Name: 活细胞层的快速消减带图案微流控探头 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 了解使用微流控探头对活细胞单层进行快速消减图案化的方法。该技术通过局部细胞裂解实现实时图案修改，为细胞间相互作用的时空分析提供高效工具。

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本工作获得了欧洲研究理事会（ERC）启动基金（第七框架计划）的资助，th 欧盟框架计划（项目编号 311122，BioProbe）。我们感谢 Julien Autebert 博士和 Marcel Buerge 在本实验方案及平台开发过程中提供的技术支持与讨论。谨此感谢 Petra Dittrich 教授（苏黎世联邦理工学院）、Bradley Nelson 教授（苏黎世联邦理工学院）、Bruno Michel 博士和 Walter Riess 博士对本工作的持续支持。

1. MFP探头和平台的清洁与准备
注意：本方案使用垂直取向的硅-玻璃混合微流体探针（MFP）探头15,16。探头的硅部件包含微通道，其蚀刻深度为 100 µm。蚀刻后的硅通过阳极键合与玻璃键合。通道设计包含六个通道的图案，其中两个用于注入，两个用于抽吸，另两个用于注入浸没液体（图 1）。用于注入浸没液体的通道可补充生物样本周围的培养基，从而避免因抽吸和蒸发造成的损失。本研究中使用的内侧通道和外侧通道尺寸分别为 100 × 100 µm 和 200 × 100 µm。在完成制造与加工后，获得通道清晰、尖端经过抛光的 MFP 探头。
<ol>
	<li>泵站及流体处理装置的准备
	<ol>
		<li>使用外径为1/16英寸（1.59 mm）、内径为0.02英寸（0.51 mm）的毛细管连接所有与注射器相连的管路。根据具体应用调整毛细管尺寸，并配备合适的连接器和接头，以实现微流体探针头与注射器的连接。凡需稀释时，均使用超纯水。</li>
		<li>在活细胞实验前和实验后，将洁净的注射器（250–500 µl 容量）和推杆置于含0.5%次氯酸钠的超纯水中进行超声清洗。随后用清水彻底冲洗。将注射器尖端完全浸入水浴中，通过推杆抽吸使注射器内充满水。在水浴中，使注射器筒身接触注射器出口处的密封部位，排出液体。重复抽吸和排液操作，直至注射器柱内无可见气泡。</li>
		<li>使用鲁尔锁接头将装满液体的注射器连接至注射泵。利用安装在泵上的切换阀，将注射器中的液体导向两个毛细管之一，分别通向MFP探头或液体储液池。图6）。若无切换阀，请参见第1.4.4节。根据注射器大小，以约10 - 50 µl/min的流速用注射器中的水冲洗两根毛细管，直至注射器中剩余约10 µl水为止。</li>
		<li>将已排空的毛细管预先插入合适的微流控连接器/适配器中，该连接器与头部的通道通孔相连接例如， M1 连接器 — 参见材料部分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MFP探头制备
	<ol>
		<li>通过将MFP探头在玻璃器皿清洁剂（常规清洗）或0.5%次氯酸钠溶液（严格清洗）中进行超声处理5分钟，以清洁探头。将探头尖端浸入水中，对通孔施加真空，用水冲洗通道。</li>
		<li>在体视显微镜下检查通道是否存在潜在阻塞（堵塞），必要时重复上一步骤。</li>
		<li>将清洁的喷头安装到喷头支架上，并将已预先插入并吹洗过的管路连接器拧紧至喷头。将喷头支架固定到Z轴平台上，Z轴平台用于控制喷头与细胞单层之间的间隙距离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>校准MFP平台的扫描阶段
	<ol>
		<li>根据制造商协议，使用适当的软件界面在将MFP探头连接到平台之前对X、Y和Z轴阶段进行终点校准。校准后的阶段可确保MFP探头定位的准确性。</li>
		<li>通过将MFP探头移至无细胞的腔室载玻片上方，并以5 µm步长缓慢下降，获得粗略的零间隙距离（归零）。当探头与基底接触时，应观察到牛顿环。此为粗略估计值。精确位置需在调整探针尖端与基底的共面性后确定。</li>
		<li>为确保探针尖端的共面性，使用量角器调节头部倾斜度（位于头部与Z轴平台的接口处）。成型后应确保牛顿环对称。图1）。将MFP探头移离基底20 µm，并使用测角仪调整倾斜度。重复下降、归零和倾斜度调整，直至接触时牛顿环对称。倾斜度调整完成后，将产生对称牛顿环的z位置设为零。 
		注意：Z轴控制头部与基底之间的距离，而X-Y轴控制基底的扫描图2）。详细解释可参见我们之前的研究工作14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于局部去除细胞层的化学试剂制备 
	注意： 在适当情况下，使用安全设备（例如，腈类手套、护目镜）以处理所配制的化学品。若有必要，应在通风橱中配制溶液。所有化学品和缓冲液均须使用超纯水作为稀释剂进行配制。
	<ol>
		<li>配制 50 mM NaOH 溶液作为内注射通道（i2，流速 Q）的处理液I2 在 图1).</li>
		<li>准备外层注射所需的提取缓冲液溶液（i1，流速为 Q）I1 在 图1），包含1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）、0.5% Tween 20 和10 µM 罗丹明B，溶于pH 8的50 mM 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane）缓冲液中。清洗时，吸液注射器中使用水。</li>
		<li>使用 0.2 µm 注射器滤器过滤所有溶液。将过滤后的溶液置于真空干燥器中脱气，直至溶解的空气停止在溶液表面产生气泡。</li>
		<li>使用连接至注射泵的排液管，以40 µl/min的流速排出残留的水，并将脱气溶液吸入注射器中，直至注射器充满（250 或 500 µl）。此步骤可确保注射器、连接头和毛细管中无气泡。采用注射器–切换阀–双毛细管系统可在实验过程中中途更换并填充注射器。若无此类切换阀，则需在重新连接前，将毛细管从喷头断开，通过吸入脱气溶液的方式填充毛细管和注射器，然后再将其接回喷头。</li>
		<li>通过毛细管抽吸加工液和屏蔽液，可在操作过程中使用较小的液体体积。若化学品可预先大量配制，可直接将所需溶液注入注射器中。例如，盛装水的抽吸注射器即可采用此方法进行填充。</li>
		<li>根据1.4.1和1.4.2中定义的各通道分配液体，对MFP探头中的毛细管进行冲洗。 
		注意：提取缓冲液在内层封闭空间中屏蔽NaOH，缓冲液中的罗丹明组分有助于在操作过程中观察人毛囊细胞球（hHFC）。</li>
		<li>如果细胞过度汇合，在培养表面出现细胞聚集体，则在裂解缓冲液中添加10%蛋白酶K。当裂解液进入吸液通道时，蛋白酶K可溶解变性蛋白质，从而补充NaOH对这些聚集体的作用。这可以防止操作过程中通道堵塞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在腔室载玻片上制备细胞单层 
	注意： 在细胞培养操作中使用细胞培养罩，并按照实验室生物安全负责人制定的规定处理设备。注意特定细胞系的特殊要求，并相应调整实验方案和设备。
	<ol>
		<li>使用细胞培养箱（5% CO₂条件下）2 并在37 ºC条件下培养和扩增待图案化的细胞。使用标准细胞培养方案进行扩增17,18 在T型培养瓶中。根据特定细胞系的要求使用培养基（例如，用于培养MCF7和MDA-MB-231细胞的含血清和抗生素的DMEM培养基。</li>
		<li>当培养瓶中的细胞达到汇合时，用胰蛋白酶消化并收集细胞，接种 2×105 细胞/厘米²2 在每个双室载玻片的两个腔室中进行图案化和培养，持续48小时。将其中一个腔室中的细胞用作细胞生长和活力的对照。</li>
		<li>当细胞在腔室载玻片上达到汇合状态时，加入500 µl细胞追踪染料溶液，孵育细胞45分钟例如，绿色 - CMFDA 或橙色 - CMRA）以 10 µM 浓度溶于无血清培养基中，用于图案化过程中的细胞可视化。使用移液器轻轻冲洗每个腔室，以 PBS 洗去标记的细胞，随后将细胞转移至含血清培养基中培养，用于图案化实验。</li>
		<li>获取细胞示踪剂标记的细胞表面的参考图像，用于细胞计数。此步骤旨在确保细胞层达到融合状态，同时在以样本回收和DNA分析为目标的定量实验中可作为辅助手段。 
		注意：如果需要在图案化过程中评估细胞活力，可根据制造商说明书，使用活/死细胞毒性检测试剂盒对细胞进行染色。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 创建分级流体动力学限制（hHFC）
<ol>
	<li>将MFP移动至细胞单层上方，使其与玻片之间的间隙距离为50 µm。该间隙距离在确保hHFC接触的同时，也考虑了单层表面及厚度的变异。</li>
	<li>通过i2以6或8 µl/min的流速注入NaOH。使用图3中的流动规则评估其他流速（即，QI1、QA1和QA2）。</li>
	<li>通过调节注射器控制QI2/QI1的比率，从而调节内层HFC的尺寸。例如，固定QI2为8 µl/min，调节QI1在1.3 µl/min至4 µl/min之间，可产生覆盖150–300个细胞（每个细胞100–200 µm2）的NaOH作用区域（图3D）。</li>
	<li>从MFP头部最外侧的孔口以20 µl/min的流速注入完全培养基，以补偿操作hHFC过程中培养基的蒸发和抽吸损失。</li>
</ol>
3. 使用 hHFC 对细胞单层进行图案化
注意：扫描模式决定了从细胞单层中提取细胞的区域（减法图案化），从而保留剩余细胞以研究特定的生物学问题。该模式可以是直线或点阵等形式。复杂的图案需要设计合适的扫描轨迹。例如，棋盘式扫描轨迹可形成细胞区域的网格（如图4A所示），能够在相邻条件下研究不同刺激对各个方格内细胞的影响。这些图案可通过控制平台的X-Y载物台实现，其中控制软件允许对MFP探头在细胞单层上的扫描轨迹进行编程。
<ol>
	<li>将探头软件设置为以10 µm/s的扫描速度、50 µm的间隙距离，按照用户定义的模式（通过设定X、Y和Z坐标）在细胞单层上扫描探头。</li>
	<li>在嵌套式hHFC运行并接触单层细胞时，按照所需图案轨迹扫描MFP，以实现图案化细胞去除。</li>
	<li>在第一种细胞去除后进行共培养时，使用1.5节所述方法接种另一种细胞系以填补空隙。通过在嵌套模式和夹紧模式之间切换（例如增加间隙距离）来控制细胞去除。 
	注意：其他细胞系可能需要优化扫描速度。本演示中使用的扫描速度可使所用细胞系在扫描区域内实现完全细胞去除。</li>
</ol>
4. 样品采集与DNA扩增的下游处理
<ol>
	<li>为裂解液的下游分析准备取样站。取样站可使用3D打印的8联排PCR管架。或者，选择合适的管架作为适配器，该适配器能够安装在基底外部扫描头的扫描范围内。根据应用所需的严格程度，用70%乙醇或其他表面去污剂擦拭管架。使用磁性夹将管架固定在基底支架上。</li>
	<li>准备好取样站后，将MFP探头定位至单层细胞上方100 µm处。开始操作hHFC，以内注通道注入50 mM NaOH溶液作为处理液，QI1、QI2、QA1 和QA2 的流速分别为1、6、-7和-17.5 µl/min。
	<ol>
		<li>待流体 confinement 稳定后（约10秒），将探头下降至距样品50 µm的间隙，利用hHFC对选定的细胞亚群进行基于NaOH的局部裂解。当细胞亚群裂解完成后（每个区域约30秒），将探头移向取样站中的PCR管，直接将收集的裂解液排入PCR管中（图6）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对裂解液进行下游处理时，首先通过将裂解液与Tris缓冲液按1:1比例混合，中和溶液pH值。中和后，将裂解液在95 ºC加热30分钟。随后，按照仪器供应商设定的标准流程，直接将裂解液加入qPCR反应体系中。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们提出了一种多功能的细胞单层减法图案化方案，可快速生成空间上精确定义的细胞图案。该方法在hHFC中使用NaOH作为处理液，选择性裂解细胞单层。NaOH可瞬间变性细胞膜中所含的蛋白质。我们建议使用50 mM浓度的NaOH，以确保裂解物的下游处理顺利进行。若无需进行裂解物的下游处理，可提高NaOH浓度以实现更快的细胞去除。hHFC可确保细胞单层中未处理的周围区域不受影响，可用于进一步扩展图案或研究细胞的其他特性。
细胞去除速率取决于流体所提供的化学环境和剪切力。我们选择了一定的流速操作范围，以实现以化学作用为主导的细胞去除。采用10 - 20 µm/sec的扫描速度，并结合6 - 8 µl/min的NaOH注入流速，可实现“快速”的减法图案化。这种快速的细胞去除速率解决了基于表面打印图案化方法所面临的一些挑战20,21。这些方法需要一种机制来限制细胞在特定空间区域内的生长，例如通过微接触打印选择性地沉积细胞黏附蛋白，随后接种细胞以获得所需图案。这类方法通量较低，图案生成需要多个连续步骤，并且每种图案都需要新的模板或印章。本文所述方法无需在特定区域选择性地促进细胞生长，而是通过减法图案化替代打印方式，克服了上述多种局限，且无需对细胞培养基底进行额外处理。
通过本文所述方案，细胞单层图案化的通量得以提高，同时能够立即获得所生成图案的可视化反馈，从而便于对图案进行实时调整。这种控制能力在特定表面的细胞活力不均一的情况下可能至关重要。该方法的另一优势在于，可使用相同的针头和化学体系生成多种不同的图案，从而减少了制备图案化细胞单层所需的步骤数量。
头部通道的尺寸及头部几何结构可根据具体应用需求进行缩放，从而实现对图案化分辨率的控制。本研究中的所有实验均使用具有固定孔径尺寸的MFP头部，其内孔径为100 × 100 µm，外孔径为200 × 100 µm。选择这种外孔径较大的设计是为了确保hHFC持续运行，避免因游离的细胞碎片堵塞孔径。我们已测试了内孔径为50 × 50 µm、孔间距为50 µm的头部，并成功实现了细胞去除。使用更小的孔径（小至10 × 10 µm，间距10 µm）可进一步缩小覆盖面积（约30 × 30 µm），从而实现更高分辨率的图案化。然而，当孔径小于10 µm时，由于颗粒物堵塞，操作中出现了问题。由于此类操作困难，目前分辨率达到100 µm即为极限，这也是本方法当前的技术局限。不过，我们可通过hHFC的液流塑形能力来应对这一限制。我们已证明，对于给定的孔径尺寸，可通过调节QI2/QI1（图4b）以及尖端与基底之间的间隙10,14来调节细胞去除的分辨率。本研究所用的位移台最小步进为100 nm。结合这些可调控参数，可在覆盖面积和扫描距离方面提升细胞去除的空间分辨率。
如果希望研究不同类型细胞之间的特定细胞间相互作用，可采用本方案所述的方法进行顺序接种与图案化共培养。最终，可从裂解液中获得高质量且可扩增的DNA，这一点可通过DNA熔解曲线中单一的熔解峰得以证实（见图7）。我们通过qPCR检测发现，单个足迹区域（约300个细胞）可获得约1.6 ng的DNA量，接近理论预期值（6–8 pg/细胞）。这表明所提取的DNA量足以满足多种下游实验需求，同时无需使用任何DNA分离方法。该方法为基于DNA分析的细胞局部探测提供了新的可能性。人源杂交流体电路（hHFC）操控液体的能力还可用于将活细胞和蛋白质沉积到活化表面，结合本方案中介绍的减法图案化与顺序共培养技术，可在培养基底上构建复杂的细胞及细胞-基质排列模式。基于hHFC的细胞单层减法图案化所具备的灵活性与精确控制能力，以及对提取细胞进行DNA分析的可能性，为生物学家开展涉及细胞相互作用的高空间分辨率研究提供了一套强大的新工具。

在天然环境中，生物组织中的细胞会感知一系列生化和物理信号，从而指导其生长、排列与发育。要理解这些信号，必须对细胞间以及细胞与基质间的相互作用进行选择性研究。这就需要开发出对细胞单层进行图案化排列的方法。在体外培养中对不同类型细胞进行几何分离（即图案化）的技术，有助于广泛研究细胞生物学中的物理和化学信号。目前大多数用于细胞层图案化的技术方法1-4 依赖于在表面沉积细胞黏附蛋白或使用微加工的掩膜来实现细胞在基底上的选择性生长。相比之下，本文介绍了一种快速构建细胞单层图案的方法 原位, 即，通过去除单层培养中特定区域的细胞，实现培养细胞的减法图案化。执行此类减法图案化的技术方法5-9 通常需要特殊的基底、表面处理、复杂操作、物理接触或使用激光进行消融，从而无意中影响活细胞。本文中，我们采用微流体探针（MFP）10,11，一种非接触式扫描微流控技术，可通过流体动力学方式将液体限制在基底表面。MFP 的一个重要组成部分是包含微通道的微加工探头图1）。配套平台包括用于液体控制的注射泵、用于扫描控制的载物台，以及用于成像和反馈的倒置显微镜（图2）。在基本配置中，MFP 头包含两条在顶端带有开口的微通道，一条用于注入加工液体，另一条用于抽吸注入的加工液体以及部分浸没液体（图3A）。在MFP操作过程中，尖端与基底保持固定距离。当抽吸流速（Qa）远高于注入流速（Qi), 即，Qa:Qi≥ 2.5 时，处理液被限制在基底上，从而形成流体动力学流动限制（HFC）。处理液与基底直接接触的区域称为液足印（footprint）。在典型操作条件下，HFC 内处理液的流动具有低雷诺数特征（Re ≈ 10）-2）以及高佩克莱数（Pe ≈ 102）。这表明液体处于层流状态，化学物质的质量传递主要通过对流进行。有关流动限制的数值模型和解析模型在其他文献中已有描述。12-14.
本文采用同时限制多种处理液体的方法，称为分级HFC（hHFC）14。为了在MFP中实现hHFC，需要增加两个额外的孔径，以提供二次注入和抽吸源，从而实现一种液体被另一种液体包覆限制。内层（处理）液体由外层（屏蔽）液体保护，避免受到基底表面杂散碎片的干扰。此外，hHFC支持两种工作模式：（i）嵌套模式，即内层HFC中的处理液体与表面接触（图3B）；（ii）夹断模式，即内层液体与表面失去接触，仅有外层液体与基底接触（图3C）。通过调节探头与表面之间的间隙或改变注入流速比（Qi2/Qi1），可在两种模式间切换，从而控制基底处理的启动或停止。对于特定的通道几何结构，可通过调节流动条件来控制处理液体在基底上的作用区域（图3D）。氢氧化钠（NaOH）作为内层处理液体用于裂解细胞，裂解产物持续从表面被抽吸移除。由于处理液体的化学效应仅局限于内层HFC的作用区域，邻近细胞不受影响，从而可实现细胞间相互作用的时空研究。MFP的扫描功能可生成用户自定义几何形状的细胞图案（图4）。此外，选择NaOH作为处理液体有利于后续的DNA分析（图7）。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>微流控探针（MFP）</td><td></td><td></td><td>硅/玻璃混合探针头，通道在硅上加工成型。由IBM Research - Z&amp;uuml;rich内部完成制造</td></tr><tr><td>Lab Tek II 双腔载玻片</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>154461</td><td>用于细胞培养的双腔载玻片，每个腔室提供4 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;的培养面积，最多可容纳3 ml培养基体积</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;化学品与细胞系&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>氢氧化钠、Tris-Cl、乙二胺四乙酸、罗丹明B</td><td>SigmaAldrich chemicals, USA</td><td>S5881, 252859,&amp;nbsp; E9884, R6626</td><td>用于处理液和屏蔽液的化学品</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Qiagen, Germany</td><td>19131</td><td>用于消化变性蛋白质的蛋白酶</td></tr><tr><td>Deconex 16 Plus</td><td>Bohrer Chemie, Switzerland</td><td></td><td>适用于实验室耗材的通用清洗剂，用于非严格条件下的清洗</td></tr><tr><td>DNA away&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>7010</td><td>可使DNA和DNA酶变性的表面去污剂</td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含GLUTAMAX补充剂</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>10566-016</td><td>上皮细胞培养基</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA染料</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>C7025</td><td>细胞膜通透性活细胞标记染料，染色活性可持续72小时</td></tr><tr><td>CellTracker Orange CMRA染料</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-actin基因组qPCR引物</td><td>Integrated DNA technologies, USA</td><td></td><td>用于DNA质量验证和qPCR的定制寡核苷酸</td></tr><tr><td>MCF7乳腺癌细胞</td><td>ATCC, USA</td><td>ATCC HTB-22</td><td>用于构建共培养体系的细胞系</td></tr><tr><td>MDA-MB-231乳腺癌细胞</td><td>ATCC, USA</td><td>ATCC HTB-26</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备与流体连接件&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>电动高精度载物台</td><td>定制加工部件。&amp;nbsp; 直线轴电机来自LANG GmBH, Germany</td><td>基于LT系列定制的直线轴载物台</td><td>三轴配置使用3个&amp;times; LT模块，通过RS 232端口使用LSTEP控制器实现载物台与计算机的连接控制</td></tr><tr><td>注射器</td><td>Hamilton, Switzerland</td><td>1700 TLLX系列</td><td>可与其它厂商提供的250–500 &amp;micro;l范围注射器互换使用</td></tr><tr><td>Nemesys低压注射泵</td><td>cetoni GmbH, Germany</td><td></td><td>泵送系统组件</td></tr><tr><td>圆形M1连接器</td><td>Dolomite microfluidics, United Kingdom&amp;nbsp;</td><td>3000051</td><td>用于连接MFP探针头通孔与管路</td></tr><tr><td>倾斜/旋转台（测角仪）</td><td>OptoSigma, USA</td><td>KKD-25C</td><td>用于调节MFP探针尖端共面性的测角仪</td></tr><tr><td>DS Fi2 HD彩色相机（CCD）&amp;nbsp;</td><td>Nikon, Switzerland</td><td></td><td>通过DS-U3控制器单元进行控制</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Win - Commander</td><td>LANG GmBH, Germany</td><td></td><td>载物台控制软件</td></tr><tr><td>Qmix Elements</td><td>cetoni GmbH, Germany</td><td></td><td>泵控制软件</td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon, Switzerland</td><td></td><td>用于图像采集与分析的基础研究模块</td></tr></tbody></table>

利用微流控探针快速减法图案化活细胞层

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

微流控探针（MFP）通过限制纳升级液体体积，可在生物基底上实现局部化学操作。利用MFP的一种特定实现方式——分级流体动力学限域（hHFC），可使多种液体同时与基底接触。借助hHFC实现局部化学作用和液体形态控制，通过局部裂解并去除细胞来构建细胞图案。通过利用MFP的扫描能力，可生成用户自定义的细胞单层图案。该方案能够实现快速、实时且空间可控的细胞图案化，有助于开展选择性的细胞-细胞及细胞-基质相互作用研究。

本研究采用多组分MFP平台（图1和图2）演示了细胞单层快速减法图案化的方法。该方案利用分层级流体动力学限域（hHFC；图3）技术，以NaOH作为处理液，对细胞单层进行局部处理并去除细胞。hHFC结构由内层HFC和外层HFC组成。内层hHFC中受限的NaOH对接触的细胞产生化学作用和剪切力。在此作用区域内，由于对流驱动的质量传递，细胞均匀地受到NaOH的化学作用，而向限域区域外的扩散可忽略不计。另一方面，通过调节NaOH的流速可改变作用于细胞的剪切力。为简化操作参数，我们选择使化学作用成为细胞去除的主要机制，而非剪切力。为估算hHFC在表面施加的剪切力，我们使用Comsol Multiphysics 5.0构建了有限元模型，并采用CFD模块对层流进行模拟。针对当前实验所用的流速范围和孔径尺寸，模型设置了两个注入孔的入口边界条件和两个抽吸孔的出口边界条件（图5）。在所得模型中，流体规则决定了剪切力的分布轮廓，而流速则决定了表面剪切力的大小。实际上，二者共同决定了hHFC是否能有效接触表面。基于这些因素，我们旨在确定一个操作流速范围，以实现以化学作用为主的细胞去除。为形成hHFC，我们采用总抽吸流速与注入流速之比为3.5的流体规则。其他流体规则的设定旨在最小化抽吸通道内的堵塞，这种堵塞可能由变性蛋白质黏附在通道表面引起。通过所建立的模型，我们发现5至10 µl/min的流速对应1至3 N/m2的剪切应力。若无NaOH的化学效应（例如使用提取缓冲液时），剪切应力不足以去除细胞19。在观察到的范围内，我们注意到在较高流速下操作更为实用，因为在低抽吸流速（即，QI2 &lt; 4 µl/min）时，通道中的细胞碎片会引起流路扰动。
考虑到所研究的剪切力分布及实际因素，图案化实验采用6和8 µl/min的NaOH流速（QI2），QI1、QA1和QA2则根据图3所示的流速规则设定。进样流速之比（QI2/QI1）可进一步调节hHFC作用区域的尺寸（图3D和图4B），其基本原理由Autebert et al.14详细阐述。利用hHFC的液体塑形能力以及MFP平台的高分辨率扫描能力，我们实现了多尺度的活细胞网格生成，并进一步展示了本方案在构建共培养体系中的应用（图4C）。
该平台还允许我们进行样本裂解液回收，以用于后续分析。为了展示所获得裂解液的质量，我们在两次独立实验中分别从一个和五个足迹区域取样局部裂解的细胞，显示了从裂解液中获得的DNA数量的变化（图7）。在此，我们使用β-actin引物（正向：GGATGCAGAAGGAGATCACT，反向：CGATCCACACGGAGTACTTG）对裂解液中的DNA进行扩增，每个PCR反应使用4 µl中和后的裂解液。
<img alt="MFP 操作模块示意图；微流控、扫描、泵站设置；细胞分析。" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. MFP 平台及探头的模块组成。（A）平台的操作模块包括电动注射器、电动载物台和控制器。MFP 连接到电动 Z 轴载物台，用于控制探头与基底之间的间隙距离；基底支架则连接至 X 和 Y 方向的电动载物台，构成扫描系统。（B）MFP 探头具有用于连接泵站的流体通路、用于将探头安装到 Z 轴载物台上的安装孔，以及通向抛光顶端的通道。该顶端与细胞培养基底共面。当探头顶端与基底共面且接触时，可观察到对称的牛顿环。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="高分辨率MFP平台示意图及装置；用于精确样品分析与操作的显微镜系统。" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. MFP平台。 高分辨率扫描平台配备一个机械加工的头部固定装置，与高精度电动Z轴平台连接。基底支架连接至X-Y轴平台，用于扫描。为回收裂解液以进行后续分析，一个3D打印的采样站通过磁力夹固定在基底支架侧面（见插图）。注射泵、倒置显微镜、控制器和显示器均布置在平台周围。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="多重功能探针（MFP）示意图，展示单层、嵌套及夹闭式细胞裂解模式。技术：HFC调制、流体分析；测量单位为 μl/min。" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 分层级流体动力学限域（hHFC）实现对细胞去除的空间与时间控制。（A）单个HFC的示意图。（B）hHFC的嵌套模式与（C）夹闭模式。（D）两种不同注入/抽吸流速比下的作用区域图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞网格减法图案、脱细胞化控制图、共培养显微镜结果。" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. 使用MFP构建细胞单层的图案。（A）通过MFP在MDA-MB-231细胞单层上程序化扫描生成细胞网格。细胞用绿色细胞追踪染料染色。（B）在MCF7细胞单层上不同注射比（n）的印记。示意图显示了内层HFC形状随n变化的预期差异。（C）通过减法图案处理MCF7单层后，在去除区域接种MDA-MB-231细胞形成的图案化共培养体系。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="剪切应力与注射流速关系图，含等高线；包括剪切应力表面图分析。" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5. 应用高通量流体芯片（hHFC）时表面的剪切应力。 表面剪切应力随内层注射流速呈线性增加。最高剪切点位于两个内层孔口之间（右下角插图），此处加工液体被限制（左上角插图中的红色流线）。有限元模型中使用的孔口尺寸分别为：i1 200 µm、i2 100 µm、a1 100 µm 和 a2 200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微流控图案化与采样模式；示意图显示了注射泵、MFP探头和细胞单层。" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 6"> 
图6. MFP平台用于细胞去除与图案化的操作模式。（A）通过细胞裂解实现减法图案化的流路示意图。为简化起见，每条注入和抽吸流路仅显示一条。注射器通过泵上的排水阀进行填充。i1和i2分别用于注入提取缓冲液和NaOH。（B）裂解物回收的流路示意图。该流路在使用（A）中的流路收集细胞裂解物以用于分析后启动。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="β-actin 的 qPCR 扩增曲线和熔解曲线，显示荧光强度随循环数/温度的变化。" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 7"> 
图7. 利用qPCR对细胞裂解液中DNA进行下游分析。 （A）从5个指纹（5 fp）和1个指纹（1 fp）提取的裂解液中DNA的扩增图。两种情况均在收集裂解液后设置了对照组。（B）从裂解液中扩增得到DNA的熔解曲线，用于评估提取DNA的质量。实验进行了qPCR（N = 2，n = 3），以扩增β-actin基因。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="用于流体动力学研究和芯片实验室应用的微流控通道设计示意图。" src="/files/ftp_upload/54447/54447figS.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 S"> 
图 S1. 用于图案化实验的6通道MFP探头通道设计的缩放图像。 执行hHFC的通道宽度分别为200、100、100、200 µm，深度为100 µm。最外侧的两个通道用于补充浸没液体，宽度为500 µm，深度为100 µm。本文已提供该设计的GDS文件作为补充材料。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447figSlarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们介绍一种在表面进行活细胞单层减法图案化的实验方案。该方法通过使用微流体探针（MFP）对贴壁细胞进行局部且选择性的裂解，实现细胞图案的构建。从局部区域收集的细胞裂解液可用于后续分析，从而支持分子谱型研究。

微流控探针（MFP）通过限定纳升级液体体积，可在生物基底上实现局部化学操作。使用一种……

本视频文章所介绍方法的主要目标是快速生成具有空间定义的细胞图案，以促进对细胞间相互作用的原位时空分析。该策略利用微流控探针技术，通过微加工探针头在生物基底上对纳升级体积的生化物质进行定位，从而实现细胞单层的图案化。基于MFP的图案化技术的主要优势在于其近乎瞬时的特性，这得益于局部裂解作用，可实现实时修改所生成的图案。我们最初产生这一方法的想法，是由于注意到其他生成细胞图案的方法在真正观察到细胞图案的成功形成之前，需要耗时且多步骤的实验流程。为了在细胞表面利用流体动力学流动限制进行稳定的实验，需要对MFP参数进行优化。为此，视觉演示至关重要。Aditya Kashyap 和 Julien Cors 将演示该操作流程。该平台的操作模块包括电动注射器、电动载物台和控制器。MFP 通过电动 Z 轴平台连接，以控制探头与基底之间的间隙距离，基底支架则固定在构成扫描系统的电动 X 和 Y 轴平台上。MFP 探头设有流体通路，用于连接泵送系统；设有安装孔，用于将探头固定在 Z 轴平台上；还设有通道，从抛光的顶端引出。该顶端与细胞培养基底表面设置为共面。为准备泵站和流体处理装置，应在活细胞实验前和实验后，将注射器和注射器推杆用超纯水中的0.5%次氯酸钠溶液进行超声清洗。随后用清水彻底冲洗。将注射器尖端完全浸入水浴中，并通过推动活塞吸取水，从而用水填充注射器。将注射器尖端置于水浴中，并使注射器杆接触注射器出口处的密封圈，排出液体。持续抽吸并排出液体，直至注射器内无可见气泡。使用低锁接头将装满液体的注射器连接至注射泵。使用安装在泵上的切换阀，将注射器中的液体导向两个毛细管之一，分别通向MFP探头或液体储液池。根据注射器的大小，以约10至50微升/分钟的流速用注射器中的水冲洗两个毛细管，直至注射器中剩余约10微升水为止。通过超声处理清洗MFP探头：常规清洗使用玻璃器皿清洁剂，严格清洗则使用0.5%次氯酸钠溶液，清洗时间为5分钟。将尖端浸入水中，并对通孔施加真空，用水冲洗通道。在体视显微镜下检查通道是否存在潜在堵塞，如有必要，重复上一步骤。随后，将清洗后的头部安装到头部固定装置上，并将连接器旋紧至头部。将已吹洗的毛细管插入合适的微流控连接器适配器中，该适配器与头部的通道通孔相连接。在执行终点校准之前，将头部固定器拧紧至Z轴平台，Z轴平台用于控制头部与细胞单层之间的间隙距离，具体校准步骤如文本方案所述。通过将MFP头部移至无细胞的腔室载玻片上方，并以每步5微米的幅度缓慢下降，获得粗略的零间隙距离。当探针与基底接触时，应观察到牛顿环。这是一种粗略的估计。准确的位置应在调整探针尖端与基底的共面性后获得。形成牛顿环时，应确保其呈对称状。为保证探针尖端共面，通过位于探头与Z轴平台接口处的测角仪调节探头倾斜度。将微流控探针（MFP）探头从基底移开20微米，然后使用测角仪调整倾斜角度。重复进行下降、归零和倾斜调整，直至牛顿环在接触时呈对称状态。调整好倾斜度后，将产生对称牛顿环的Z位置设为零。接下来，按照文本方案所述，准备用于内注射通道的处理液以及外注射所需的提取缓冲液。使用排水管连接至注射泵，以 40 微升/分钟的速度排尽残留的水，并将脱气溶液吸入注射器中，直至注射器充满。这可确保注射器、连接头和毛细管中无气泡填充。为制备腔室载玻片上的细胞单层，需按照标准细胞培养方案在 T 形瓶中扩增细胞。当细胞在培养瓶中达到汇合状态时，用胰蛋白酶消化并收集细胞。将每平方厘米0.2×10⁶个细胞接种至双室载玻片的每个腔室中用于图案化。使用其中一个腔室中的细胞作为对照，培养48小时以评估细胞生长和活力。当腔室载玻片上的细胞达到汇合状态时，在无血清培养基中加入500微升浓度为10微摩尔的细胞示踪染料溶液，孵育45分钟，以便在图案化过程中观察细胞。使用移液器轻轻冲洗每个腔室，用PBS洗涤标记的细胞。随后，将细胞在添加血清的培养基中培养，用于图案化实验。流体动力学流动限制通过同时注入和抽吸处理液来实现液体的局部限定。在层级限制结构中，多种处理液被分别限定，外层流体动力学流动限制区域保护样品免受内层处理液的流体动力学流动限制区域的影响。将微流控探针（MFP）移动至细胞单层上方，使其与玻片之间的间隙距离为50微米。该间隙距离可确保分级结构HFC的有效接触，同时兼顾单层细胞表面及厚度的差异。通过I-2以每分钟六至八微升的流速注入氢氧化钠。使用文本方案中的流速规则评估其他流速。通过注射器调节注入流速 QI-two 与 QI-one 的比例，从而调节内相 HFC 的尺寸。例如，将 QI-two 固定在 8 µL/min，QI-one 在 1.3 µL/min 至 4 µL/min 之间变化，以获得包含 150 至 300 个细胞的氢氧化钠分布区域。为补偿hHFC运行过程中培养基的蒸发和抽吸，在MFP探头最外侧孔中以20微升/分钟的流速注入完全培养基。为实现细胞单层的图案化，将载物台软件设置为以10微米/秒的扫描速度和50微米的间隙距离，按用户自定义的图案在细胞单层上扫描探头。当嵌套式hHFC处于运行状态并与单层接触时，沿所需图案轨迹扫描MFP，以实现细胞的选择性去除。在去除第一种细胞类型后进行共培养时，接种另一种细胞系以填补空缺，方法同前。准备用于裂解液下游分析的取样工作站。图中所示为一个取样工作站示例，包含一个三维打印的八联PCR管架。根据实验应用所需的严格程度，使用70%乙醇或其他表面去污剂擦拭管架。使用磁性夹将管架固定在基底支架上。准备完采样站后，将MFP探头置于单层细胞上方100微米处。使用50毫摩尔的氢氧化钠溶液作为内注射通道的处理液，以1微升/分钟的流速用于QI-1，6微升/分钟用于QI-2，-7微升/分钟用于QA-1，以及-17.5微升/分钟用于QA-2，开始操作hHFC。一旦流体限域稳定，将探针头下降至50微米的间隙距离，利用hHFC对选定的细胞亚群进行基于氢氧化钠的局部裂解。待该亚群细胞裂解完成后，将探针头移向采样站中的管路。将收集的裂解液直接弹入PCR管中。按照文本方案所述处理裂解液后，将其加载至由仪器供应商设定的标准qPCR工作流程中。通过调控分级HFC中注射液体的比例，可调节与细胞表面接触区域的大小。选择流速时，确保化学效应而非剪切力成为细胞裂解的主要机制。这一点通过使用计算流体动力学确定剪切力得到了验证。图中显示的是利用微流体探针（MFP）通过扫描轨迹编程生成细胞岛阵列的过程。通过调节注射液体的比例来调控足迹大小，可控制细胞去除的分辨率。该方法可用于多种细胞群体的顺序共培养，从而生成复杂的细胞间相互作用模式。使用氢氧化钠作为处理液体，可使裂解液适用于基于PCR的细胞分析。在此，采用所述方法对五个和一个足迹的DNA含量进行了定量分析。一旦掌握该技术，可在不到30分钟内完成对细胞的处理。在进行该操作时，需注意确保通道和毛细管中无气泡残留，因为气泡可能对高通量毛细管电泳（HFC）产生不利影响。请注意，氢氧化钠是一种腐蚀性化学溶液，操作时可能极具危险性，因此在进行本实验操作时，必须采取安全防护措施，例如佩戴护目镜和实验服。通过本方法，可利用微流控平台（MFP）介导的裂解对细胞进行局部分析，例如通过免疫染色或DNA-RNA测序，以回答更多科学问题，例如细胞在几何限域条件下哪些蛋白质会过表达。该技术的建立将为分子生物学领域的研究人员探索组织生成与退变过程中的细胞内和细胞外信号传递提供新的途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何在微流控平台（MFP）中通过减法方式对细胞单层进行图案化处理，实现局部加工，并构建具有复杂几何形状的细胞共培养体系。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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我们展示了一种基于微流控的检测方法，用于测量细胞通过一系列微米级狭窄通道的通过时间尺度。...

一种用于探测细胞变形能力的微流控技术

我们展示了一种集成表面电极网络的微流控平台，该平台结合了电阻脉冲传感（RPS）与码分多址（CDMA）技术，可实现多个微流控通道中颗粒的多重检测与尺寸测量。...

用于颗粒空间追踪的多路复用电子检测微流控平台

本报告介绍了一种简单且易于操作的技术，利用低压真空将细胞和底物填充至微流控通道中，用于生物学研究。...

一种用于蛋白质和细胞图案化的多功能方法

本文介绍的方法结合微图形化技术与定量成像，以揭示哺乳动物细胞培养物中的空间组织结构。该技术易于在标准的细胞生物学实验室中建立，为体外研究模式形成提供了一个可操作的实验系统。...

利用微图形技术和定量成像技术绘制哺乳动物细胞的自组织空间结构

我们介绍一种利用微图案阵列获取单细胞荧光报告信号时间序列的方法。本方案详细描述了单细胞阵列的制备、活细胞扫描式延时显微镜的设置与操作，以及一个开源图像分析工具，用于对每个黏附位点的细胞整合荧光时间序列进行自动预筛选、可视化质控和追踪分析。...

活细胞成像单细胞阵列（LISCA）——一种用于定量细胞动力学的多功能技术

我们介绍一种利用微流控平台中毛细作用力辅助组装的技术，可将悬浮在液体中的微米级物体（如细菌和胶体）在聚二甲基硅氧烷基底上排列成预设的阵列。...

通过连续毛细辅助组装实现微生物与微粒的图案化

了解使用微流控探头对活细胞单层进行快速消减图案化的方法。该技术通过局部细胞裂解实现实时图案修改，为细胞间相互作用的时空分析提供高效工具。

利用微流控探针快速减法图案化活细胞层

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