延迟生长抑制试验定量分析细菌来源抗菌物质对竞争的影响

本实验方案的总体目标是以定量和定性的方式，研究一种细菌分离株对另一种细菌分离株的竞争作用。该方法有助于回答有关细菌群落内竞争排斥现象研究中的关键问题。该技术的主要优势在于其能够真实反映细菌群落中实际发生的情况。

入侵的分离菌必须能够耐受已定植分离菌的抑制作用，才能成功定植。本次实验操作由医院生物学专业的研究生 Emma Crank 演示。首先，根据制造商说明书配制脑心浸液（BHI）琼脂。

在15 psi、121摄氏度条件下高压灭菌琼脂20分钟。将15毫升无菌BHI琼脂分装至无菌培养皿中，待琼脂凝固。按照生产商说明书配制BHI肉汤，并将10毫升分装至28毫升玻璃广口瓶中。

然后将BHI肉汤高压灭菌20分钟。准备雾化瓶时，首先拆卸瓶子，通过雾化器喷入5%的表面活性清洁剂，以清除内部污染物。

然后将蒸发器瓶、瓶盖和蒸发器浸泡在清洗剂中过夜。次日，在无菌气流罩下干燥蒸发器、瓶盖和瓶子。然后使用70%乙醇填充瓶子。

随后，重新安装雾化器，并通过雾化器喷入部分乙醇。盖上雾化器盖子，内部盛装乙醇保存至使用前。使用前，用无菌BHI肉汤对瓶体进行无菌冲洗，并将肉汤通过雾化器喷出。

为制备细菌过夜培养物，将竞争菌株和抑制菌株划线接种于无菌BHI琼脂平板上，在37°C有氧条件下培养约18小时。取一个28毫升的通用瓶，加入10毫升无菌BHI肉汤，并接种所需竞争菌株的单个菌落。将该培养物置于通用轨道摇床中，于37°C、250 RPM条件下过夜培养。

第二天，确保琼脂平板完全干燥，皿盖上无冷凝水，以防止接种物在平板上扩散。将25微升过夜培养物用移液器加至琼脂平板中央，注意不要完全压下移液器按钮，以免产生气泡导致培养物飞溅到琼脂表面。让培养物在室温下自然干燥，以限制其扩散。

然后，将琼脂平板在37摄氏度下有氧培养过夜。在过夜培养后，于铺有吸水纸的二级生物安全柜中操作，使用BHI肉汤将培养物稀释十倍，使其浓度约为每毫升4 × 10⁶ CFU。随后，将稀释后的菌液倒入无菌的塑料喷雾瓶中。

进行延迟生长抑制试验时，将培养物通过每个雾化瓶喷洒，以确保培养物已加载至喷雾装置中，然后再喷洒到琼脂表面。从距离琼脂表面约15厘米的高度，将约250微升稀释后的培养物均匀喷洒在整个琼脂表面上。将平板置于37摄氏度有氧条件下过夜培养。

为解读延迟性生长抑制现象，需测量喷洒的竞争菌株的生长抑制圈直径（单位为毫米），并减去中心抑制物产生菌菌点的直径。最后，根据文字实验方案记录抑制圈的清晰度评分。如本图所示，该检测结果应表现为在中心点种的抑制物产生菌附近，覆盖的竞争菌株生长出现可观察到的差异。

差异可能表现为完全抑制、部分抑制、无抑制或正向关联。该图比较了产抑制物分离株之间的抑菌圈，其结果可能取决于抗菌物质的产量、抑制物在培养基中的扩散能力、所产生的抑制物类型，或竞争菌株对抑制物的耐受水平。本示例表明，若测试用竞争菌培养物浓度过低，则抑菌圈会显得更大，且边缘不如通常情况清晰。

如果产抑制物的菌株在过夜培养前未完全干燥，则该抑制菌株会扩散，无法形成界限清晰的菌斑。另外，若竞争菌株喷洒不均匀，可能导致细菌分布不均。最后，若竞争菌株浓度过高，其可能在抑制菌株上方生长，在极端情况下甚至导致竞争菌株与抑制菌株作用关系的反转。

掌握后，该技术对每对测试菌株需耗时一小时，分四天完成。在操作过程中，需注意均匀喷洒，并确保各次检测之间的良好重复性。完成该步骤后，可将抑制数据叠加到关于群落中细菌物种有无的分类学数据上。

随后可确定抑制效应是否影响某一物种在特定环境中的定殖能力。该技术建立后，微生物组学领域的研究人员可借此探究性状变异（如抗菌肽预测）对群落结构中竞争排斥效应的影响。观看本视频后，您应能充分理解如何以定性和定量的方式比较一种细菌分离株对另一种细菌生长的竞争性抑制能力。

请注意，操作气溶胶化的细菌可能具有极高危险性，进行此操作时必须采取相应预防措施，例如在二级生物安全柜内操作，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。