捕获和血液中的活循环肿瘤细胞释放

该技术的总体目标是从全血中有效捕获活的循环肿瘤细胞或 CTC。这些 CTC 可以放入培养物中或用于需要非固定样品的下游分析。这种方法可以帮助回答转移领域的关键问题。

它还可用于跟踪疾病进展、对治疗的反应和评估复发风险。该技术的优势在于能够从任何实体瘤中对活的 CTC 进行无标记捕获，同时保持独立于生物标志物表达。我们最初想到从过滤器中释放 CTC，因为我们想进行 CTC 的下游 RNA 分析和培养，而不是在过滤器上原位培养它们。

开始实验时，称取足够的 PIPAAm 重量，在 15 毫升试管中制备 10% 重量的每体积溶液，其中含有丁醇。涡旋试管，直到溶液澄清。接下来，用一把剪刀将塑料显微镜载玻片切成大约 12 毫米 x 12 毫米的正方形。

然后，使用一把锋利的直边剪刀，将狭孔微过滤器晶片切成 8 毫米 x 8 毫米的正方形，并将这些碎片直接放在塑料正方形上。使用聚酰亚胺薄膜胶带，将切割好的过滤器固定在塑料方块上，仅在过滤器的边缘和角落，以便至少 7 毫米 x 7 毫米的过滤器区域不会被胶带覆盖。将固定在塑料方块上的微过滤器放在旋涂机的真空吸盘上。

按照以下配方对旋涂机进行编程。然后，使用标准塑料移液管，分配足够的每体积重量为 10% 的 PIPAAm 溶液，以完全覆盖微过滤器表面并启动旋涂机。涂层完成后，从旋涂机中取出 PIPAAm 涂层的微过滤器，并在储存期间将过滤器连接到塑料方块上。

继续进行过滤盒组装，并将微过滤器放入培养皿中，在室温下对 PIPAAm 涂层的微过滤器进行再水化。加入 1X PBS，直到微滤器完全浸没。水合步骤后，通过从过滤器上剥离或切割聚酰亚胺薄膜胶带，将过滤器从塑料方块中释放出来。

接下来，通过将微过滤器夹在顶部和底部丙烯酸件之间，沿着充当垫圈的 PDMS 件，将微过滤器组装到过滤盒中。然后，用夹子夹住亚克力盒以固定过滤器，以提供紧密密封。将 3 mL McCoy's 细胞培养基加热至 37 摄氏度。

7.5 毫升 Hank 平衡盐溶液或 HBSS 添加到 7.5 毫升血液样本中，并将稀释的血液吸入 25 毫升注射器中。确定注射针盒顶部后，将过滤盒与注射器啮合，并将其放在注射泵上。将注射泵设置为每小时 75 毫升的流速。

在底部放置一根 50 毫升的试管以收集流经的液流并启动泵。过滤完成后，松开过滤盒，注意哪一侧是细胞被 PIPAAm 包被表面捕获的顶部。将 1 毫升温热的培养基吸入新注射器中。

同样，确定过滤盒的顶部，然后将过滤盒与含有培养基的注射器重新接合，并接合盒的底端，使过滤器的 PIPAAm 涂层表面背对注射器。然后将注射器放回注射泵上，并将六孔板放在过滤盒的正下方。设置流量并启动泵。

使所有培养基通过过滤器，并将流过的液体收集在培养皿中。等待所有介质通过，然后停止泵并从泵中取出注射器和过滤盒。接下来，从注射器上取下过滤盒并打开它，从盒中取出过滤器。

将过滤器的 PIPAAm 表面朝下放入用于从孔中释放细胞时收集逆流的同一培养皿中。加入其余的温热培养基，将培养皿放入培养箱中，温度为 37 摄氏度。从过滤器盒中取出过滤器后，将其放入板中，细胞面朝下，如果需要，在培养基中轻轻摇晃以确保细胞与过滤器分离。

培养 24 小时后，用镊子小心地取出微滤器并丢弃滤器。用 1000 微升移液管轻轻重悬红细胞和外周血单核细胞或 PBMC。重悬红细胞和 PBMC 时，必须非常轻柔，以避免移出 CTC。

小心地去除含有重悬红细胞和 PBMC 的整个培养基，同时留下附着的癌细胞，并用预热至 37 摄氏度的新鲜培养基替换细胞。继续进行 CTC 活力评估。使用加标培养癌细胞的健康供体血液，释放活的循环肿瘤细胞或 CTC 的热响应技术，分别实现了 94%、82% 和 77% 的捕获、释放和回收效率。

未镀膜过滤器的释放和回收效率显著降低。进行活死测定以评估加标到血液中之前和释放后的细胞活力。细胞在释放后保持活力并在培养物中迅速扩增。

通过 PIPAAm 包被的狭缝过滤器从血液中取出 SKBr-3 细胞，并接种在 48 孔板上。在培养 16 小时时，肿瘤细胞与落在板底部的低渗红细胞和白细胞一起粘附在培养板上。洗涤后非贴壁细胞被去除，只留下粘附的肿瘤细胞在板上。

相同的过滤器可用于固定细胞捕获，用于 CTC 的计数和分子表征，以跟踪癌症的进展和更好的癌症管理。开发后，这项技术为 CTC 领域的研究人员铺平了道路，使他们能够对这些细胞进行功能表征，以探索未来的药物靶点，同时向个性化医疗迈出一步。