活细胞层的快速消减带图案微流控探头
2016年9月15日
我们提出了一种在表面上对活细胞单层进行减法图案化的协议。这是通过使用微流体探针 （MFP） 对贴壁细胞进行局部和选择性裂解来实现的。从局部区域提取的细胞裂解物可用于下游分析，从而实现分子分析研究。
本视频文章中介绍的方法的主要目标是快速生成空间定义的细胞模式，以促进细胞间相互作用的原位时空分析。所提出的策略利用了微流体探针技术。微制造探针头将纳升体积的生化物定位在生物基质上，以形成细胞单层图案。
基于 MFP 的图案化技术的主要优点是，由于局部裂解，它几乎是瞬时的，允许实时修改图案。当我们注意到其他生成细胞模式的方法需要漫长的多步骤方案才能真正看到细胞模式的成功时，我们第一次有了这种方法的想法。为了在单元表面运行具有流体动力学流约束的稳定实验，需要优化 MFP 参数。
为此，视觉演示至关重要。Aditya Kashyap 和 Julien Cors 将演示此程序。该平台的作模块包括电动注射器、电动载物台和控制器。
MFP 连接到电动 Z 载物台，以控制头部和基板之间的间隙距离，基板支架连接到构成扫描系统的 X 和 Y 电动载物台上。MFP 头具有连接到泵站的流体通孔、用于将泵头安装到 Z 载物台上的安装孔，以及从抛光顶点流出的通道。顶端与细胞培养底物共面。
为了准备泵站和流体处理设备，在活细胞实验之前和之后，通过超声处理和超纯水中的 0.5% 漂白剂溶液清洁注射器和注射器柱塞。用水彻底冲洗。将注射器的尖端完全浸入水浴中并使用柱塞吸液，将注射器装满水。
在水浴中吹扫液体，使注射器轴接触注射器出口处的密封件。继续吸液和吹扫，直到注射器柱中未看到气泡。使用下锁连接器将填充的注射器连接到注射泵。
使用安装在泵上的切换阀将液体从注射器引导至通向 MFP 头或储液罐的两个毛细管之一。根据注射器的大小，以每分钟约 10 至 50 微升的流速，用注射器中的水吹扫两个毛细管，直到注射器中留下约 10 微升水。使用玻璃器皿清洁剂进行标准清洁，或使用 0.5% 漂白剂进行严格清洁，超声处理清洁 MFP 头 5 分钟。
将尖端浸入水中并对过孔施加真空，用水清洗通道。在立体显微镜下检查通道是否有潜在障碍物，如有必要，重复上一步。接下来，将清洁后的打印头安装在打印头支架上，并将连接器拧到打印头上。
将吹扫的毛细管插入适当的微流体连接器适配器中，该适配器与头部中的通道通孔连接。在按照文本协议中的说明执行终点校准之前，将头部支架拧到 Z 载物台上，该平台用于控制头部和细胞单层之间的间隙距离。通过将 MFP 头放在没有细胞的腔室载玻片上并以 5 微米的步长缓慢下降，获得粗略的零间隙距离。
探针与基板接触时，应观察牛顿环。这是一个粗略的估计。在调整探针顶点与基板的共面性后，将获得准确的位置。
形成后，确保牛顿环对称。为确保探针顶点的共面性，在头部和 Z 平台的界面处使用测角仪调整头部的倾斜度。将 MFP 头从基材上移开 20 微米，并使用测角仪调整倾斜度。
重复下降、归零和倾斜调整，直到牛顿环在接触时对称。调整倾斜度后，将产生对称牛顿环的 Z 位置设置为零。接下来，如文本方案中所述，准备用于内部注射通道的处理液和外部注射所需的提取缓冲液。
使用连接到注射泵的排空管线，吹扫剩余的水，并以每分钟 40 微升的速度将脱气溶液吸入注射注射器中，直到注射器装满。这确保了注射器、连接器和毛细管的无气泡填充。为了在腔室载玻片上制备细胞单层，请使用标准细胞培养方案将细胞扩展在 T 瓶中。
在培养瓶中达到细胞汇合后，胰蛋白酶消化并收集细胞。在每个两室载玻片中每平方厘米接种 0.20 万个细胞以进行图案化。使用其中一个腔室中的细胞作为细胞生长和活力的对照，将细胞培养 48 小时。
在腔室载玻片上达到细胞汇合后，将细胞与 500 μL 浓度为 10 μmol 的 cell-tracker 染料溶液在无血清培养基中孵育 45 分钟。这样做是为了在图案化过程中进行细胞可视化。使用移液管轻轻冲洗每个腔室，用 PBS 洗涤标记的细胞。
随后，在补充血清的培养基中培养细胞以进行模式化实验。流体动力学流约束通过同时注入和吸取加工液体来定位液体。在分层限制中，多种处理液体被限制，外部 HFC 保护样品免受内部处理 HFC 的影响。
将 MFP 移动到细胞单层上，与载玻片保持 50 微米的间隙距离。这个间隙距离确保了多级 HFC 的接触，也解释了单层表面和厚度的变化。通过 I-2 以每分钟 6 或 8 微升的速度注射氢氧化钠。
使用文本协议中的流规则评估其他流速。通过使用注射注射器改变注射流速 QI-two 和 QI-one 的比率来调节内部 HFC 的大小。例如，使用 1.3 微升/分钟到 4 微升/分钟的 QI-one，QI-two 固定为每分钟 8 微升，以产生 150 至 300 个细胞的氢氧化钠足迹。
以每分钟 20 微升的流速从 MFP 头上最外层的孔中注入完全培养基，以解决 hHFC 运行过程中培养基的蒸发和吸液问题。要对细胞单层进行图案化，请将载物台软件设置为以用户定义的模式以每秒 10 微米的扫描速度和 50 微米的间隙距离扫描细胞单层上的探针头。在嵌套的 hHFC 运行并与单层接触的情况下，用所需图案的轨迹扫描 MFP，以实现图案化细胞去除。
对于第一次细胞类型去除后的共培养，像以前一样接种不同的细胞系以填充空白。准备采样站用于裂解物的下游分析。这里显示的是一个采样站示例，它包括一个 3D 打印的 8 条 PCR 支架。
根据应用所需的严格程度，用 70% 乙醇或其他表面去污剂擦拭管架。使用试管架上的磁性夹将其连接到底物架上。准备采样站后，将 MFP 头放置在距离单层 100 微米的位置。
开始作 hHFC，使用 50 毫摩尔氢氧化钠溶液作为内部注射通道的处理液，QI-one 的流速为每分钟 1 微升，QI-2 的流速为每分钟 6 微升，QA-one 为每分钟负 7 微升，QA-2 为负 17.5 微升/分钟。一旦流量限制稳定，将探针头下降到 50 微米的间隙距离，以对选定的 hHFC 细胞亚群进行基于氢氧化钠的局部裂解。亚群裂解完成后，将头部对准采样站中的试管。
将收集的裂解物直接弹出到 PCR 管中。按照文本实验方案中的说明处理裂解物后，将裂解物加载到仪器供应商设置的标准 qPCR 工作流程中。通过控制分层 HFC 中注射液的比例，可以调节与细胞表面接触的足迹大小。
选择流速，使化学效应而不是剪切效应是细胞裂解的主要机制。通过使用计算流体动力学确定剪切力来证实这一点。这里显示的是通过使用 MFP 扫描轨迹编程来生成细胞岛网格。
使用进样液比例调节占地面积大小，可以控制细胞去除的分辨率。该方法可用于多个细胞群的连续共培养，从而产生复杂的细胞间相互作用模式。使用氢氧化钠作为处理液使裂解物与基于 PCR 的细胞分析兼容。
在这里，从 5 个和 1 个足迹中定量 DNA 含量，使用所述方法裂解。一旦掌握，该技术可以在不到 30 分钟的时间内对细胞进行。在尝试此过程时，请务必记住确保通道和毛细血管没有气泡，因为这可能会对 HFC 产生不利影响。
不要忘记，使用氢氧化钠（一种腐蚀性化学溶液）可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如安全眼镜和实验室外套。按照此程序，我们可以通过免疫染色或通过 MFP 介导的裂解进行 DNA-RNA 测序来局部分析细胞，以回答其他问题，例如哪些蛋白质由于细胞的几何限制而过度表达。该技术发展后，可以为分子生物学领域的研究人员探索组织生成和变性过程中的细胞间和细胞外信号传导铺平道路。
观看此视频后，您应该对如何在 MFP 中设置的细胞单层进行减材模式以进行局部处理以及制作细胞共培养的复杂几何形状有一个很好的了解。
概述
本文介绍了一种使用微流控探针（MFP）进行活细胞单层减法图案化的协议。该方法允许对附着细胞进行局部和选择性裂解，从而促进下游分子分析研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 微流控技术
背景
- 细胞图案化对于研究细胞间相互作用至关重要。
- 传统方法通常涉及冗长的协议。
- MFP技术提供了一种快速有效的替代方法。
- MFP参数的优化对于稳定实验至关重要。
研究目的
- 开发一种生成空间定义细胞图案的方法。
- 实现细胞图案的实时修改。
- 促进细胞相互作用的原位时空分析。
使用的方法
- 利用微流控探针进行细胞的局部裂解。
- 在室内幻灯片上准备细胞单层。
- 优化MFP参数以实现流体动力学流的限制。
- 通过视觉演示来说明该程序。
主要结果
- 成功使用MFP生成定义的细胞图案。
- 演示了图案的实时修改。
- 实现了高效的局部细胞裂解。
- 协议允许对细胞裂解物进行下游分析。
结论
- 基于MFP的图案化技术快速有效。
- 它为研究细胞相互作用提供了有价值的工具。
- 未来的应用可能增强对细胞动力学的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid subtractive patterning of live cell layers enables precise spatiotemporal control over cellular microenvironments, supporting mechanistic studies of cell-cell and cell-matrix interactions. This capability accelerates target validation by allowing real-time modulation of cellular geometries to interrogate signaling pathways and phenotypic responses. The method enhances predictive confidence in preclinical models by providing a reproducible platform for probing functional dependencies in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through localized cell removal to clarify pathway dependencies and functional target roles.
- Operational Value: Supports biological de-risking by generating defined cellular patterns for assessing target engagement in controlled microenvironments.
- Predictive Value: Facilitates phenotypic screening of cellular responses to geometric confinement, improving target confidence and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with user-defined cell patterns for downstream molecular analysis, including lysate collection for qPCR or sequencing.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through precise hydrodynamic flow confinement and real-time pattern modification.
- Scalability: Enables screening readiness via modulation of lysis footprint size using injection flow rate ratios, supporting platform reuse across cell types.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by enabling sequential coculture of multiple cell populations to model complex tissue architectures.
- Preclinical Model: Supports risk-adjusted advancement decisions by allowing analysis of lysed subpopulations via PCR-compatible workflows to identify overexpression signatures.
- Mechanistic De-risking: Connects discovery findings to preclinical validation through spatially controlled perturbation of cell-cell interactions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, enabling iterative refinement of cellular models based on interaction dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by permitting real-time modification of cell patterns to probe spatiotemporal signaling.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative control of lysis footprint size and reproducible hydrodynamic confinement.
- Analytics: Generates PCR-compatible lysates enabling quantitative molecular readouts that help compare conditions across patterned regions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via sequential recellularization to study emergent signaling in reconstructed microenvironments.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for generating diverse coculture patterns, reducing reliance on single-use microfabrication.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in cellular interaction studies through precise spatial control.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability via motorized scanning, flow rate modulation, and real-time visualization.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling rapid iteration of cellular geometries, reducing late-stage biological risk in target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by generating functional data on pathway dependencies in disease-relevant cellular contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic systems, cell culture, and hydrodynamic flow confinement optimization.
- Depends on motorized stages, syringe pumps, and vacuum-assisted fluid handling for bubble-free operation.
- Necessitates cross-team standardization of probe cleaning, calibration, and patterning protocols for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for different cell types, monolayer thickness, and substrate materials to maintain coplanarity.
- Includes practical limitations such as the need for air bubble-free channels and capillaries to ensure stable hydrodynamic confinement.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
6:13
Creating the Hierarchical Hydrodynamic Flow Confinement (hHFC) and Patterning Cell Monolayers Using hHFC
1:16
Microfluidic Probe (MFP) Head and Platform Cleaning and Preparation
8:10
Downstream Processing for Sampling and DNA Amplification
9:46
Results: Rapid Subtractive Patterning of Cell Monolayers Using a Hierachical HFC
10:54
Conclusion
