保护疗效及肺部免疫反应皮下和鼻内BCG管理在小鼠

我们在此详细介绍了在小鼠模型中比较鼻内和皮下免疫与 BCG 诱导的保护功效和肺免疫反应所遵循的方法。我们的结果显示了肺部疫苗接种的好处，并表明 IL17 介导的反应在疫苗诱导的保护中发挥作用。

该程序的总体目标是研究结核病免疫接种后肺部的免疫反应，包括疫苗对鼻内攻击的保护功效和局部疫苗诱导的肺免疫反应。这种方法可以帮助回答我们在结核病疫苗毛毡中的关键问题，包括识别肺疫苗为最佳肺免疫保护而抑制的防御性肺免疫反应。这种方法的一个好处是，其动物的肺免疫反应与保护功效同时进行单独评估。

允许识别与保护相关的特定免疫参数。对于卡介苗的皮下注射，首先，将 1 毫升卡介苗疫苗悬浮液填充一个装有 26 号针头的 1 毫升注射器，然后去除气泡。然后将麻醉的小鼠置于层流罩内的俯卧位，并在后侧皮下接种 100 微升细菌。

对于鼻内给药，在微量移液器中加载 20 微升 BCG 悬浮液，并将麻醉的小鼠置于引擎盖内的仰卧位。在两个鼻孔之间逐滴接种，直到沉积了整个 20 微升的体积，在滴剂之间留出时间让小鼠吸入悬浮液。然后，用另外 20 微升细菌重新加载微量移液器并重复给药。

对于用 H37Rv 结核微生物菌株进行鼻内攻击，在接种疫苗后的适当实验时间点，如刚才所示，用 40 微升 H37Rv 细菌悬浮液的鼻内给药给动物接种。要获取支气管肺泡灌洗液或球样本，首先使用无菌镊子和剪刀暴露气管。然后在气管上做一个小切口，注意不要完全切除组织，并插入一个连接到无菌 1 mL 注射器的套管，该注射器含有 800 微升冰冷的 PBS。

管就位后，小心地用 PBS 填充肺部，然后慢慢拉回柱塞以回收至少 500 至 600 微升的灌洗液。将球分配到冰上的 1.5 mL 试管中，并确认悬浮液是无色的，表明没有血液污染。将样品储存在冰上，直到球处理。

为了确定肺部的细菌载量和免疫反应，用针头将仰卧位的鼠标固定在层流罩内平坦且消毒的表面上，并在胸部上方的上层皮肤上切开。然后，剥开皮肤，露出胸部区域，切开肺部。使用无菌剪刀和镊子采集肺和心脏，并将器官放在干净的表面上。

然后，切除心脏、气管和结缔组织。将每个肺放入不同的 1.5 mL 试管中，其中装有 1 mL 冰上去离子水，用于下游测定细菌载量和细胞免疫反应。与皮下途径相比，鼻内疫苗接种途径对肺部的保护功效要强得多。

通过对 RD9 基因组区域具有特异性的 PCR 对鼻内 BCG 疫苗组的代表性菌落进行分析，结果表明，所有菌落都提供了对应于 H37Rv 的 0.4 千克碱基对片段。鼻内 BCG 触发更高的 IL17 并干扰肺部 γ 的产生，揭示了鼻内 BCG 疫苗接种赋予的保护功效与疫苗诱导的攻击前肺部免疫反应之间的相关性在鼻内疫苗接种者观察到的灌洗样品中总浓度和 H37Rv 纯化蛋白衍生物特异性 IgA 浓度较高。对结核病激发后肺部产生细胞因子的细胞的进一步分析表明，虽然在所有感染组中都检测到对产生 γ 的细胞的干扰，但仅在鼻内 BCG 组中发现产生 IL17A 的 CD4 + 细胞，表明 IL17 的存在与肺细菌负荷减少之间存在显着相关性。

按照此程序，可以比较使用生物多样性结核病疫苗时的局部肺免疫反应以及攻击后的不同给药途径和时间点。此外，该方法可用于评估攻击后疫苗接种使用的免疫力。这可能允许识别与保护相关的免疫反应。

重要的是，与结核分枝杆菌合作需要无 BCL 的实验室设施，并且在执行此程序时应始终采取适当的预防措施。