利用微流控探针快速减法图案化活细胞层

本视频文章所介绍方法的主要目标是快速生成具有空间定义的细胞图案，以促进对细胞间相互作用的原位时空分析。该策略利用微流控探针技术，通过微加工探针头在生物基底上对纳升级体积的生化物质进行定位，从而实现细胞单层的图案化。

基于MFP的图案化技术的主要优势在于其近乎瞬时的特性，这得益于局部裂解作用，可实现实时修改所生成的图案。我们最初产生这一方法的想法，是由于注意到其他生成细胞图案的方法在真正观察到细胞图案的成功形成之前，需要耗时且多步骤的实验流程。为了在细胞表面利用流体动力学流动限制进行稳定的实验，需要对MFP参数进行优化。

为此，视觉演示至关重要。Aditya Kashyap 和 Julien Cors 将演示该操作流程。该平台的操作模块包括电动注射器、电动载物台和控制器。

MFP 通过电动 Z 轴平台连接，以控制探头与基底之间的间隙距离，基底支架则固定在构成扫描系统的电动 X 和 Y 轴平台上。MFP 探头设有流体通路，用于连接泵送系统；设有安装孔，用于将探头固定在 Z 轴平台上；还设有通道，从抛光的顶端引出。该顶端与细胞培养基底表面设置为共面。

为准备泵站和流体处理装置，应在活细胞实验前和实验后，将注射器和注射器推杆用超纯水中的0.5%次氯酸钠溶液进行超声清洗。随后用清水彻底冲洗。将注射器尖端完全浸入水浴中，并通过推动活塞吸取水，从而用水填充注射器。

将注射器尖端置于水浴中，并使注射器杆接触注射器出口处的密封圈，排出液体。持续抽吸并排出液体，直至注射器内无可见气泡。使用低锁接头将装满液体的注射器连接至注射泵。

使用安装在泵上的切换阀，将注射器中的液体导向两个毛细管之一，分别通向MFP探头或液体储液池。根据注射器的大小，以约10至50微升/分钟的流速用注射器中的水冲洗两个毛细管，直至注射器中剩余约10微升水为止。通过超声处理清洗MFP探头：常规清洗使用玻璃器皿清洁剂，严格清洗则使用0.5%次氯酸钠溶液，清洗时间为5分钟。

将尖端浸入水中，并对通孔施加真空，用水冲洗通道。在体视显微镜下检查通道是否存在潜在堵塞，如有必要，重复上一步骤。随后，将清洗后的头部安装到头部固定装置上，并将连接器旋紧至头部。

将已吹洗的毛细管插入合适的微流控连接器适配器中，该适配器与头部的通道通孔相连接。在执行终点校准之前，将头部固定器拧紧至Z轴平台，Z轴平台用于控制头部与细胞单层之间的间隙距离，具体校准步骤如文本方案所述。通过将MFP头部移至无细胞的腔室载玻片上方，并以每步5微米的幅度缓慢下降，获得粗略的零间隙距离。

当探针与基底接触时，应观察到牛顿环。这是一种粗略的估计。准确的位置应在调整探针尖端与基底的共面性后获得。

形成牛顿环时，应确保其呈对称状。为保证探针尖端共面，通过位于探头与Z轴平台接口处的测角仪调节探头倾斜度。将微流控探针（MFP）探头从基底移开20微米，然后使用测角仪调整倾斜角度。

重复进行下降、归零和倾斜调整，直至牛顿环在接触时呈对称状态。调整好倾斜度后，将产生对称牛顿环的Z位置设为零。接下来，按照文本方案所述，准备用于内注射通道的处理液以及外注射所需的提取缓冲液。

使用排水管连接至注射泵，以 40 微升/分钟的速度排尽残留的水，并将脱气溶液吸入注射器中，直至注射器充满。这可确保注射器、连接头和毛细管中无气泡填充。为制备腔室载玻片上的细胞单层，需按照标准细胞培养方案在 T 形瓶中扩增细胞。

当细胞在培养瓶中达到汇合状态时，用胰蛋白酶消化并收集细胞。将每平方厘米0.2×10⁶个细胞接种至双室载玻片的每个腔室中用于图案化。使用其中一个腔室中的细胞作为对照，培养48小时以评估细胞生长和活力。

当腔室载玻片上的细胞达到汇合状态时，在无血清培养基中加入500微升浓度为10微摩尔的细胞示踪染料溶液，孵育45分钟，以便在图案化过程中观察细胞。使用移液器轻轻冲洗每个腔室，用PBS洗涤标记的细胞。

随后，将细胞在添加血清的培养基中培养，用于图案化实验。流体动力学流动限制通过同时注入和抽吸处理液来实现液体的局部限定。在层级限制结构中，多种处理液被分别限定，外层流体动力学流动限制区域保护样品免受内层处理液的流体动力学流动限制区域的影响。

将微流控探针（MFP）移动至细胞单层上方，使其与玻片之间的间隙距离为50微米。该间隙距离可确保分级结构HFC的有效接触，同时兼顾单层细胞表面及厚度的差异。通过I-2以每分钟六至八微升的流速注入氢氧化钠。

使用文本方案中的流速规则评估其他流速。通过注射器调节注入流速 QI-two 与 QI-one 的比例，从而调节内相 HFC 的尺寸。例如，将 QI-two 固定在 8 µL/min，QI-one 在 1.3 µL/min 至 4 µL/min 之间变化，以获得包含 150 至 300 个细胞的氢氧化钠分布区域。

为补偿hHFC运行过程中培养基的蒸发和抽吸，在MFP探头最外侧孔中以20微升/分钟的流速注入完全培养基。为实现细胞单层的图案化，将载物台软件设置为以10微米/秒的扫描速度和50微米的间隙距离，按用户自定义的图案在细胞单层上扫描探头。当嵌套式hHFC处于运行状态并与单层接触时，沿所需图案轨迹扫描MFP，以实现细胞的选择性去除。

在去除第一种细胞类型后进行共培养时，接种另一种细胞系以填补空缺，方法同前。准备用于裂解液下游分析的取样工作站。图中所示为一个取样工作站示例，包含一个三维打印的八联PCR管架。

根据实验应用所需的严格程度，使用70%乙醇或其他表面去污剂擦拭管架。使用磁性夹将管架固定在基底支架上。准备完采样站后，将MFP探头置于单层细胞上方100微米处。

使用50毫摩尔的氢氧化钠溶液作为内注射通道的处理液，以1微升/分钟的流速用于QI-1，6微升/分钟用于QI-2，-7微升/分钟用于QA-1，以及-17.5微升/分钟用于QA-2，开始操作hHFC。一旦流体限域稳定，将探针头下降至50微米的间隙距离，利用hHFC对选定的细胞亚群进行基于氢氧化钠的局部裂解。待该亚群细胞裂解完成后，将探针头移向采样站中的管路。

将收集的裂解液直接弹入PCR管中。按照文本方案所述处理裂解液后，将其加载至由仪器供应商设定的标准qPCR工作流程中。通过调控分级HFC中注射液体的比例，可调节与细胞表面接触区域的大小。

选择流速时，确保化学效应而非剪切力成为细胞裂解的主要机制。这一点通过使用计算流体动力学确定剪切力得到了验证。图中显示的是利用微流体探针（MFP）通过扫描轨迹编程生成细胞岛阵列的过程。

通过调节注射液体的比例来调控足迹大小，可控制细胞去除的分辨率。该方法可用于多种细胞群体的顺序共培养，从而生成复杂的细胞间相互作用模式。使用氢氧化钠作为处理液体，可使裂解液适用于基于PCR的细胞分析。

在此，采用所述方法对五个和一个足迹的DNA含量进行了定量分析。一旦掌握该技术，可在不到30分钟内完成对细胞的处理。在进行该操作时，需注意确保通道和毛细管中无气泡残留，因为气泡可能对高通量毛细管电泳（HFC）产生不利影响。

请注意，氢氧化钠是一种腐蚀性化学溶液，操作时可能极具危险性，因此在进行本实验操作时，必须采取安全防护措施，例如佩戴护目镜和实验服。通过本方法，可利用微流控平台（MFP）介导的裂解对细胞进行局部分析，例如通过免疫染色或DNA-RNA测序，以回答更多科学问题，例如细胞在几何限域条件下哪些蛋白质会过表达。该技术的建立将为分子生物学领域的研究人员探索组织生成与退变过程中的细胞内和细胞外信号传递提供新的途径。

观看本视频后，您应能够充分理解如何在微流控平台（MFP）中通过减法方式对细胞单层进行图案化处理，实现局部加工，并构建具有复杂几何形状的细胞共培养体系。