Name: 使用F9稀土LACZ基于Cell的报告基因检测在E8.5胚胎和神经球文化相对维甲酸水平的定量测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学习使用F9 RARE-LacZ细胞报告基因检测法定量测量E8.5小鼠胚胎和神经球培养中的视黄酸水平。该方法灵敏度高，适用于多种组织样本，可研究基因突变对视黄酸信号通路的影响。

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我们感谢纽约州立大学下州医学中心的 Michael Wagner 博士和弗吉尼亚大学 Jeff Corwin 实验室的 Ben Thiede 提供 F9 RARE-LacZ 细胞及技术支援。本研究由新泽西州脊髓损伤研究委员会（NJCSCR）（资助号：10-3092-SCR-E-0）和新泽西州脑损伤研究委员会（NJCBIR）（资助号：CBIR13FEL006）提供资金支持。

所有动物实验均按照罗格斯大学罗伯特·伍德·约翰逊医学院动物护理和使用委员会（Rutgers-RWJMS IACUC）批准的方法进行。
1. 溶液与培养基的配制
<ol>
	<li>按照表1配制储备液和缓冲液。按照表2配制工作液。</li>
</ol>
2. F9 RARE-LacZ 细胞的培养与维持
<ol>
	<li>冻存细胞的复苏
	<ol>
		<li>按照 表2 中的详细说明配制 F9 RARE-LacZ 细胞培养基。</li>
		<li>在室温下，用 10 ml&#160;0.2% 明胶（参见 表2）包被 10 cm 培养皿（细胞培养处理型），孵育 30 分钟。用 10 ml 蒸馏水冲洗两次，去除多余明胶。立即向培养皿中加入 9 ml F9 RARE-LacZ 细胞培养基，防止明胶干燥。</li>
		<li>将一管 F9 RARE-LacZ 细胞14在 37 °C 水浴中复苏 2 - 3 分钟。将细胞（约 1 × 106 个细胞/ml）接种至含有 9 ml 培养基的包被培养皿中。在 37 °C、5% CO2 条件下培养。次日更换培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>F9 RARE-LacZ 细胞的维持
	<ol>
		<li>每 2 - 3 天以 1:10 的比例定期传代一次。 
		注意：切勿让细胞生长至完全汇合，否则将导致其发生分化。</li>
		<li>在细胞汇合度达到 80-90% 时进行传代。吸除培养基，用 10 ml 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。去除 PBS 后加入 1 ml 胰蛋白酶，孵育 5 分钟。加入 9 ml 培养基，反复吹打混匀，按 1:10 比例分瓶传代。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>F9 RARE-LacZ 细胞的冻存
	<ol>
		<li>按照步骤 2.2.2 的方法，对一个汇合度为 80 - 90% 的 10 cm 培养皿中的 F9 RARE-LacZ 细胞进行胰蛋白酶消化。将解离后的细胞转移至 15 ml 离心管中，在 200 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 10 ml F9 RARE-LacZ 冻存液中（见 表2）。每管分装 1 ml 至已标记的冻存管中，并将冻存管放入冻存盒。将冻存盒置于 -80 °C 冰箱中过夜，次日将冻存管转移至液氮罐中保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. E8.5 胚胎的解剖
<ol>
	<li>交配笼设置与栓查
	<ol>
		<li>设置一个包含一对交配小鼠的交配笼。次日早晨检查是否存在阴道栓，并将发现阴道栓的当天记为妊娠0.5天（day 0.5）23。在胚胎发育第8.5天（E8.5）时收获胚胎。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎解剖
	<ol>
		<li>通过颈椎脱臼法处死母鼠，并用70%乙醇喷洒腹部区域（见表2）。使用手术剪在腹部皮肤上方做一横向切口，将前后两片皮瓣拉开，暴露腹腔区域。在腹膜上做类似切口，以暴露腹腔内部。</li>
		<li>找到子宫，用剪刀将子宫从输卵管和子宫系膜中分离出来23。将子宫放入一个6 cm培养皿（非细胞培养处理）中，加入10 ml 1×PBS，以洗去多余的脂肪和血液。随后转移至另一个含有10 ml新鲜1×PBS的6 cm培养皿中。</li>
		<li>使用手术剪剪下一侧含有一个胚胎的子宫。去除子宫壁和蜕膜组织，用两把5号镊子小心分离出包裹胚胎的卵黄囊23。</li>
		<li>将卵黄囊与胚胎分离，将卵黄囊转移至一个1.5 ml微量离心管中，用于基因组DNA提取及后续基因型鉴定。使用P20移液器配合宽口吸头，将整个胚胎转移至另一只含有10 µl胰蛋白酶的1.5 ml微量离心管中，并将管子置于冰上。</li>
		<li>重复步骤3.2.3至3.2.4，直至所有胚胎均完成解剖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎消化分散
	<ol>
		<li>将含有胚胎和胰蛋白酶的1.5 ml离心管置于37 °C孵育5分钟，以促进酶解消化。
		<ol>
			<li>使用P20移液器轻轻吹打，实现胚胎的机械性分散。将含有一个已分散胚胎的全部10 µl液体接种至96孔板中的一个F9 RARE-LacZ细胞孔中（F9 RARE-LacZ细胞的铺板操作详见步骤5.1）。于37 °C、5% CO2条件下过夜培养。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 成年腰段脊髓的椎板切除术、解剖分离及神经球培养
<ol>
	<li>椎板切除术
	<ol>
		<li>通过颈椎脱位法处死一只成年（P60）小鼠。</li>
		<li>用70%乙醇喷洒背部，并使用手术剪做一横向切口。将前后两侧皮瓣拉开，暴露背部及脊柱。</li>
		<li>使用手术剪剪除覆盖脊柱的肌肉。定位脊髓的腰段（位于肋骨下方），用剪刀在此处做一深部切割，切断脊柱以暴露脊髓。</li>
		<li>用5号镊子提起脊柱的腰段，使暴露的脊髓横断面朝向实验操作者。使用精细剪刀的尖端，在暴露端的3点钟和9点钟位置剪开椎骨及肌肉。用镊子夹住被切开的椎板背侧部分，继续向尾侧方向进行切割，直至完全暴露腰段脊髓长度。</li>
		<li>使用5号镊子及钝头镊子将脊髓从椎骨中分离。将脊髓转移至含有3 ml DMEM/F12培养基的15 ml离心管中。置于冰上保存，直至所有腰段脊髓均被分离完毕。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脊髓解剖分离
	<ol>
		<li>将含有脊髓的培养基倒入一个6 cm培养皿中（非细胞培养处理表面）。</li>
		<li>在体视显微镜下，使用两对5号镊子夹住背根神经节和脊髓节段周围的血管，轻轻将其从脊髓上剥离。将处理后的脊髓节段转移至另一个不含培养基的6 cm培养皿中，用手术刀片将其充分切碎。</li>
		<li>将切碎的组织转移至含有1 ml神经球解离液的15 ml离心管中（见表2）。将离心管置于冰上，并重复步骤4.2.1–4.2.2，直至所有脊髓组织均被处理完毕。</li>
		<li>将含有切碎组织的离心管在37 °C孵育10分钟，轻弹管壁混匀，再于37 °C继续孵育10分钟。酶消化完成后，使用直径逐渐减小的火焰抛光移液管进行吹打，以实现机械性解离。 
		注：实验前需预先准备好一系列直径递减的火焰抛光移液管。取玻璃巴斯德移液管，在宽口端塞入洁净棉塞。使用酒精灯在火焰中对移液管尖端进行抛光，形成不同直径：&#34;常规&#34;、&#34;细&#34;和&#34;超细&#34;。对于&#34;常规&#34;抛光移液管，将管尖在火焰中旋转，使边缘圆滑但不显著缩小直径（约1 mm）。将管尖在火焰中旋转稍长时间，以制成&#34;细&#34;（约&#62;1 mm且&#62;5 mm直径）和&#34;超细&#34;（约0.5 mm）抛光移液管。禁止使用直径小于0.5 mm的移液管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>神经球培养
	<ol>
		<li>将含有解离后脊髓组织的离心管在200 × g条件下离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 ml神经球培养基中（见表2）。先用P1,000移液器吹打，再用P200移液器进一步吹打，以促进细胞解离。 
		注：避免产生气泡，以免降低细胞活力。</li>
		<li>取10 µl解离后的细胞悬液加入血细胞计数板进行细胞计数。以每10 ml培养基接种1×105个细胞的密度，将细胞接种于含10 ml神经球培养基的T25培养瓶中。在37 °C、5% CO2条件下培养7天，直至神经球形成24。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>神经球解离
	<ol>
		<li>收集神经球培养物并转移至15 mL离心管中。在200 × g条件下离心10分钟。弃去大部分上清液，保留约1 mL。用P1,000移液器吹打，重悬细胞沉淀并将神经球解离为单细胞。取10 µl解离后的细胞悬液加入血细胞计数板进行细胞计数。</li>
		<li>将1×105个解离后的神经球细胞接种至96孔板中一个F9 RARE-LacZ孔内（有关F9 RARE-LacZ在96孔板中的接种方法，参见第5.1节）。设置3个复孔。在37 °C、5% CO2条件下过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. E8.5 胚胎和脊髓神经球的视黄酸（RA）检测
<ol>
	<li>在96孔板中接种F9 RARE-LacZ细胞
	<ol>
		<li>在收获E8.5胚胎或解离神经球的前一天，用每孔100 µl的0.2%明胶在室温下包被96孔板，孵育30分钟。吸除明胶溶液，并用200 µl蒸馏水清洗两次。</li>
		<li>按照步骤2.2.2所述方法对维持在10 cm培养皿中的F9 RARE-LacZ细胞进行胰酶消化。将1 × 105个F9 RARE-LacZ细胞接种至每孔，但此次使用不含G418的培养基。</li>
		<li>准备足够数量的孔用于胚胎共培养（约12–20孔，取决于每窝大小）、神经球（每种基因型3孔）以及三份重复的标准曲线（共27孔）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>F9 RARE-LacZ细胞与E8.5胚胎或脊髓神经球的共培养
	<ol>
		<li>按照第3.2节所述方法收获胚胎，并将其接种至第5.1节所述96孔板中已铺好的F9 RARE-LacZ细胞上层。以类似方式，按照步骤4.4所述方法解离神经球，并接种至96孔板中F9 RARE-LacZ细胞上层。在37 °C、5% CO2条件下过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立标准曲线
	<ol>
		<li>为建立标准曲线，使用F9 RARE-LacZ细胞培养基对全反式维甲酸（at-RA）储备液进行系列稀释，配制以下浓度的at-RA溶液：100 nM、10 nM、1 nM、100 pM、10 pM、1 pM、100 fM（参见表1）。</li>
		<li>向第5.1节中的F9 RARE-LacZ细胞孔中加入100 µl不同浓度的at-RA溶液。将未处理的F9 RARE-LacZ细胞孔设为阴性对照。每种RA浓度及阴性对照均设三复孔。在37 °C、5% CO2条件下过夜培养。 
		注意：F9 RARE-LacZ细胞对不同浓度的全反式维甲酸呈剂量依赖性的线性响应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RA检测
	<ol>
		<li>在含有标准曲线和共培养体系的96孔板过夜培养后，吸除培养基，加入100 µl 2.5%戊二醛（参见表2），室温固定15分钟。去除固定液后，用200 µl 1x&#160;PBS洗涤两次，每次10分钟。</li>
		<li>去除PBS，用200 µl LacZ洗涤液（参见表2）洗涤三次，每次10分钟。在第三次洗涤期间，于15 ml离心管中用铝箔包裹配制X-gal染色液（参见表2）。计算所需染色液体积并配制适量（每孔200 µl）。 
		注意：X-gal染色液对光敏感，配制后需在15分钟内使用。</li>
		<li>准备一个加湿培养盒：将一张用蒸馏水润湿的纸巾放入足够容纳96孔板的塑料容器中。向96孔板每孔加入200 µl X-gal染色液，并将板置于加湿培养盒中。</li>
		<li>将含96孔板的加湿培养盒置于37 °C孵育，直至蓝色沉淀形成。对于E8.5胚胎，孵育过夜（12–16小时）；对于神经球培养，孵育4–8小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在OD610处读取吸光度并成像
	<ol>
		<li>显色反应完成后，吸除LacZ染色液，每孔加入200 µl 1x PBS。使用标准ELISA酶标仪在610 nm处测定吸光度，以量化报告基因对RA的响应。使用配备相机的标准体视显微镜对各孔进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. F9 RARE-LacZ 细胞的亚克隆
<ol>
	<li>检测F9 RARE-LacZ细胞对RA的反应
	<ol>
		<li>在开始任何实验之前，先测试F9 RARE-LacZ细胞对RA的反应。将F9 RARE-LacZ细胞接种于96孔板中（见第5.1节），加入1 nM全反式维甲酸（见步骤5.3）。在37 °C、湿润环境中孵育过夜。</li>
		<li>使用显微镜观察蓝色沉淀的形成。如果孔内细胞着色不均匀（见图1B左侧），则需进行如下所述的亚克隆操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>F9 RARE-LacZ细胞的亚克隆
	<ol>
		<li>按照步骤2.2.2所述方法，对培养于10 cm培养皿中的F9 RARE-LacZ细胞进行传代。与1:10的传代比例不同，以1 × 105个细胞/10 ml的低密度接种于10 cm培养皿中，以便形成独立的单细胞来源克隆。</li>
		<li>两天后，用0.2%明胶溶液每孔500 µl包被24孔板，作用30分钟。吸除明胶溶液，用500 µl蒸馏水清洗孔内两次。弃水后，每孔加入500 µl F9 RARE-LacZ细胞培养基。</li>
		<li>使用无菌P10移液器吸头挑取单个克隆，转移至一个孔中；重复此操作共24次，以获得24个独立克隆。在37 °C、5% CO2条件下培养3–4天。</li>
		<li>将24个独立克隆均分至两个24孔板中。培养两天后，向其中一个24孔板的每孔加入1 nM RA，继续过夜培养。按照第5.4节所述方法进行LacZ染色，以筛选高反应性克隆。在显微镜下观察各孔的显色反应，确定反应强且均匀的克隆。</li>
		<li>一旦确定出强反应性的亚克隆，即从另一块24孔板中扩增对应的细胞培养物。进一步在10 cm培养皿中扩大该克隆的培养，按第2.3节所述方法冻存若干管，并弃除其余所有克隆。 
		注意：通常仅有约四分之一的原始克隆可成为高反应性细胞。一般情况下，第一轮亚克隆无法获得均匀的LacZ染色结果，需进行第二轮亚克隆以获得反应强且均匀的细胞克隆。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

F9 RARE-LacZ 细胞系14是一种强大的系统，可用于检测组织外植体产生的视黄酸（RA）12,14,17,18。该细胞系对低至 100 fM 的 RA 浓度具有敏感性，且在未用 RA 处理的细胞中未检测到非特异性反应12,14,18。此外，报告细胞对全反式RA的反应在特定浓度范围内呈线性，从而可对LacZ反应进行定量，并用于确定RA水平的大小12,14,18。本文介绍的快速简便的RA报告基因检测方法利用F9 RARE-LacZ报告细胞系，对胚胎和培养的成年神经干细胞进行可视化（图 2）和相对定量测量（图 3）。该报告系统可比较不同样本间的内源性RA水平，如图 2所示。其灵敏度足以检测单个E8.5胚胎产生的RA（图 2A），以及培养的神经球所产生的RA（图 2B）。该细胞系对不同浓度RA的剂量依赖性反应，使得能够对样本中的RA水平进行定量（图 3A），并比较样本间的相对RA水平（图 3B）。需要注意的是，F9 RARE报告细胞系测量的是组织样本在孵育期间产生的RA总量，这相当于RA合成与分解代谢的净平衡。
尽管F9 RARE-LacZ细胞报告系统具有高度敏感性和多功能性，但我们已纳入若干关键的故障排除步骤，以确保该系统的可靠性。首先，如图1所示，必须通过定期传代来维持这些细胞的健康状态，避免其生长至完全汇合。其次，我们观察到，即使在G418选择压力下持续培养，较高代次的细胞也倾向于产生不一致的视黄酸（RA）反应。为解决此问题，建议在传代超过20次后弃用原有培养物，并重新复苏新的冻存管。此外，必须定期检测以确保报告细胞对培养基中RA的存在仍具有强响应性。第三，若早期代次细胞对RA的响应较弱或不均一（图1B，左），则可能需要进行一轮或多轮亚克隆，直至获得强响应细胞（图1B，右）。最后，在共培养之前，建议将胚胎和神经球等组织样本解离为单细胞。我们观察到，样本的解离可带来更一致的比色测定结果，这可能是由于解离后的细胞与报告细胞接触更均匀，从而使RA在培养孔中的分布更为均一。
对原始方案也进行了几项修改14。首先，F9 RARE-LacZ 细胞的视黄酸（RA）反应通过直接固定细胞并测量 610 nm 处的吸光度来定量，而不是收集细胞并分析裂解液中的 β-半乳糖苷酶活性14。另一项修改是在定量 RA 反应之前，将解离的样品与 F9 RARE-LacZ 细胞直接共培养。此前报道的方法是将样品单独培养，仅将这些培养物的培养基添加至 F9 RARE-LacZ 细胞中16,18。
尽管该系统功能强大，F9 RARE-LacZ 报告基因检测仍存在若干局限性。其中一个局限性在于，该报告细胞系虽然对全反式维甲酸（all-trans RA）具有强烈反应，但也会对其他维甲酸异构体（包括 9-cis-RA 和 13-cis-RA）产生反应；然而，其对全反式 RA 的敏感性比其他异构体高 100 倍18。该系统的另一局限性是，其线性剂量依赖性反应仅存在于 10-13 M 至 10-7 M 的全反式 RA 浓度范围内14,18；因此，若待测样本的 RA 水平超出此范围，则可能需要对样本进行系列稀释，直至测量值落入线性范围内。最后，由于该检测主要为比色法，显色反应的终点在不同样本和实验之间可能存在差异。因此，每次实验都必须平行设置标准曲线，以便对报告细胞的反应进行定量分析。
综上所述，我们报道了使用 F9 RARE-LacZ RA 报告细胞系对 E8.5 胚胎中的 RA 水平进行定量检测，并首次在神经球中实现了 RA 水平的定量分析。该报告系统具有良好的通用性，几乎可用于任何细胞或组织类型中 RA 水平的定量，未来可能衍生出多种应用。

视黄酸（RA）是视黄醇或维生素A的代谢衍生物，通过多种细胞脱氢酶的连续作用生成1。由于其两亲性化学性质，RA可轻易穿过脂质膜，作为可溶性的形态发生因子发挥作用1。RA是一种关键分子，通过作为细胞核内视黄酸受体的配体来调控众多发育过程及成体细胞功能，并激活基因表达2-10。在缺乏RA的情况下，这些RA受体（RARs）会结合DNA上的视黄酸反应元件（RAREs），发挥转录抑制作用；当RA与这些受体结合后，则使其转变为转录激活因子，从而诱导靶基因的表达1,5,6。
尽管视黄酸（RA）信号通路已被充分表征，但由于RA分子量较小（约300 Da）且具有两亲性，目前尚无法通过组织学方法直接可视化和定量检测RA11。直接测定RA水平的唯一方法是通过高效液相色谱法（HPLC）从组织样本中分离RA11。该方法通常需要大量组织样本，往往需通过合并多个样本实现12。因此，该技术不适用于单个胚胎或少量样本/组织中RA水平的测定。
为了研究视黄酸（RA）的细胞功能，已开发出多种方法以间接推断RA的存在。这些方法利用含有高响应性RAR-beta RARE的报告系统，驱动β-半乳糖苷酶或荧光素酶的表达。11,13,14Rossant 构建的转基因 RARE-LacZ 报告小鼠 等13 是可视化视黄酸（RA）信号时空区域的理想系统 原位11,13,15,16 但不适合进行定量测量。F9 RARE-LacZ 细胞系14另一方面，该方法适用于检测类风湿性关节炎（RA）以及对组织外植体中RA水平进行定量测量11,12,14,17,18.
F9畸胎瘤细胞表达内源性α-、β-和γ-视黄酸受体 19，并在暴露于RA后诱导分化为壁层内胚层19-21F9 细胞长期以来一直被用作视黄酸（RA）诱导细胞分化的模型，因此被选为 RA 报告基因检测的理想细胞系。源自 F9 的 Sil-15 由 Wagner 等人构建的 RA 报告基因细胞系14 含有一个 大肠杆菌'LacZ 基因下游含有人类β-视黄酸受体（RAR-beta）基因的一个拷贝64 bp视黄酸反应元件（RARE）。为了筛选和维持稳定克隆，该载体还包含氨基糖苷磷酸转移酶（NEOr) 基因作为在G418存在下的筛选标记。该构建体可在视黄酸（RA）存在时诱导β-半乳糖苷酶的表达，通过LacZ染色可直观显示该表达，随后可采用比色法对反应结果进行定量分析11,12,14,18.
这种用途极为广泛的报告细胞系已被广泛用于通过将组织样本与报告细胞共培养来检测内源性视黄酸（RA）的产生，例如耳蜗17和胚胎腹侧板外植体14。此外，该报告细胞系还被用于通过分别培养胚胎脊髓的 pooled 切片，并将这些培养物的条件培养基加入F9 RARE-LacZ细胞中，以定量分析发育中脊髓内的RA水平18。在LacZ染色后，使用标准的ELISA酶标仪进行比色读数以完成定量分析11,12,18。最后，该报告细胞系还被用于通过监测RA水平的变化来检测RA代谢酶的存在12,18。
本文报道了该报告细胞系的灵敏度还可用于检测与E8.5胚胎共培养时由单个胚胎产生的视黄酸（RA）水平，从而实现不同基因型个体胚胎之间的比较。以一个具体实例而言，Gpr161 是一种孤儿G蛋白偶联受体（GPCR），部分通过RA信号通路调控神经管形成22，我们报道利用该报告细胞系研究Gpr161隐性突变（Gpr161vl）对胚胎整体RA水平的影响。除此之外，该报告系统的多功能性和操作简便性使其可灵活用于测量和比较不同组织样本中的RA水平，甚至可用于来源于成体脊髓干细胞的神经球培养物。本文中，我们描述了通过与F9 RARE-LacZ RA报告细胞系直接共培养，定量测定胚胎及神经球培养物中相对RA水平的方法。

<table><tbody><tr><td>C3H/HeSn-Gpr161vl/J 小鼠品系</td><td>杰克逊实验室</td><td>000316</td><td></td></tr><tr><td>F9 RARE-LacZ 报告基因细胞系</td><td></td><td></td><td>来自 Dr. Michael Wagner（纽约州立大学下州医学中心）和 Ben Thiede（Dr. Jeff Corwin 实验室，弗吉尼亚大学）</td></tr><tr><td>DMEM/F-12（含 L-谷氨酰胺和 HEPES）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），经鉴定合格</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>26140-079</td><td>以 10 ml 分装于 -20 &amp;deg;C 保存，避免反复冻融；配制培养基时在 37 &amp;deg;C 预热</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140-122</td><td>以 10 ml 分装于 -20 &amp;deg;C 保存，避免反复冻融；避光保存</td></tr><tr><td>G418</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10131-027</td><td>4 &amp;deg;C 保存；避光</td></tr><tr><td>2% 明胶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1393</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>B-27 添加剂（2% 储存液）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17504-044</td><td>以 1 ml 分装于 -20 &amp;deg;C 保存，避免反复冻融；配制培养基时于室温预热</td></tr><tr><td>小鼠表皮生长因子（EGF）</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td>用含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的 1×PBS 配制 100 &amp;mu;g/ml 储存液；使用时用 1×PBS 稀释至工作浓度；-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>小鼠成纤维细胞生长因子（FGF）-基础型</td><td>PeproTech</td><td>450-33</td><td>用含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的 1×PBS 配制 100 &amp;mu;g/ml 储存液；使用时用 1×PBS 稀释至工作浓度；-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>50% 戊二醛</td><td>Amresco</td><td>M155</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠一水合物（C24H39NaO4 &amp;middot; H2O）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5670</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-&amp;beta;-D-半乳糖吡喃糖苷）</td><td>Promega</td><td>V3941</td><td>储存液于 -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;保存</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>41639</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>全反式维甲酸（at-RA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R-2625</td><td>以 1 ml 分装于 -80 &amp;deg;C 保存；对光极为敏感</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12605-010</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25200-056</td><td>可作为 TrypLE Express 的替代品；分装后于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液（HBSS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14170-112</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>10× 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10010-023</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Worthington</td><td>LK003176</td><td>4 &amp;deg;C&amp;nbsp;保存</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Worthington</td><td>LS003703</td><td>以 1 ml 分装于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>透明质酸&amp;nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>385908</td><td>以 200 &amp;mu;l 分装于 -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;保存</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td>以 200 &amp;mu;l 分装于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>犬尿酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>K3375</td><td>以 200 &amp;mu;l 分装于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty 冷冻容器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿（非细胞培养处理）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿（细胞培养处理）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 cm 培养皿（非细胞培养处理）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 孔细胞培养板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 棕色微量离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 冻存管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 水浴</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>精细手术剪刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 号镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>钝头镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>棉球</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酒精灯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用f9 rare-lacz细胞报告系统对e8.5胚胎和神经球培养物中相对视黄酸水平进行定量检测

Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

视黄酸（RA）是一种重要的发育形态发生素，可协调前后轴和背腹轴的模式形成、体节分化、神经发生、后脑和脊髓的模式构建，以及多个器官系统的发育。由于其化学性质为小分子两亲性脂质，目前在组织学上直接检测和可视化视黄酸在技术上仍不可行。当前用于推断视黄酸存在与定位的方法主要依赖于检测视黄酸生物学活性的报告系统。大多数已建立的报告系统，包括转基因小鼠和细胞系，均利用RAR-beta基因上游的高效视黄酸反应元件（RARE）来驱动报告基因（如β-半乳糖苷酶或荧光素酶）的视黄酸诱导性表达。转基因RARE-LacZ小鼠在可视化视黄酸信号的时空动态变化方面具有重要价值，尤其是在胚胎发育过程中。然而，该系统并不能直接测量总体视黄酸水平。作为一种报告系统，F9 RARE-LacZ细胞系可用于多种用途，从简单的视黄酸检测到对组织外植体中视黄酸水平进行定量测定。本文描述了利用F9 RARE-LacZ报告细胞系对胚胎和神经球培养物中产生的相对视黄酸水平进行定量测定的方法。

F9 RARE-LacZ 报告基因细胞是一种贴壁生长的胚胎癌细胞系，需在明胶包被的表面培养。该报告基因构建体可使细胞对视黄酸（RA）产生定量反应，并成比例地诱导β-半乳糖苷酶的表达11,12,14,18。这些细胞呈现上皮样形态（图1A）。由于其倍增速度较快，建议每2至3天以1:10的比例传代一次。在使用该报告基因细胞系的过程中，我们发现即使在培养基中添加G418，这些细胞对RA的反应能力仍会在多次传代后逐渐减弱（图1B，左），这可能影响该细胞系的报告基因功能。反应能力的下降可能是由于后期传代过程中部分转基因丢失所致。因此，需定期进行亚克隆，以确保获得对RA反应强且均一的细胞群体（图1B，右）。
尽管此前已有多种关于该细胞系的应用报道12,14-18，本文报道了利用该细胞系检测不同基因型E8.5单个胚胎内源性视黄酸（RA）水平的方法。Gpr161vl/vl突变可导致胚胎RA信号减弱22。通过将解离的胚胎与F9 RARE-LacZ细胞共培养发现，与野生型同窝胚胎相比，Gpr161vl/vl胚胎的内源性RA水平降低（图2A）。由于该报告细胞系具有良好的适用性，本文还报道了其一种新用途，即检测来自成年Gpr161wt/wt小鼠的神经球培养物所产生的RA水平（图2B）。该报告细胞系证实，来自成年脊髓干细胞的神经球培养物可产生内源性RA。染色强度的显著差异表明，与E8.5胚胎相比，报告细胞对脊髓神经球的反应更强。这可能是由于神经球随时间产生的RA水平远高于E8.5胚胎，原因可能在于神经球培养物比E8.5胚胎更为均一，因而含有更多的RA生成细胞。
不同浓度的at-RA处理可导致报告细胞呈剂量依赖性的线性反应。该反应可通过测定610 nm处的吸光度进行比色法检测。所生成的标准曲线可用于定量样品中的视黄酸（RA）水平，例如野生型神经球培养物中的RA含量。图3A）或 E8.5 胚胎（图3B).
<img alt="细胞形态与染色实验，显微图像显示细胞结构及染料摄取。" src="/files/ftp_upload/54443/54443fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1。 F9 RARE-LacZ 细胞的维持与亚克隆。(A) F9 RARE-LacZ 细胞的相差显微图像如图所示。这些细胞的倍增时间约为 10 小时，必须每 3 天（约 70 - 80% 汇合度）以 1:10 的比例进行传代。 (B) 必须定期对培养物进行测试，添加1 nM全反式视黄酸并随后进行LacZ染色，以确保培养物对全反式视黄酸保持强烈且均匀的反应（右图）。若反应不佳且不均匀（左图），则必须进行亚克隆。比例尺 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54443/54443fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Gpr161 表达；神经组织和神经球的显微图像；比较分析。" src="/files/ftp_upload/54443/54443fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 共培养样品（解离的 E8.5 胚胎/神经球）与 F9 RARE-LacZ 细胞的 LacZ 染色。 (A) 不同基因型的 E8.5 小鼠胚胎被解离后接种于 F9 RARE-LacZ 细胞上层。24 小时后进行 LacZ 染色，可观察到 F9 RARE-LacZ 细胞对共培养样品内源性 RA 的反应。Gpr161vl 突变导致内源性 RA 减少，表现为报告细胞反应减弱。 (B) 左图：显示从成年脊髓神经干细胞培养获得的神经球的相差图像。右图：将来源于成年 Gpr161wt/wt 脊髓的神经球解离后接种于 F9 RARE-LacZ 细胞上层。LacZ 染色后出现蓝色沉淀，表明这些神经球中存在内源性 RA。神经球与 E8.5 胚胎共培养体系染色强度的差异表明，神经球中的 RA 水平高于 E8.5 胚胎。比例尺：100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54443/54443fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="比色分析，RA浓度与读数关系图，条形图显示相对RA水平，Gpr161研究。" src="/files/ftp_upload/54443/54443fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图3. RA水平的标准曲线及比色定量分析。 可使用标准ELISA酶标仪在610 nm波长下通过比色法测定F9 RARE-LacZ报告细胞系的响应。 (A) 用于定量野生型神经球培养物中相对RA水平的代表性标准曲线。(B) 共培养的E8.5胚胎中相对RA水平的定量结果。N = 3；*p &lt; 0.05，学生t检验。误差条表示标准误（SEM）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54443/54443fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>储存缓冲液/溶液</td>
			<td>组分</td>
			<td>储存条件</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% 脱氧胆酸钠一水合物 (C24H39NaO4 · H2O)</td>
			<td>10 ml 溶于 100 ml dH2O</td>
			<td>4 ºC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M 氯化镁 (MgCl2)</td>
			<td></td>
			<td>室温</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x 亚铁氰化钾 (K4[Fe(CN)6]·3H6O)</td>
			<td>2.12 g 溶于 10 ml dH2O</td>
			<td>避光，室温</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x 铁氰化钾 (K3[Fe(CN)6])</td>
			<td>1.64 g 溶于 10 ml dH2O</td>
			<td>避光，室温</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mg/ml X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷)</td>
			<td>加入 5 ml 二甲基甲酰胺配制成 20 mg/ml 储存液</td>
			<td>-20 ºC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM (3 mg/ml) 全反式维甲酸</td>
			<td>将 50 mg 溶于 16.67 ml 无水乙醇中，分装成 1 ml 等份。</td>
			<td>避光，-80 ºC，置于 1.5 ml 棕色微量离心管中</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>木瓜蛋白酶</td>
			<td>将一瓶溶于 7 ml HBSS 中</td>
			<td>4 ºC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 缓冲液与溶液配方。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>工作缓冲液/溶液</td>
			<td>组分</td>
			<td>储存条件</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F9 RARE-LacZ 细胞培养基</td>
			<td>50 ml 胎牛血清（FBS）（终浓度 10%）</td>
			<td>过滤除菌。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>5 ml 100x 青霉素-链霉素（终浓度 1X）</td>
			<td>4 ºC 保存。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4 ml 50 mg/ml G418（终浓度 0.4 mg/ml）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>加至 500 ml DMEM/F-12（含 L-谷氨酰胺和 HEPES）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2% 明胶</td>
			<td>25 ml 2.0% 明胶</td>
			<td>4 ºC 保存。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>80 ml 蒸馏水</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>充分混匀</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% 乙醇</td>
			<td>30 ml 95% 乙醇</td>
			<td>置于喷雾瓶中。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>70 ml 蒸馏水</td>
			<td>室温保存</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>神经球解离液</td>
			<td>1 ml 20U 木瓜蛋白酶</td>
			<td>每次现配</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 μl 13 mg/ml 胰蛋白酶</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 μl 7 mg/ml 透明质酸</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>28 μl 10 mg/ml DNaseI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>50 μl 4 mg/ml 犬尿酸</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>神经球培养基</td>
			<td>DMEM/F-12（含 L-谷氨酰胺和 HEPES）</td>
			<td>每次现配</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2% B-27 添加剂</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20 ng/ml 成纤维细胞生长因子（FGF）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20 ng 表皮生长因子（EGF）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% 戊二醛</td>
			<td>250 μl 50% 戊二醛</td>
			<td>每次现配</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4750 μl 1x PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LacZ 洗涤液</td>
			<td>0.5 ml 10% 脱氧胆酸钠（终浓度 0.1%）</td>
			<td>4 ºC 保存。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1.0 ml 100% NP-40（终浓度 0.2%）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>50 ml 10X PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>加蒸馏水至 500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal 染色液</td>
			<td>1x 亚铁氰化钾</td>
			<td>每次现配</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1x 铁氰化钾</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 mg/ml X-gal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>用 LacZ 洗涤液定容至适当体积</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F9 RARE-LacZ 冻存液</td>
			<td>F9 RARE-LacZ 培养基 + 5% DMSO</td>
			<td>每次现配</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 工作缓冲液与溶液组成。

目前尚无能够准确测量少量组织中视黄酸（RA）水平的方法。本实验方案介绍了一种利用RA报告细胞系，对E8.5胚胎和神经球中相对RA水平进行简便、定量检测的方法。

利用F9 RARE-LacZ细胞报告系统对E8.5胚胎和神经球培养物中相对视黄酸水平进行定量检测

视黄酸（RA）是一种重要的发育形态发生素，可协调前后轴和背腹轴的模式形成、体节分化、……

本实验的总体目标是利用基于细胞的报告基因检测方法，对组织样本（如E8.5小鼠胚胎或成年神经球培养物）中的视黄酸相对水平进行定量测定。尽管视黄酸（RA）信号通路已被充分表征，但直接通过组织学方法检测RA在技术上难以实现。该检测方法有助于解答遗传突变如何影响RA水平这一关键科学问题。该技术的主要优势在于其高灵敏度和多功能性，能够检测多种组织样本中广泛浓度范围的视黄酸（RA）。尽管该方法可直接用于测定不同组织样本中的RA水平，还可应用于其他研究，例如通过监测RA水平的变化来确定RA代谢酶的存在与否。在开始任何实验之前，需检测F9 RARE-LacZ细胞对RA的反应。向接种于96孔板中的F9 RARE-LacZ细胞加入1纳摩尔的全反式RA。然后，将培养板置于37摄氏度孵育过夜。次日，进行LacZ染色并观察细胞中是否出现蓝色沉淀。如果细胞内的颜色分布不均匀，则继续进行细胞亚克隆。将选定的细胞培养物以每10毫升100,000个细胞的密度接种至10厘米培养皿中。培养两天后，向24孔板每孔加入500微升0.2%明胶，室温孵育30分钟。随后吸除明胶溶液，并用500微升蒸馏水洗涤各孔两次。现在，向孔中加入 500 微升 F9 RARE-LacZ 细胞培养基。接着，使用无菌的 P10 移液器吸头挑取 F9 细胞克隆，并将其转移至各孔中。培养三到四天后，将克隆分至两个经明胶包被的 24 孔板中，一个用于检测，另一个用于扩增。再培养两天后，向一个24孔板的每孔中加入1纳摩尔的RA，过夜培养。次日，进行LacZ染色以检测高反应细胞，并扩增相应的培养物。在收获E8.5胚胎或解离神经球的前一天，用每孔100微升0.2%明胶对96孔板进行包被，静置30分钟。然后，吸出明胶，并用 200 微升蒸馏水清洗孔板两次。接着，对维持在 10 厘米培养皿中的选定 F9 RARE-LacZ 细胞进行胰蛋白酶消化。随后，将 100,000 个细胞接种至 96 孔板的每孔中，使用不含 G418 的培养基。加载足够数量的孔，以便对每个胚胎进行共培养；若处理神经球，则每种基因型准备三个孔。同时准备24个孔用于标准曲线。然后将培养板孵育24小时。进行胚胎细胞共培养时，首先开始解剖E8.5胚胎。接着，在一个新的1.5毫升离心管中加入10微升胰蛋白酶，使用扩口的P20移液器吸头将整个胚胎转移至管中，并将管置于冰上。待所有胚胎分离完成后，将所有离心管在37摄氏度下孵育5分钟，以解离组织。五分钟后，使用P20移液器吸头轻轻吹打每管内容物，将10微升转移至已准备好的含有F9 RARE-LacZ细胞的96孔板孔中。将板过夜培养。对于神经球共培养，首先将神经球培养物转移至15毫升离心管中。将离心管在200 g下离心10分钟，除去上清液，仅保留1毫升。然后用P1000移液器重悬沉淀。接着，取少量样品测定解离细胞的密度。然后，将100,000个解离的神经球细胞接种到F9 RARE-LacZ细胞上，每种神经球培养类型接种三个孔。现在，务必为标准曲线准备好各孔。取七种不同浓度的全反式维甲酸溶液，用 F9 RARE-LacZ 培养基进行系列稀释后，每孔加入 100 µL，每个浓度设三个重复。同时设置未处理细胞的阴性对照。最后，将加样完毕的 96 孔板过夜培养。第二天，吸去培养基，每孔加入100 µL 2.5%戊二醛固定细胞，室温孵育15分钟。随后去除固定液，每孔加入200 µL PBS，洗涤两次，每次10分钟。接下来，用200微升LacZ洗涤液将各孔洗涤三次，每次洗涤10分钟。在第三次洗涤期间，于15毫升离心管中配制X-gal染色液，并用铝箔包裹。同时，为96孔板准备一个湿盒。现在，向每个孔中加入 200 µL X-gal 染色液。将培养板放入湿化孵育盒中，在 37 °C 下孵育。孵育结束后，移除 LacZ 染色液，并加入 200 µL PBS 替代。然后，在610纳米处测定吸光度，并对培养板成像。F9 RARE-LacZ报告细胞系由贴壁生长的胚胎癌细胞组成，这些细胞对视黄酸（RA）产生定量反应，并成比例地诱导β-半乳糖苷酶的表达。此外，这些细胞具有上皮样形态。尽管使用G418进行筛选培养，这些细胞对视黄酸（RA）的反应仍会随着多次传代而减弱。因此，需定期进行亚克隆，以确保细胞对RA具有强而均一的反应性。在Gpr161基因中携带vl突变的纯合子E8.5胚胎预期表现出胚胎内RA信号通路活性降低。利用本文所述的将解离胚胎与F9 RARE-LacZ细胞共培养的检测方法，该预期得到了证实。将野生型成年来源的神经球与F9 RARE-LacZ细胞共培养，也可用于检测神经球培养物中的视黄酸（RA）。与E8.5阶段细胞相比，染色增强可能源于神经球培养物的均一性。通过建立RA浓度的标准曲线，可对野生型神经球培养物及E8.5胚胎中的RA水平进行定量。在进行该实验操作时，请注意通过定期亚克隆来维持对视黄酸（RA）反应强烈的F9 RARE-LacZ细胞。同时，务必充分解离样本，以促进均一分布并获得稳定的RA检测结果。完成该操作后，可进一步研究基因突变对RA水平的影响，并可采用其他方法来确定视黄酸信号通路中哪些组分受到直接影响。

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