我们的模型基于一种已确立的方法学，能够直接比较雌性和雄性动物在尿路感染（UTI）中的宿主免疫反应。该方法将有助于解析感染过程中基于性别的差异，并可能为两性在感染易感性和反应性方面显著差异提供分子和细胞层面的线索。此外，该模型的价值不仅限于尿路感染研究，还可用于建立其他膀胱相关疾病的研究模型，例如膀胱癌、前列腺炎、膀胱活动低下或过度活跃综合征以及间质性膀胱炎。

<table><tbody><tr><td>BD Insyte Autoguard 防护型静脉导管 24 G，外径 0.7 mm，长 14 mM</td><td>BD Medical</td><td>381811 或 381411*</td><td>* 目录编号因国家而异</td></tr><tr><td>接种环</td><td>Greiner Bio-One</td><td>731171</td><td></td></tr><tr><td>LB Miller 肉汤</td><td>Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>LB Miller 琼脂</td><td>Difco</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>比色皿</td><td>Bio-rad</td><td>223-9955</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>B Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>持针钳（Adson）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 聚丙烯离心管</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Ruptor 一次性探头</td><td>Qiagen</td><td>990890</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 旋盖离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>362694</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401119001</td><td>应分装后于 -20 &amp;deg;C 保存，避免反复冻融</td></tr><tr><td>100 &amp;micro;M MACS SmartStrainers&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-098-463</td><td>适用于 15 ml 离心管，优先选用</td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m 细胞筛网&amp;nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td>适用于 50 ml 离心管，若无 MACS Smart Strainers 可替代使用</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Fc 封闭抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td>抗 CD16/CD32</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>561487</td><td>提供多种不同荧光标记选项</td></tr><tr><td>带滤芯盖的 5 ml 聚苯乙烯离心管</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>Terumo</td><td>BS05M2913</td><td></td></tr><tr><td>手持式匀浆器</td><td>Qiagen</td><td>9001272</td><td>TissueRuptor</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Fortessa SORP&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>流式细胞术分析软件</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Diva</td></tr></tbody></table>

小型动物模型中的尿路感染：雄性和雌性小鼠的经尿道导管插入术

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

尿路感染（UTI）在全球范围内极为常见，导致显著的发病率以及与医疗保健相关的高额费用。能够准确反映疾病发生和进展过程的小型动物模型，有助于解析宿主与病原体之间的相互作用，并研究感染过程中免疫反应的产生。在小鼠中，通过膀胱内灌注尿路致病性E. coli（占社区获得性尿路感染病因的85%以上）可重现人类感染过程中的多个阶段。然而直到最近，尿路感染模型仅能在雌性动物中建立。这一限制阻碍了对尿路感染及其他膀胱疾病（如膀胱癌）中性别相关差异的研究。本文介绍了一种对雄性小鼠进行膀胱灌注的方法，从而实现雌性和雄性动物之间的直接比较；同时提供了一套详细的流式细胞术检测膀胱组织的实验方案，以更深入地理解宿主对感染的免疫应答。上述方法将有助于识别导致尿路感染及其他膀胱相关疾病中性别差异的宿主因素。

在本实验方案的开发过程中，对6至8周龄的雌性和雄性C57Bl/6小鼠进行了接种，并在感染后1小时至30天的不同时间点评估了膀胱中的细菌负荷。这些研究的结果已在其他文献中详细描述（Zychlinsky Scharff et al.，待发表）。本文展示了感染24小时后的代表性数据。值得注意的是，在感染后24小时，雄性和雌性小鼠之间的细菌负荷相当（图1）。感染后24小时，每组内部的细菌负荷变异较小，这与此前在雌性小鼠中报道的结果相似15,16。
如果在感染前注意充分排空小鼠膀胱中的尿液，则雌性小鼠中接种物明显泄漏的情况很少见。然而，在本方案的建立阶段，雄性小鼠的接种常导致大量细菌接种物从尿道泄漏。为了确定感染时接种物的丢失是否会影响细菌定植或感染的建立，我们为每次接种操作引入了评分系统。每次...

已建立的小鼠经尿道插管模型可用于研究膀胱病理状态，包括尿路感染，但该模型仅适用于雌性小鼠。本文介绍一种新的雄性小鼠经尿道灌注模型，将有助于推动在临床上和流行病学上存在显著性别差异的领域的研究。

尿路感染（UTI）在全球范围内极为常见，导致显著的发病率和与医疗保健相关的费用。小型动物模型，……

本实验方法的总体目标是研究机体对尿路感染的免疫反应，并避免直接比较雄性和雌性动物之间的差异。该方法有助于解答与雄性和雌性个体如何应对尿路感染相关的黏膜免疫学关键问题。其主要优势在于，感染是通过自然途径建立的。我们最初产生这一方法的想法，是源于注意到人们经常声称无法对雄性小鼠进行膀胱插管。尽管该方法主要用于研究尿路感染，但也可应用于其他疾病的研究，例如膀胱癌。实验开始时，为每组待感染的小鼠准备一根小儿静脉留置针。按照制造商的说明，利用内置的弹簧机制将每根套管针的针头卸下。丢弃针头，仅保留塑料静脉套管。在超净工作台中对导管进行消毒，使用紫外灯照射一个循环，时间约为25至30分钟。根据实验方案，在尿路致病性大肠杆菌（UPEC）过夜培养后，将细菌悬液在台式微量离心机中以17,000 × g离心1分钟，然后将所得菌体沉淀重悬于PBS中，浓度为每毫升2 × 10⁸ CFU。取部分悬液进行系列稀释，并在LB琼脂平板上涂布，如需要可加入抗生素，以确定每次感染的准确接种量。将细菌接种液吸入1毫升注射器中，并将导管连接至注射器末端。轻弹注射器以排出其中的空气，并推动活塞，以填充导管内的死腔，再开始灌注。按照批准的方案对雌性小鼠实施麻醉后，将动物置于仰卧位，并对下腹部施加中等压力，以排空膀胱中的尿液。充盈的膀胱在皮肤下触感类似豌豆，位于髂嵴之间。当膀胱排空时，用非优势手将拇指放在小鼠尾部，同一只手的一根手指放在小鼠腹部，向相反方向施加轻柔压力，以牢固固定小鼠。接着，将导管尖端垂直于小鼠尿道口放置，然后在轻柔压力下将导管滑入尿道，直至导管接头处与尿道口齐平，同时降低注射器使其与工作台面平行。导管就位后，用非优势手上放在小鼠腹部的手指非常轻柔地将腹部皮肤向小鼠头部方向牵拉。请注意，尿道口不会移动。然而，如果导管进入阴道，组织会向上并远离导管移动。将导管接头紧贴尿道口，缓慢注入15 µL的细菌接种液。缓慢的安装速度可最大限度减少尿液反流至肾脏。缓慢拔出导管以防止泄漏。然后将动物仰卧放置于笼中。为了对雄性小鼠进行接种，用两把镊子分别夹住小鼠外生殖器的头侧和尾侧。向后牵拉包皮，充分暴露阴茎龟头。然后，当阴茎处于外置位置时，松开镊子。重新放置镊子，使外露的阴茎与动物身体垂直并保持稳定，轻柔但稳固地夹持该器官。然后通过尿道口尖端的小开口，小心地将导管插入，并用镊子轻柔地施加张力，引导导管进入阴茎。当导管接头到达阴茎尖端时，在保持阴茎位置不变的情况下，极其缓慢地注入 50 µL 接种物。根据预先设定的滴注质量评分（如此处所示）记录滴注质量。在五秒内缓慢撤出导管，以防止接种物泄漏。将小鼠以仰卧位放入笼中。动物应在麻醉给药后30至45分钟开始恢复。根据批准的方案处死小鼠后，使用70% Epinal充分湿润腹部，以尽量减少毛发污染。使用剪刀在小鼠腹部下三分之一区域做一约两厘米的切口，并无菌取出膀胱及任何其他所需器官。将器官转移至含有1毫升无菌PBS的5毫升聚丙烯旋盖管中，并将所有样品置于冰上。使用手持式匀浆器匀浆器官组织，直至几乎无固体组织残留。丢弃任何难以匀浆的闪亮的浅黄白色脂肪组织。然后，在每组实验或器官组之间，使用 Epinal 和 PBS 清洗匀浆器。制备匀浆后器官悬液的系列稀释液后，将稀释液接种于 LB 琼脂平板上，必要时加入抗生素，并在 37 摄氏度下孵育过夜。为了对膀胱组织进行流式细胞术分析，在按照本视频前面所示方法分离膀胱后，使用剪刀将组织充分剪碎。每个含有消化缓冲液的离心管中加入一份切碎的膀胱组织。然后振荡离心管，使切碎的组织在消化缓冲液中洗涤，并将离心管置于冰上，直至所有膀胱组织完成解剖和切碎。将切碎的膀胱组织在37°C孵育60至75分钟，每15分钟手动剧烈振荡5秒。当组织呈现类似湿纸巾的半透明玻璃状外观时，表明消化完成。加入 2 至 3 毫升冰浴的流式细胞术缓冲液以终止消化酶活性，并轻轻混匀。随后将试管置于冰上。为了确保获得单细胞悬液并去除任何结缔组织，将管中的内容物通过置于15毫升锥形管上的100微米滤膜过滤。然后用注射器活塞末端轻轻将残留的组织压过滤膜。用额外的2毫升流式细胞术缓冲液冲洗滤膜，并将样品置于冰上保存。将样品在 200 × g、4 °C 条件下离心 7 分钟以洗涤。将沉淀重悬于 100 µL 流式细胞术缓冲液中，缓冲液中含 Fc 封闭剂，稀释至 5 µg/mL，并转移至 96 孔圆底板。10 至 15 分钟后，向每个样品中加入 100 µL 所需的抗体混合液。然后将样品置于冰上避光孵育30至45分钟。在4°C条件下以200 × g离心7分钟，洗涤样品。最后，在上机前将细胞沉淀重悬于200 µL流式细胞术缓冲液中，并通过置于5 mL聚苯乙烯管上的40 µm细胞滤网过滤样品，随后进行流式细胞仪检测。该图展示了感染 24 小时后小鼠的代表性数据。感染后 24 小时，雄性与雌性小鼠之间的细菌负荷量相当。为确定感染时接种物损失是否影响感染的建立，每次滴注均按 1 到 5 的等级进行评分，其中 1 分表示最佳。细菌定植情况在感染后24小时进行测定。通过非参数Kruskal-Wallis检验比较各组动物CFU值的平均秩次，并采用Dunn检验对多重比较进行校正，结果显示不同灌注评分动物所获得的CFU值之间无统计学显著差异。因此可以得出结论：次优的灌注操作导致感染过程中细菌接种物大量泄漏，但在感染后24小时对细菌定植水平无显著影响。重要的是，随着操作熟练度的提高，灌注操作不理想的发生频率将会降低。最后，尽管在未处理动物中，雌性和雄性小鼠膀胱内存在的 CD45 阳性免疫细胞数量并无差异，但在感染后的雌性小鼠膀胱中，免疫细胞浸润程度表现出统计学上显著的增加。在进行导管插入操作时，务必采用缓慢、轻柔的动作。随着该技术的发展，我们得以探索雄性和雌性动物膀胱中基于性别的免疫差异。

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免疫学与感染

小动物模型尿路感染的实验研究: 男性和女性的经尿道插管

本视频将演示经尿道诱导小鼠尿路感染的方法，并量化由此产生的感染程度。...

经尿道诱导小鼠尿路感染

来源：Luyts, N., et al. 利用生物发光成像对小鼠尿路感染及其治疗进行纵向随访。J. Vis. Exp. (2021)。本视频展示了利用生物发光的E.

利用生物发光技术在小鼠模型中可视化尿路感染

来源：Conover, M. S., et al., J. 建立并表征小鼠模型中的尿路感染与导管相关性尿路感染。J. Vis. Exp.

小鼠模型中的导管相关性尿路感染

在本视频中，我们介绍了通过膀胱内灌注尿路致病菌在小鼠中建立尿路感染模型的技术。该模型可用于研究尿路致病菌在泌尿系统内的传播过程，以及决定尿路感染易感性的相关机制。...

建立尿路感染模型：一种向小鼠施用尿路致病菌以建立尿路感染模型的技术

关键词：尿路感染，尿路致病性大肠杆菌，动物模型，小鼠，膀胱感染，肾盂肾炎，UTI模型，细菌感染，泌尿系统，实验方法

本视频展示了通过经尿道导管灌注在雌性小鼠膀胱中建立尿路致病性Escherichia...

经尿道插管与细菌接种建立雄性小鼠尿路感染模型

建立雌性小鼠尿路感染模型

本视频展示了一种在小鼠膀胱癌模型中评估幽门螺杆菌中性粒细胞活化蛋白（Helicobacter pylori neutrophil-activating protein，简称 HP-NAP）抗肿瘤活性的技术。HP-NAP 与肿瘤细胞周围的中性粒细胞相互作用，促进促炎性细胞因子的产生，诱导初始 T 细胞分化为 1 型辅助性 T 细胞（Th1）和 1 型细胞毒性 T 细胞（Tc1）表型。Th1 和 Tc1 细胞分泌干扰素-γ，抑制肿瘤血管生成，并促进细胞毒性 T...

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建立尿路感染（UTI）模型的能力对于理解细菌致病机制以及推动新型治疗方法的开发至关重要。本研究的目标是展示能够重现并预测人类中观察到的实验结果的小鼠实验性尿路感染模型以及导管相关性尿路感染模型。...

小鼠模型中尿路感染和导管相关尿路感染的建立与表征

经尿道灌注是一种具有挑战性的操作，在文献中尚未得到充分描述。本文旨在介绍一种用于成年雄性小鼠经尿道插入导管的技术，以实现将含有活性物质的液体经膀胱内途径递送至尿 bladder...

成年雄性小鼠经尿道灌注操作步骤

一种尿路致病性小鼠模型 E. coli (UPEC) 经尿道接种以建立潜伏性胞内膀胱储存库及随后的膀胱暴露于 G. vaginalis...

复发性 大肠杆菌 由尿路感染引发的 Gardnerella vaginalis 小鼠膀胱暴露术

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利用生物发光成像对小鼠尿路感染及其治疗进行纵向随访

学习小鼠经尿道插管技术建立尿路感染模型，用于比较雄性与雌性免疫应答差异。该方法通过自然途径感染，可应用于膀胱癌等疾病研究，为泌尿病理学提供新工具。

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