Name: 缩微和3D微血管大会 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: 学习利用注塑成型技术构建具有生理特性的三维微血管网络，用于研究血管生物学和疾病机制。该方法可定制细胞类型与培养条件，为血管疾病研究提供可靠的体外模型。

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作者谨此致谢华盛顿大学干细胞与再生医学研究所的林恩和迈克·加维影像实验室，以及华盛顿大学的华盛顿纳米加工设施。同时感谢美国国立卫生研究院基金项目 DP2DK102258（资助 YZ）、培训基金项目 T32EB001650（资助 SSK 和 MAR）和 T32HL007312（资助 MAR）提供的经费支持。

1. 具有网络设计的图案化聚二甲基硅氧烷（PDMS）微加工
<ol>
	<li>晶圆制造以创建网络设计的负模板
	<ol>
		<li>使用任意计算机辅助设计（CAD）软件创建网状图案。确保入口与出口之间的对角线尺寸与后续步骤中壳体装置上进液口和出液口储液池之间的距离相匹配（见2.1.1）。 
		注意：图案的设计本身可根据用户的特定研究目标进行定制（参见 图1 例如模式）。</li>
		<li>使用高分辨率打印技术生成网络图案的掩模，或从商业供应商处订购铬版光掩模。有关光刻工艺的更详细方案可参见其他文献。 35.</li>
		<li>使用氧气等离子体处理对8英寸硅片进行5分钟的清洗，功率为100 W。</li>
		<li>在晶圆上倒入足量的负性光刻胶（SU-8 2,100 效果良好），使光刻胶形成直径约为 2.5 cm 的液滴。使用匀胶机，以 500 rpm 的转速、100 rpm/sec 的斜坡加速度旋转晶圆，保持 10 秒；随后以 300 rpm/sec 的加速度 ramp 升至 1,600 rpm，并维持该转速 30 秒。注意：具体转速与加速度需根据各实验室条件优化，以获得所需的光刻胶厚度 150 µm.</li>
		<li>软烤晶圆 65 °C 7 分钟内逐渐升至 95 °C 与 360 °C/小时，并维持45分钟。在加热板上缓慢冷却至室温。使用铬版光掩模，以365 nm紫外光照射，曝光量为制造商推荐值的三倍（350 mJ/cm²），将血管图案压印至涂覆的晶圆上。2 约 8 微米的 SU-8 厚度 150 µm). 
		注意：由于SU-8是一种负性光刻胶，曝光区域（除图案设计以外的所有区域）将在步骤1.1.7中对显影液产生不溶性。</li>
		<li>对曝光后的晶圆进行坚膜烘烤 65 °C 5 分钟，然后升至 95 °C 与 360 °C/小时，维持25分钟，然后在加热板上缓慢冷却至室温。</li>
		<li>将晶圆浸入SU-8显影液中10–15分钟，以去除未曝光的光刻胶，随后用异丙醇清洗，并在压缩氮气流下吹干。在光学显微镜下检查图案，确保SU-8光刻胶与晶圆表面结合良好（注意是否存在非预期的剥离或气泡）。</li>
		<li>根据制造商说明，使用轮廓仪测量图案特征的厚度 36在数据采集过程中，应避免采集对网络功能至关重要的结构区域。即， 入口和出口导管）因为接触式轮廓仪可能会破坏晶圆上已成型结构的完整性。或者，使用非接触式方法（即， 光学轮廓仪）以彻底避免此问题。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于胶原成型的图案化与平面模具的制备 
	注意：请在化学通风橱内操作硅烷。
	<ol>
		<li>将晶圆放入干燥器中 100 µl 用三氯(3,3,3-三氟丙基)硅烷处理表面2小时以进行硅烷化。</li>
		<li>将硅烷化晶圆转移至一个120 × 120 mm的方形培养皿中。将混合并脱气后的PDMS弹性体与固化剂（10:1 质量比）倒入晶圆表面，使其厚度达到4–6 mm。另取部分PDMS倒入另一个120 × 120 mm的方形培养皿中，以制备无图案的平整模具。于 65 °C 2 小时。</li>
		<li>从烘箱中取出，让PDMS冷却至室温。使用手术刀在SU-8周围小心切割出一个方形区域，并缓慢将PDMS模具从硅片上剥离。将边缘修剪至30 mm × 30 mm。对于平面模具，将未印有图案的固化PDMS切割成约40 mm × 40 mm的方形片状。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 动物饲养装置
<ol>
	<li>顶部和底部外壳部件的制备
	<ol>
		<li>使用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制备容器外壳。制备时，可向具备计算机数控（CNC）铣削能力的标准机加工车间订购零件。顶部和底部部件的示意图见图1。</li>
		<li>设计顶部外壳部件（图1D），使其底面设有一个20 mm × 20 mm、深1 mm的孔腔；在部件顶部、方形孔腔的两个对角处设有两个直径为4 mm的胶原蛋白注射口；设有两个直径为6 mm的进液和出液储液池；以及在部件四角设有四个直径为3 mm的螺钉孔。 
		注意：可根据操作需要，在部件边缘额外钻孔。</li>
		<li>设计底部外壳部件（图1E），使其中央设有一个15 mm × 15 mm的方形通孔，周围环绕一个25 mm × 25 mm、深0.25 mm的平台。钻四个带有4-40螺纹的螺钉孔。确保底部和顶部部件的螺钉孔在后续组装步骤中能够对齐。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 微血管装置的制备
<ol>
	<li>材料制备
	<ol>
		<li>清洗并高压灭菌两套镊子、一个不锈钢刮刀、一把小型平头螺丝刀、不锈钢螺丝以及若干不锈钢定位销。在制备血管结构时，还需对微图案化PDMS模具、PDMS平片、盖玻片（22 × 22 mm）和棉片进行高压灭菌。</li>
		<li>将PMMA外壳部件在漂白剂中灭菌至少1小时，然后在组织培养罩内用高压灭菌水冲洗两次，并置于无菌组织培养皿（150 mm × 25 mm）中自然晾干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>无菌聚乙烯亚胺-戊二醛（PEI-GA）包被
	<ol>
		<li>对灭菌干燥的PMMA材料内孔进行等离子处理约1分钟。将1%聚乙烯亚胺（PEI）加入PMMA材料的内孔中（上方的20 mm方形孔和下方的25 mm方形凹槽），孵育10分钟。用无菌H2在组织培养罩中晾干。 
		注意：等离子体处理所需时间因所用设备而异——PEI 应能轻易铺展，表明表面具有亲水性。若无法铺展，可能需要进一步进行等离子体处理。</li>
		<li>将0.1%戊二醛（GA）应用于PMMA片材的PEI处理表面，作用30分钟。用无菌水冲洗两次，随后静置干燥。 
		注意：在后续步骤中，胶原蛋白将通过胶原-戊二醛交联作用黏附于包被表面。这有助于在后续组装步骤及装置培养期间固定凝胶位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胶原凝胶制备
	<ol>
		<li>使用0.6%–1%的胶原蛋白溶液制备血管。为制备用于血管构建的0.75%胶原蛋白溶液，将I型胶原蛋白储备液（1.5%——源自大鼠尾部）与适当缓冲液混合 37用氢氧化钠（NaOH）、10倍浓度培养基添加剂（M199）和细胞培养基配制。所有溶液需置于冰上保存。</li>
		<li>通过以下公式确定胶原蛋白的体积，其中 Vƒinal 是所需凝胶的最终体积（通常每个装置需要1 ml胶原蛋白即足够）， V胶原蛋白储备液 是所需胶原蛋白储备液的体积， C胶原蛋白储备液 是储存胶原蛋白的浓度，以及 Cƒinal collagen 是容器中胶原蛋白的所需浓度。 
		<img alt="胶原蛋白稀释方程，Vstock = Vfinal × (Cfinal / Cstock)，用于浓度计算的公式。" src="/files/ftp_upload/54457/54457eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 1"></li>
		<li>使用1 ml注射器将适量体积的胶原蛋白储备液转移至新的30 ml锥形管中。确定中和用NaOH的体积（VNaOH），M199 10倍培养基添加剂（V10X），以及细胞培养基（V1X）如下所述，在15 ml锥形管中分别混合： 
		<img alt="稀释溶液的计算公式；V10X=0.1×V终；实验体积计算。" src="/files/ftp_upload/54457/54457eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 2"></li>
		<li>加入中和试剂混合物（V10X, VNaOH, V1X将溶液加入分装的胶原蛋白中，用小刮勺轻轻混合，直至形成均一凝胶。搅拌时应缓慢轻柔，避免产生气泡。</li>
		<li>将细胞以目标浓度加入基质中（例如， 0.5 - 20 × 10⁶ 个细胞/ml），在胶原溶液与中和试剂混合后加入细胞，并持续搅拌至细胞均匀分布。</li>
		<li>当加入细胞时，根据以下公式计算并调整细胞培养基的体积，以容纳新增的体积： V细胞 是细胞悬液所需的体积， C终末细胞密度 是容器中细胞的期望密度， C悬浮细胞密度 是原液中细胞的密度。 
		<img alt="用于体积和密度的细胞悬液计算公式，科学公式，教学用途。" src="/files/ftp_upload/54457/54457eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 3"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>胶原蛋白注射——上部组织
	<ol>
		<li>将微图形化PDMS模具置于100 mm × 20 mm培养皿中。对PDMS模具进行等离子清洗1分钟。</li>
		<li>将顶部的PMMA部件对准PDMS模具上方，使模具上的方形储液池正好位于进样口和出样口储液池的正下方（参见 图1D - 虚线）。将不锈钢圆柱销插入顶部PMMA件的进样和出样储液池孔中，以保持储液池与微通道图案之间的畅通连接。</li>
		<li>使用1 ml注射器吸取约0.5–0.6 ml胶原蛋白溶液，确保注射器内无气泡残留。</li>
		<li>用镊子轻轻按压上部外壳，以确保上部组件与PDMS模具之间紧密贴合。通过上部PMMA部件上的注射口缓慢注入胶原蛋白。检查胶原蛋白是否完全填充图案上方20 mm × 20 mm的区域，并确保无泄漏。</li>
		<li>关闭培养皿时避免晃动销钉，并静置使其凝胶化 37 °C 30 分钟孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胶原蛋白注射——底部组件
	<ol>
		<li>将一块 22 × 22 mm 的玻璃盖玻片置于底部部件中央。使用 1 ml 注射器将约 0.25 ml 胶原蛋白均匀滴加到玻璃片上。轻轻将 PDMS 平板覆盖在胶原蛋白上，确保 PDMS 与 PMMA 紧密贴合且无气泡 trapped。静置使其凝胶化 37 °C 30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设备组装
	<ol>
		<li>凝胶化后，在底部平放的PDMS片周围加入足量PBS以浸没PDMS（约1 ml）。用镊子去除边缘多余的胶原蛋白，缓慢剥离PDMS片。在胶原蛋白上方再加入适量PBS以保持水合状态。</li>
		<li>使用镊子夹起顶部的PMMA部件，将其翻转，使PDMS模具位于上方。在界面处加入几滴PBS，然后迅速而牢固地将PDMS模具从顶部PMMA部件上移除。</li>
		<li>用另一对镊子从PMMA外壳的另一侧轻轻取出不锈钢定位销。在微图形化胶原上再滴加数滴PBS。将PMMA上部组件翻转，使胶原面朝下，然后将4个螺丝插入角落的孔中。</li>
		<li>轻轻地将上部部件放在下部部件上，使螺丝与下部部件的角孔对齐。不要让两个部件相互滑动。使用螺丝刀轻轻拧紧螺丝，切勿过度拧紧。</li>
		<li>吸除PMMA表面周围的PBS，在装置的一侧边缘下方放置一小块棉球。使用移液器清除储液池中的PBS，并替换为细胞培养基。将装置置于培养箱中静置，使其凝胶结合 37°C 孵育器中孵育至少1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞接种
	<ol>
		<li>在内皮细胞生长培养基中培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs） 37 °C (CO2，O2) 至汇合 38尽可能使用第4至第7代细胞。</li>
		<li>用6 ml PBS洗涤培养瓶，随后加入2 ml 0.05%胰蛋白酶消化内皮细胞 37 °C 用胰蛋白酶消化细胞。将细胞置于胰蛋白酶中，直至大多数黏着斑解离且细胞变圆（通常需要约2 - 3分钟）。加入4 ml含胎牛血清（FBS）的内皮细胞生长培养基以终止胰蛋白酶反应。用培养基反复冲洗培养瓶数次，确保细胞完全脱落，并收集至锥形管中。</li>
		<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将其重悬于浓度为每毫升1000万个细胞的密度。移除入口和出口储液池中的所有细胞培养基。使用 200 µl 凝胶上样尖端，添加 10 µl 将细胞悬液注入入口储液池的中央。细胞应立即开始流入网络并覆盖整个网络。</li>
		<li>添加 200 µl 将培养基均等地加入两个储液池中，使细胞在微通道网络内贴壁并充分伸展，孵育至少1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设备培养
	<ol>
		<li>通过向网络中添加重力驱动流，对装置进行培养 200 µl 向入口储液槽中加入细胞培养基 50 µl 至出口储液槽。采用此培养方法时，每12小时更换一次培养基，以维持内皮细胞的活性。 
		注意：如果需要连续流动培养条件（以维持恒定的剪切应力，在出口处收集培养基）， 等等。可使用注射泵代替重力驱动培养。</li>
		<li>让接种的内皮细胞至少静置24小时，以完成贴壁和稳定，然后再施加持续流动。在建立持续流动之前，维持装置在重力驱动的流动条件下培养。 
		注意：施加流体条件下的培养基环境与重力驱动培养不同。在培养基中添加血浆代用品（如右旋糖酐）可稳定工程化微血管，防止持续灌注过程中发生血管塌陷 39.</li>
		<li>为制备连续流动系统的培养基，将3.5%的葡聚糖（70 kDa）溶解于内皮细胞生长培养基中，以获得最佳的血管培养条件。采用无菌操作技术，将含3.5%葡聚糖的内皮细胞生长培养基装入10 ml注射器中。</li>
		<li>使用电烙铁在培养皿侧壁熔出小孔，制备用于灌流的无菌培养皿。</li>
		<li>将一段12英寸硅胶管（内径1/32英寸）连接至一个鲁尔锁式接头（雌性，内径1/16英寸），另一端连接一个1/16英寸直通管对管接头，并在该接头末端连接一段1英寸长的硅胶管。将一根1/4英寸长、20号钝头针（从针座上拆下）插入1英寸管段的自由端。另准备一段3英寸长的硅胶管，一端连接管对管接头 90° 肘形连接接头（用于安装在腔室入口处）。在后续步骤中，较长的管路将穿过已准备好的培养皿，并通过20 G针头连接至3英寸管段。出口管路应与入口管路对称，末端保持开放，不连接鲁尔锁扣接头。所有组件在使用前均需高压灭菌。</li>
		<li>将已灭菌的进液管和出液管穿过预先准备好的培养皿上的孔洞。将3英寸长的管段连接到内部的20 G针头上。将鲁尔锁接头连接至装有培养基的注射器，并使用设定为高流速的注射泵将培养基灌注通过管路。确保管路和连接处无气泡存在，因为气泡会阻碍液体流向血管。</li>
		<li>将连接接头插入外壳入口。设定注射泵至所需流速，开始灌注。 
		注意：这可根据容器几何形状和所施加剪切应力的实验条件进行调整。对于 100 µm 直径通道，流速为 3 µl/min 效果良好。</li>
		<li>如需要，可将灌注液收集至含有预装出液管的无菌5 ml聚苯乙烯圆底管中 500 µl 培养基 
		注意：向收集管中加入少量培养基，以防止产生可能阻塞液体流动的气泡。</li>
		<li>根据流速不同，注射器可能需要在24至36小时后重新填充。操作方法是：将连接器从培养腔入口移除，更换注射器，并以较高速度灌注培养基数分钟，以确保无气泡进入管路。随后将泵重置为培养所需的流速，将连接器重新插入培养腔入口，并将装置放回培养箱。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 装置分析
<ol>
	<li>通透性分析
	<ol>
		<li>使用40 kDa FITC-葡聚糖观察血管通透性 原位将血管装置置于共聚焦显微镜下，聚焦于血管平面。添加 5 µM 将40 kDa FITC-葡聚糖加入入口，在4倍放大、25毫秒曝光时间、每秒1帧的条件下成像10分钟。</li>
		<li>使用分析代码分析图像序列，以估算葡聚糖穿过血管壁进入胶原的通透性µm/sec）基于 Zheng 发表的模型 等. 31.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫染色 &amp; 共聚焦成像分析
	<ol>
		<li>通过入口灌注3.7%甲醛固定血管，持续20分钟，随后用PBS灌注清洗三次（每次20分钟）。通过网络灌注含2%牛血清白蛋白（BSA）和0.5% Triton X-100的溶液，封闭非特异性抗体结合位点，持续1小时。灌注一抗溶液，4℃孵育过夜 4 °C 用PBS洗涤三次。加入二抗溶液孵育1 - 2小时，然后以相同方式用PBS再次洗涤。</li>
		<li>拍摄微血管的免疫荧光图像 原位 使用共聚焦显微镜，z轴步进为 1 µm以 4X、10X 或 20X 的放大倍数对微血管进行成像。 
		注意：4X 放大倍数可提供整体网络结构信息，而 10X 和 20X 放大倍数的图像可提供细胞层次的细节信息，例如细胞伸长、连接形成 等等.</li>
		<li>使用 ImageJ 对图像序列进行分析，包括 Z 轴投影（Image/Stacks/Z-project）、正交截面（Image/Stacks/Orthogonal view）和 3D 重建（Image/Stacks/3D Project）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描电子显微镜成像
	<ol>
		<li>用于电子显微镜分析，固定 原位 通过灌注半浓度Karnovsky溶液（含2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.2 M卡可基酸盐缓冲液）过夜。拆卸容器并小心分离两部分。修整边缘后，将组织完全浸入固定液中数天。</li>
		<li>将容器较厚的上部浸入25%戊二醛中固定20分钟，用PBS缓冲液冲洗三次，每次2分钟。依次用50%、70%、85%乙醇各洗涤2分钟，再用100%乙醇洗涤两次，每次5分钟。</li>
		<li>按照制造商的说明书，通过临界点干燥法对样品进行进一步脱水，以备分析 40用金-钯（7 nm）溅射镀膜后，在加速电压5 kV、束斑尺寸3的条件下，使用扫描电子显微镜进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

工程化微血管是一种 体外 一种可调节管腔几何结构、流体动力学力和多细胞相互作用等生理特征的模型。此类平台具有强大优势，能够在多种情境下对内皮细胞行为进行建模与研究 体外 培养条件可与特定微环境的条件相匹配。例如，已知驱动内皮细胞过程（如血管生成）的机制在不同器官以及不同病理状态下（如健康与疾病）存在差异 44因此，平面内皮细胞培养始终存在不足 6 因此，该领域在很大程度上依赖于成本高昂且耗时的动物模型。
动物模型虽然对生物医学研究的进展具有重要价值，但其研究成果往往难以有效转化至临床应用。这主要归因于小鼠与人类生物学之间的差异，尤其是在对刺激物的反应方面。 9,45因此，必须能够构建 体外 可提供额外的人类特异性数据的模型，以补充来自动物模型的信息。 体外 具有调控环境能力的平台有望模拟特定的微环境。此类系统的关键特征应包括三维结构与几何形态、细胞外基质成分（ECM）、实质细胞的邻近性与相互作用、血流以及生化刺激。工程化微血管能够整合上述所有参数...

各器官中的微血管系统有助于界定组织微环境，维持组织稳态，并调控炎症反应、通透性、血栓形成及纤维蛋白溶解 1,2微血管内皮是血流与周围组织之间的界面，因此在响应流体动力学力以及循环中的细胞因子和激素等刺激时，在调节血管和器官功能方面发挥着关键作用 3-5深入理解内皮细胞、血液与周围组织微环境之间的详细相互作用，对于血管生物学及疾病进展的研究至关重要。然而，对这些相互作用的研究进展一直受到局限 体外 不能重现的工具 体内 微血管结构与功能 6,7因此，该领域及治疗进展在很大程度上依赖于昂贵且耗时的动物模型，而这些模型往往无法成功转化为人类临床应用。 8-10。尽管 体内 在研究疾病机制和血管功能方面，模型具有不可估量的价值，但它们通常较为复杂，且往往难以精确控制单个细胞、生化和生物物理信号。
全身的血管系统具有成熟的分级结构，并伴有广泛的毛细血管床，可同时实现优化的灌注和营养物质运输 11最初，血管系统形成一个原始的血管丛，在早期发育过程中重组为具有层次性分支结构的网络 12,13尽管参与这些过程的许多信号通路已被充分阐明 14-16这种血管模式的形成机制仍不明确 15. 反过来，重现这一过程 体外 构建有序的血管网络一直具有挑战性. 许多现有的 体外 用于模拟血管系统的平台，例如二维内皮细胞培养，缺乏多种重要特征，如多细胞邻近性、三维管腔结构、流体流动以及细胞外基质。在三维水凝胶（胶原蛋白或纤维蛋白）中进行的管形成实验 17-19 或侵袭实验 20,21 已用于研究三维环境下的内皮功能及其与其他血管成分的相互作用 17,22 或组织细胞类型 23然而，这些检测中形成的管腔缺乏相互连通性、血流动力学流动和适当的灌注。此外，这些管形成检测中血管退化的倾向 24 阻碍了长期培养和成熟，限制了可开展的功能性研究程度。因此，迫切需要开发工程化方法 体外 能够适当模拟内皮细胞特征并支持长期培养的微血管网络平台。
多年来，为满足医学应用需求，已开发出多种血管工程技术，用于替代或旁路血管疾病患者的病变血管。由聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）和聚四氟乙烯（ePTFE）等合成材料制成的大直径血管在治疗上取得了显著成效，长期通畅率较高（5年平均通畅率达95%）25。尽管如此，小直径合成移植物（&#60; 6 mm）通常面临内膜增生和血栓形成等并发症26-28，而采用生物材料构建的组织工程小直径血管移植物已取得重要进展29,30。尽管如此，微尺度血管的工程化构建仍面临挑战。为了准确模拟微血管系统，必须构建具有足够机械强度以维持通畅性的复杂网络结构，同时其基质组成需允许营养物质渗透至实质细胞，并支持细胞重塑。
本方案介绍了一种新型可灌注人工血管网络，可模拟具有可调且可控微环境的天然体内环境31-34。所述方法可构建直径约为100 µm的工程化微血管。通过将内皮细胞灌注至嵌于软质I型胶原水凝胶内的微流控通道，即可构建工程化微血管。该系统能够生成具有开放管腔结构的有序网络，模拟多细胞相互作用，调控细胞外基质成分，并施加生理相关的血流动力学力。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;晶圆制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoGlow 等离子体系统</td><td>AutoGlow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Headway 旋涂机</td><td>Headway Research, Inc&amp;nbsp;</td><td>PWM32 旋涂机&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ABM 接触式光刻对准仪</td><td>AB-M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alpha Step 膜厚轮廓仪</td><td>Tencor</td><td>Alpha Step 200</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 显影液</td><td>Microchem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 光刻胶</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000</td><td></td></tr><tr><td>8&quot; 硅晶圆</td><td>Wafer World Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式微纳图形发生器</td><td>Heidelberg Instruments</td><td>&amp;mu;PG 101</td><td>用于光掩模的制作</td></tr><tr><td>加热板</td><td>VWR</td><td>97042-646</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Avantor Performance Materials</td><td>9088</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（120 × 120 mm，方形）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z617679</td><td></td></tr><tr><td>三氯(3,3,3-三氟丙基)硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MKBG3805V</td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体基料与固化剂</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>按 10:1（质量比）混合</td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z119024-1EA</td><td></td></tr><tr><td>烘箱</td><td>VWR</td><td>9120976</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;器件制备与细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）</td><td>Plexiglas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电晕处理仪</td><td>Electro-Technic Products, Inc.</td><td>BD-20</td><td>用于 PMMA 器件和 PDMS 模具的等离子体处理的手持设备</td></tr><tr><td>电烙铁</td><td>Weller&amp;nbsp;</td><td>WTCPS</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢带槽盘头机械螺钉</td><td>McMaster-Carr&amp;nbsp;</td><td>91785A096</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢定位销</td><td>McMaster-Carr&amp;nbsp;</td><td>93600A060</td><td></td></tr><tr><td>镊子&amp;nbsp;</td><td>Miltex</td><td>24-572</td><td>可使用任何类似的镊子</td></tr><tr><td>刮刀（微型勺）</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>62410-01</td><td></td></tr><tr><td>螺丝刀</td><td></td><td></td><td>可使用任何平头螺丝刀，需经高压灭菌</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片（22 × 22 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>漂白剂</td><td>Clorox</td><td>4460030966</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（150 × 25 mm）</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（100 × 20 mm）</td><td>Corning</td><td>2909</td><td></td></tr><tr><td>棉条，切成 1 cm × 3 cm 的小片</td><td></td><td></td><td>需经高压灭菌</td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺（PEI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td>用细胞培养级水稀释至 1%</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td>用细胞培养级水稀释至 0.1%</td></tr><tr><td>无菌 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td>经高压灭菌的去离子 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>溶于 0.1% 乙酸中的 I 型胶原蛋白</td><td></td><td></td><td>从大鼠尾部提取，方法见 Rajan &lt;i&gt;et. al.&lt;/i&gt; 2006（参考文献 #37）</td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>30 ml 锥形管</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>M199 10 倍培养基&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>1 N NaOH（无菌）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>用细胞培养级水稀释至 1 N</td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>来自 Leuconostoc spp. 的葡聚糖（70&amp;nbsp;kDa）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific Co.</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>凝胶加样枪头</td><td>VWR</td><td>37001-152</td><td></td></tr><tr><td>18 G 钝头填充针</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>20 G 不锈钢分配针</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A123</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 1/32&amp;rdquo; 内径，3/32&quot; 外径硅胶管</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-00</td><td></td></tr><tr><td>1/16&quot; 管对管连接头</td><td>McMaster-Carr</td><td>5116K165</td><td></td></tr><tr><td>90&amp;deg; 管对管弯头接头</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K901</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔锁紧接头（雌性，1/16&quot; 内径）</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K211</td><td></td></tr><tr><td>带齿状夹持面的塑料镊子</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>72971</td><td></td></tr><tr><td>双通道注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4505</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 聚苯乙烯圆底管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-2A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;器件分析&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806-5G</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>兔抗人 CD31 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab32457</td><td>工作稀释比为 1:25</td></tr><tr><td>FITC 标记的抗血管性血友病因子抗体</td><td>Abcam</td><td>ab8822</td><td>工作稀释比为 1:100</td></tr><tr><td>山羊抗兔 568 二抗</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>工作稀释比为 1:100</td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>H1399</td><td>溶于 DMSO</td></tr><tr><td>二甲胂酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td>用于配制 0.2 M 二甲胂酸缓冲液</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR International</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>40 kDa FITC 标记葡聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD40S&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他培养试剂&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck Chem</td><td>S2924</td><td>GSK-3 小分子抑制剂</td></tr><tr><td>人重组 VEGF</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>人重组 bFGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr></tbody></table>

三维微血管的微图形化与组装

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels 

体外研究内皮细胞和血管生物学的平台在很大程度上局限于二维内皮细胞培养、使用聚合物或玻璃基底的流动腔室，以及基于水凝胶的管状结构形成实验。尽管这些实验具有一定的信息价值，但无法重现管腔几何结构、合适的细胞外基质以及多细胞邻近关系，而这些因素在调控血管功能中起着关键作用。本文描述了一种注塑成型方法，用于构建直径约为 100 µm 的工程化血管。微血管通过在嵌入天然 I 型胶原水凝胶中的微流控通道内接种内皮细胞而制成。在通道形成前将实质细胞引入胶原基质中，可构建并研究特定组织的微环境。进一步调节流体动力学特性和培养基成分，可在目标微环境中精确控制复杂的血管功能。该平台可用于研究周血管细胞募集、血液-内皮相互作用、流动响应以及组织-微血管相互作用。工程化微血管能够分离血管微环境中各个组分的独立影响，并精确调控其化学、机械和生物学特性，从而在健康与疾病状态下研究血管生物学。

工程化血管平台可在天然Ⅰ型胶原基质内形成功能性微血管系统，并实现对细胞、生物物理及生化环境的精确调控 体外为了构建工程化微血管，将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）灌注通过嵌入胶原中的微流控网络，使其附着并形成通畅的管腔及融合的内皮层。如图所示 图1A-C，血管几何结构可被特异性设计以回答有关流速、迂曲度和分支角度等问题。通过调节微血管中的流速，可深入了解内皮细胞对剪切应力的响应。此前，制备工作主要集中在血管的 100 µm 尺寸范围，但微血管可达 500 µm 或者在某些情况下，小至 50 µm 直径已成功制备并进行培养。文中展示了长期通畅性的实例，以及在重力驱动流动条件下培养的微血管的存活情况。图2A）和持续施加的流速（图2B）。该 体内工程化微血管的类生理特性可通过多种方式加以验证。利用该平台可检测多种内皮细胞功能，包括屏障功能（图3A），细胞间相互作用与信号传导（图3B</stro...

本文介绍了一种采用注塑成型的方法来构建具有内皮生理特性的微血管。该基于微流控的技术可生成通畅的三维血管网络，并可调节流动、细胞组成、几何结构和生化梯度等参数。文中描述了该制备工艺及若干潜在应用示例。

用于研究内皮细胞和血管生物学的体外平台在很大程度上局限于二维内皮细胞培养、带有聚合物或玻璃材质的流动腔室……

使用工程化微血管的总体目标是模拟体内血管的结构和功能，以研究正常和疾病状态下的血管生理学。该方法有助于回答血管生物学领域的一些关键问题，例如不同类型的血管细胞如何响应血流刺激、它们如何影响组织功能，以及血管疾病如何随时间发生和发展。该技术的主要优势在于可轻松改造以模拟不同的器官系统和疾病状态。这可以通过改变细胞类型、基质和培养基成分以及其他变量来实现。通常，初次接触该方法的研究者在意识到可能导致血管质量不佳的常见错误之前，可能会遇到困难。该方法的可视化演示至关重要，因为在注塑成型和组装步骤中存在多个影响成功制备的关键技巧。进行此操作时，需提前准备好平板状和微图案化的 PDMS 模具以及 PMMA 外壳部件。文本方案中提供了这些部件的制备方法。将 PDMS 模具连同螺丝、销钉、镊子和刮刀一起进行高压灭菌。请勿对PMMA部件进行高压灭菌。必须在通风橱内使用漂白剂对其进行消毒。将PMMA部件在漂白剂中浸泡至少一小时后，用高压灭菌水冲洗两次以去除残留漂白剂。然后，将部件放入无菌培养皿中。吸去多余的水分，并使其自然风干。在所有部件清洁完毕后，开始实验方案：使用手持式等离子体处理仪对顶部和底部聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）部件的内侧孔洞进行处理，时间约为一分钟。关闭光源以帮助观察等离子体处理的覆盖情况。接着，将1% PEI加入内孔中。如果PEI不易铺展，可延长等离子体处理时间。PEI 反应10分钟后，移除溶液，用无菌水冲洗装置，然后使其风干。干燥后，在处理过的表面涂覆0.1%戊二醛，并让戊二醛反应30分钟。随后，用无菌水冲洗两次，并使其风干。现在，通过将预先分配的储存胶原蛋白体积与含培养基和氢氧化钠的中和溶液混合，制备用于血管制造的新鲜 0.75% 中和胶原蛋白。用刮勺缓慢而小心地搅拌，直至溶液均匀且呈橙色。然后，根据需要加入所需浓度的细胞，并继续搅拌溶液，直至细胞均匀分布。在组装过程开始前，将带有微图案的PDMS模具放入100 × 20毫米培养皿中，并用等离子体处理该模具1分钟。接着，将顶部PMMA部件对准放置在PDMS上，使方形储液池与进样口和出样口储液池对齐。然后，将不锈钢定位销插入进样口和出样口的储液孔中，以确保在注入胶原蛋白后这些孔保持开放状态。现在，将胶原-细胞混合物装入一个1 mL的注射器中，注意避免引入气泡。然后使用镊子轻轻按压顶部的PMMA片，将其固定在PDMS模具上，并缓慢向注射口注入约0.5 mL的胶原-细胞混合物。胶原必须完全填充图案上方20 mm × 20 mm的区域，且不得泄漏。然后，小心地合上培养皿，避免晃动定位销。接着，将一块22平方毫米的玻璃盖玻片放入底部PMMA部件的内孔中。随后，均匀地加入约0.25毫升的胶原蛋白溶液至玻璃表面。通过轻轻将平坦的PDMS压入胶原中，完成下半部分的组装，使其平整地贴合在PMMA上，且两者之间无气泡。现在，小心地将装置的两部分放入37摄氏度的培养箱中，静置30分钟，使胶原溶液充分凝胶化后再进行后续操作。凝胶完成后，在底部部件周围加入足量的PBS以浸没PDMS。然后，使用镊子去除边缘多余的胶原蛋白，并在用PBS保持胶原蛋白湿润的同时，缓慢将平坦的PDMS片剥离。为制备上层部分，用镊子提起PMMA和PDMS组件并翻转。随后在内表面滴加数滴PBS，迅速而牢固地将PDMS模具从上层PMMA片上剥离下来。接着，用另一把镊子轻轻移除PMMA外壳另一侧的针脚。在移除针脚前，通过上下移动针脚确保入口和出口处无多余的胶原蛋白残留。如果针脚自行脱落，只需使用另一根无菌的圆柱形针脚来确保入口和出口畅通无阻。然后，向微图案化的胶原上滴加更多 PBS，将组织片翻转，插入四个角孔中的螺钉。现在，轻轻地将上片与下片对齐，使螺钉嵌入对应的孔中。注意不要让两片之间发生滑动。然后，使用刮铲并轻轻施力，将各部件轻轻拧紧，避免过度拧紧。组装过程中务必轻柔且精准。通过加入足量的 PBS，可减少内表面之间的摩擦。拧紧螺丝时应缓慢进行，一旦遇到阻力即刻停止。接着，吸除PMMA表面周围的PBS，并在装置的一侧边缘下方放置一小块棉絮。然后，吸去储液池中的任何PBS。现在，向储液池中重新加入细胞培养基，并将装置孵育至少一小时以使凝胶形成。装置组装完成后，使用浓度为每毫升1000万个细胞的内皮细胞悬液接种装置。吸除入口和出口储液池中的培养基，然后使用带有凝胶加样枪头的20微升移液器，向入口储液池中央加入10微升细胞悬液。细胞将立即流入并覆盖整个网络。待细胞充满网络且流动达到平衡后，在两侧储液池中各加入150 µL培养基。随后将装置孵育1小时或更长时间，使细胞充分铺展并贴附。对于长期培养，每12小时更换一次培养基，向入口储液池中加入150 µL新鲜培养基，向出口储液池中加入50 µL新鲜培养基。培养24小时后，可使用注射泵建立连续流动条件。将材料移至生物安全柜后，从 autoclave 袋中取出管路并放入培养皿中。然后，通过熔化侧孔并将导管穿入，制备无菌的流式培养皿。用含有3.5%葡聚糖的培养基准备一支10毫升注射器。接着，将装有培养基的注射器连接到进样导管末端的鲁尔锁接头上。然后，将注射器固定到泵上，并灌注培养基，直至管路中所有滞留的气泡完全排出。待管路充满培养基且无气泡后，将装置转移至新的培养皿中，并将入口连接头插入 housing 入口。随后，将注射泵设定至所需的流速，开始灌注。使用18号针头和1毫升注射器将细胞培养基注入管路中，以准备出口端。夹闭管路后移除针头。然后，使用电烙铁在出口收集管的管盖上熔出一个孔。随后，向收集管中加入培养基，插入管路，并将连接接头固定到外壳出口。在整个过程中，使用夹子将培养基保留在管路中。完成后，将整个装置转移至培养箱中。根据实验条件的不同，注射器可能需要在24至36小时后重新填充。更换注射器时，应确保不要将气泡引入管路中。人脐静脉内皮细胞通过灌注进入胶原包埋的微流控网络，以形成通畅的管腔和融合的内皮层。使用了多种血管几何结构以建立不同的流动条件。采用连续流动培养条件对内皮细胞施加恒定的剪切应力。在重力驱动流动条件下培养的装置也保持了长期的活性和通畅性。这些微血管的一个关键特征是其对炎性刺激产生反应的能力。通过向微血管灌注全血来研究这一特性。未受刺激的微血管含有非活化的内皮细胞，保持静息状态。受刺激的微血管被激活，其反应启动了血栓形成。该系统的另一个有趣应用是研究由不同内皮细胞群体形成的血管系统中的表型变化。例如，由独特干细胞群体形成的微血管表现出不同的血管生成出芽能力。观看本视频后，您应能充分理解如何制备微血管，并利用其研究血管生物学以及构建复杂的模型器官系统。在尝试该操作过程中，需牢记：随着练习次数增加，血管形成的成功率将提高，实验结果也将更加稳定。一旦掌握，可在三至四小时内制备多个装置。采用此方法后，还可进行全血灌注、右旋糖酐或药物处理等其他方法，以评估内皮细胞的静息状态、通透性、药物反应性以及细胞和血管的一般形态。

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缩微和3D微血管大会

我们描述了一种用于制备微流控装置的方案，该装置可实现细胞捕获与培养。在此方法中，通过在微流控通道内设计具有特定图案的微结构（如沟槽），以形成低剪切应力区域，从而使细胞能够在其中停靠。...

一种带沟槽图案的微流控装置用于研究细胞行为

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芯片级三维细胞培养支架的微加工

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采用刮刀式组装方法制备生物膜微阵列

通过微流控喷射技术作用于液滴界面脂双层，可可靠地生成具有可控膜不对称性、跨膜蛋白整合及物质包封能力的囊泡。该技术可用于研究多种需要区室化生物分子的生物系统。...

利用微流控喷射技术生成脂质双层囊泡

本文展示了一种利用基于毛细管的离心微流控装置制备尺寸可控、单分散性水包油（W/O）微液滴的简单方法。该方法仅需少量样品体积，即可实现高产率制备。我们预计该方法将适用于快速生化分析和细胞分析。...

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本文介绍的实验方案可实现微图案的自动化制备，从而标准化哺乳动物细胞的细胞形态，用于研究细胞内的细胞骨架结构。该技术操作简便，可使用市售的成像系统进行搭建，无需标准细胞生物学实验室难以获得的专用设备。...

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传统上，细胞培养是在平面基底上进行的，而这种基底无法很好地模拟细胞的天然微环境...

通过三维细胞培养基底的紫外光图案化技术构建多线索细胞微环境

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三维微血管的微图形化与组装

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