Name: 新生儿心脏支架:再生研究新矩阵 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 了解利用新生小鼠心脏组织制备心脏支架的方法，用于再生心脏病学研究。该技术可揭示新生儿细胞外基质的独特特性，为细胞-基质相互作用研究提供新模型，助力心脏再生治疗策略的开发。

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作者们衷心感谢辛西娅·德凯女士在图表绘制方面提供的帮助。

所有小鼠实验均依照美国动物福利法进行，并经明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 小鼠心脏分离方法
<ol>
	<li>使用一次性刀片通过断头法处死新生小鼠。</li>
	<li>用70%乙醇擦拭胸部。</li>
	<li>用标准剪刀剪开胸壁皮肤，并用#5镊子向侧方牵拉皮肤，将其从胸壁分离。</li>
	<li>用剪刀在胸骨下方穿刺腹壁，进入腹腔。用#5镊子夹住剑突，向上前方牵拉胸骨，同时用剪刀剪断胸廓两侧的肋骨。用镊子将肋骨向上翻折，暴露心脏。</li>
	<li>用#5镊子向侧方钝性分离胸腺的两个主要叶，暴露主动脉弓以及上下腔静脉和肺静脉。</li>
	<li>用10 cm弹簧剪剪断主动脉弓发出的主要动脉及主动脉本身，保留心脏基底部至无名动脉之间的主动脉段。用#5镊子夹住被切断血管的断端，向前翻折心脏，使其与气管和食管分离。</li>
	<li>用10 cm弹簧剪在心脏两侧肺与心脏之间剪断肺血管系统及其他主要静脉，保持静脉开放以利于引流。</li>
	<li>用#5镊子夹住主要血管的断端，将心脏从纵隔中取出，放入含有无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的60 mm培养皿中，用于后续插管操作。</li>
</ol>
2. 通过兰格多夫灌注进行脱细胞的方法
<ol>
	<li>预先准备好导管组件。将一段 4 cm 的 PE 50 管在小型酒精火焰中拉制，以制成更小、更细的导管。用刀片修剪两端，使其达到所示尺寸（外径约 300 µm，末端带扩口，外径约 500 µm），如图 1所示。每次拉制可从两侧得到两个对称的导管。</li>
	<li>将管子的切端短暂指向火焰，使细端开口处熔化形成一个扩口。</li>
	<li>用 PBS 填充 12 ml 注射器，并通过在注射器上安装三通阀来组装导管。将一根 22 G × 1 针头连接至三通阀，并将其穿刺通过隔膜。将拉制好的 PE 管导管套入针头（图 1）。</li>
	<li>用 PBS 冲洗组装好的各部件，确保所有气泡均已排出。</li>
	<li>将按上述步骤准备好的导管插入离体心脏的主动脉中，注意不要超过主动脉瓣，并用一根 7-0 缝线结扎固定。使导管的扩口端紧靠结扎线近端，形成严密密封，防止心脏从导管上脱落。</li>
	<li>在显微放大下观察插管过程，同时使用装有 PBS 的注射器轻柔灌注心脏。确保系统无泄漏，且随着隐性血液被清除，组织均匀变白。</li>
	<li>将隔膜放入进样适配器的颈部，并通过将边缘折叠覆盖在玻璃上进行密封。</li>
	<li>通过足够长度的管路将装有 60 ml 1% 十二烷基硫酸钠（SDS）溶于重蒸水（dH2O）的储液瓶连接至系统，使液柱高度产生 20 mm Hg 的压力，如图 1所示。根据 1 mm Hg 相当于 1.3595 cm H2O 的换算关系，计算液柱高度对应的压力。 
	注意：SDS 是一种强絮凝性粉末，具有刺激性，应避免接触。操作粉末时应穿戴适当的防护服。</li>
	<li>用 1% SDS 对心脏灌注 14 小时。处理后的心脏将呈透明状，无可见残留组织。</li>
	<li>冲洗系统至三通阀处，去除残留的 SDS 溶液，并替换为 10 ml dH2O。随后依次用 10 ml 1% Triton X-100（溶于重蒸水中）、10 ml dH2O 和 60 ml 含 1× 青霉素-链霉素（Pen-Strep）的 PBS 对心脏进行灌注。</li>
	<li>将心脏保存在含 1× Pen-Strep 的 PBS 中，置于 4 °C 环境下。若去细胞化后的应用需要继续灌注，则应保留主动脉内的导管；否则剪断缝线并移除导管。</li>
</ol>
3. DNA 测定
<ol>
	<li>使用含有 200 μg/ml 蛋白酶 K、50 mM KCl、2.5 mM MgCl2 和 0.45% Tween 20 的 10 mM Tris 缓冲液（pH 8.3）对脱细胞 ECM 或对照心脏组织进行消化处理。</li>
	<li>将组织在 55 °C 条件下振荡孵育，直至组织完全溶解，通常需要 4–5 小时。</li>
	<li>采用 DNA 结合检测法对匀浆液中的 DNA 含量进行定量分析4,11。</li>
</ol>
4. 组织的固定与切片
<ol>
	<li>在室温下，用含4%多聚甲醛的PBS固定脱细胞、再细胞化或对照P3心脏30分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤组织3次。</li>
	<li>将组织置于含7.5%蔗糖的0.1 M磷酸缓冲液中，4 °C孵育至组织沉底。</li>
	<li>更换为含15%蔗糖的0.1 M磷酸缓冲液，同样在4 °C孵育至组织沉底。</li>
	<li>将组织升温至37 °C，替换一半体积为含15%蔗糖和0.1 M磷酸缓冲液的明胶溶液，并过夜平衡。明胶浓度逐步增加，依次为1%、2.5%、5%，最后两次使用7.5%。</li>
	<li>将样品置于包埋盒中，使用新鲜的7.5%明胶包埋。为恢复脱细胞样品的形态，可在包埋过程中将液态明胶灌注至心腔内。将包埋盒漂浮于液氮上进行速冻，随后在-80 °C保存。</li>
	<li>使用冷冻切片机切取厚度为10 µm的切片。将载玻片靠近切片表面，观察切片因静电处理载玻片所带电荷而从刀面转移至载玻片表面。切片在室温下干燥过夜，并于-80 °C保存以备后续分析。</li>
	<li>从冰箱中取出载玻片，恢复至室温，然后放入盛有PBS的考普林瓶中，在37 °C孵育20分钟以溶解明胶。</li>
	<li>对第4.7步获得的切片进行苏木精-伊红（H&E）染色。将载玻片放入考普林瓶中，经第4.8步水化后的切片依次浸入苏木精45秒、自来水1.5分钟、缓冲液3分钟、自来水1分钟、蓝化剂1.5分钟、80%乙醇1分钟、醇溶性伊红Y 8秒、80%乙醇1分钟、100%乙醇1分钟（两次）、透明剂（二甲苯替代物）1分钟（三次），最后用树脂封片剂封片。在显微镜下观察切片。</li>
	<li>为验证心脏ECM中细胞外基质蛋白反应性的保留情况，可对ECM结构蛋白（如IV型胶原）进行染色：将水化后的载玻片置于湿盒中，加入含0.1% Triton-X100的磷酸盐缓冲液（PBST）配制的10%正常驴血清（NDS），室温孵育1小时。使用足量液体覆盖组织切片。</li>
	<li>吸除溶液，加入以5% NDS/PBST稀释至经验优化浓度的一抗。例如，IV型胶原抗体按1:150稀释。4 °C孵育过夜。</li>
	<li>用PBST洗涤载玻片3次，加入与荧光染料偶联的二抗，按经验确定的稀释比例进行稀释。室温孵育1小时，再用PBS洗涤3次。</li>
	<li>使用含DAPI的封片剂封片，通过DAPI染色观察细胞核是否缺失，以确认无细胞残留。</li>
	<li>使用荧光显微镜在50至400倍放大下观察切片。</li>
</ol>
5. 用于再细胞化的 P1 新生小鼠心室心肌细胞
<ol>
	<li>用70%乙醇喷洒每只幼鼠，并使用一次性刀片进行断头处理。</li>
	<li>用拇指和食指固定每只幼鼠，用小型无菌剪刀沿胸骨中线剪开胸腔以暴露胸腔。施加适当压力使心脏自由突出，同时剪断大血管和心房，仅保留心室组织。</li>
	<li>将每颗心脏直接放入含有20 ml冰冻无钙、无碳酸氢盐的Hank's平衡盐溶液（含20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸，CBFHH）的50 ml离心管中，直至收集完所有心脏。</li>
	<li>吸除CBFHH溶液，向管中加入10–15 ml新鲜的冰冻CBFHH溶液。通过轻轻旋转离心管数次清洗组织。</li>
	<li>将含有心脏的溶液倾倒入60 mm塑料培养皿中。</li>
	<li>在冰上借助放大设备，用弹簧剪刀去除心脏上残留的心房组织，并将心室组织剪切成大小均一的小块。使用#5镊子移除培养皿中分离出的非心室组织。</li>
	<li>用移液器吸取适量CBFHH溶液，将组织碎片转移至含有无菌微型搅拌子的小型无菌小瓶中。</li>
	<li>让组织自然沉降至小瓶底部，随后吸除CBFHH溶液。</li>
	<li>配制50 ml酶解液：含1.75 mg/ml胰蛋白酶和20 µg/ml DNase II的CBFHH溶液。移取5 ml该酶解液加入含有剪碎心室组织的离心管中，并置于磁力搅拌器上。在室温下以恒定速度（340 rpm）搅拌8分钟。 
	注意：搅拌动作应轻柔，同时确保悬液保持悬浮状态。</li>
	<li>将小瓶从搅拌器上取下，静置3分钟使组织沉淀。用移液器吸除初次消化的上清液，因其主要含有血细胞和组织碎片。</li>
	<li>再次移取5 ml酶解液加入正在消化的心室组织中，继续搅拌8分钟，随后静置沉淀3分钟。在开始消化前，准备两个50 ml离心管（标记为1和2），每管加入12 ml冰冻胎牛血清（FBS），并在每管上方放置一个40 µm细胞滤筛。将此次上清液通过滤筛加入1号管中。</li>
	<li>重复上述消化过程共8次，交替将消化后的上清液收集至两个含FBS的离心管中。最后一次上清液等量分装至1号和2号管，以确保每管总体积相等。 
	注意：此时每个收集管中细胞悬液总体积为32.5 ml。</li>
	<li>将含有上清液的离心管在4 °C条件下以150 × g离心6分钟。</li>
	<li>在收集消化液的过程中，准备五个100 mm组织培养皿，每皿加入6 ml培养基（含10% FBS、1×青霉素-链霉素、1×L-谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基，DMEM）。将这些培养皿置于37 °C、5% CO2环境中孵育30分钟，以平衡培养基。</li>
	<li>吸除CBFHH酶混合液，将细胞重悬于上述制备的30 ml培养基中，并合并两个收集管中的细胞。</li>
	<li>将6 ml细胞悬液分别回加至每个100 mm培养皿中，在37 °C下孵育45分钟。</li>
	<li>孵育结束后，将未贴壁细胞转移至5个新培养皿中，再次孵育45分钟（成纤维细胞组分将开始贴壁，可根据需要单独培养）。</li>
	<li>第二轮预贴壁结束后，收集各培养皿中的培养基及未贴壁细胞，于150 × g离心6分钟。</li>
	<li>吸除多余培养基，调整细胞至所需浓度（每100 µl灌注液中约含4.0 × 105个细胞）。取部分细胞悬液用于计数或活力检测14。</li>
</ol>
6. P3 心脏基质的生物反应器再细胞化
<ol>
	<li>在添加细胞前，用培养基（参见步骤5.15）对分离的心脏基质进行过夜预处理。</li>
	<li>按照图2所示组装Langendorff系统的各个部件。将玻璃部件进行高压灭菌，塑料部件采用环氧乙烷灭菌，以确保无菌。系统各子单元可在超净台内完成组装，再安装至支撑架上。为清晰起见，图中省略了循环水浴及加热水流路径。</li>
	<li>向组装好的系统中加入120 ml组织培养基（参见步骤5.15）。</li>
	<li>将步骤2.14中已插管的心脏基质置于60 mm培养皿中，在显微放大条件下，将装有步骤5.20所得细胞悬液的1 ml注射器（配22 G × 1针头）连接至导管。确保该装置中无气泡，以避免造成心脏栓塞。</li>
	<li>通过冠状动脉将100 µl细胞悬液缓慢灌注至心脏基质中。灌注完成后，取下注射器与针头组合。 
	注意：需以约每分钟20 µl的缓慢速度进行灌注，以防止细胞随静脉血流流出心脏。</li>
	<li>将固定在生物反应器心脏罐盖底部Luer接头上的22G钝头插杆插入导管中，推动导管套牢于插杆上。</li>
	<li>启动蠕动泵，观察灌注流路是否如图2所示。液体从储液罐经泵驱动，通过气泡捕获器，流向步骤2.5中置于主动脉内的导管（图2中的红色路径）。观察心脏循环液从静脉流出，并从心尖滴落，回流至培养基储液罐。 
	注意：灌注流速取决于个体因素，如构建物的血管阻力和心脏大小，但50至100 µl/min是一个合适的起始范围。在中间时间点可进行功能评估。由于新生大鼠再细胞化心脏的尺寸较小，限制了可执行的评估手段，但我们已确定基于光学的系统可用于量化搏动行为，正如其在成年大鼠心脏中的应用一样。4 该构建物可进行长时间灌注（最长可达23小时）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该技术依赖于对心脏的反复灌注，因此避免栓塞是获得成功结果的关键环节。从步骤2.2-2.6中心脏的初始插管，到步骤2.8-2.14之间溶液的更换，每一个操作步骤均可能引入气泡，从而影响灌注液向心肌组织的正常流动。由于新生心脏体积微小，即使血管系统中存在极微小的气泡，也可能导致技术性梗死，从而使脱细胞过程不完全。此外，在后续的洗涤步骤中，灌注不充分可能导致去垢剂残留，进而对生物相容性产生负面影响。而且，温度的快速变化（例如按照步骤2.14建议将基质从4 °C储存环境中取出时）也需谨慎处理，因为温度改变可使溶解的气体析出形成气泡。在进行再细胞化操作时，配制细胞悬液的注射器应特别注意确保灌注过程中无气泡（步骤6.4）。
可能需要调整本方案的具体参数以适应其他类型的组织。已有多种脱细胞化方案被报道4,9,11，可提供参考。任何脱细胞化方案的最终目标都应包括维持细胞外基质（ECM）蛋白结构及相关生化特性，并充分去除天然细胞成分，后者可通过残留DNA的含量来评估。在此背景下，过高的灌注压力会导致ECM超微结构的破坏，这一现象可通过组织学方法观察到。
<p class...

心力衰竭是一种常见且致命的疾病。它是一种进行性疾病，会导致心脏收缩功能下降，从而损害向器官的血液供应，无法满足机体的代谢需求。据估计，美国有570万人患有心力衰竭，且它是美国住院治疗的主要原因9。在美国，治疗心力衰竭患者的总费用每年超过3000亿美元9-10。终末期心力衰竭的唯一根治性疗法是原位心脏移植。据估计，每年美国需要超过10万个供体心脏用于心脏移植手术1-2。由于供体数量有限，美国每年仅能实施约2400例心脏移植手术2。显然，必须解决器官短缺问题，因此需要开发其他策略以获得更多可用于移植的器官，理想情况下这些器官应为自体来源，以避免排斥反应及终身免疫抑制所带来的并发症。
哺乳动物成体心肌细胞在损伤后表现出有限的再生能力，但最近的研究表明，哺乳动物新生心脏在损伤后仍具有显著的再生能力5-8。具体而言，在出生至出生后第7天之间存在一个再生时间窗口，该窗口可通过部分外科切除术诱导发现。这一再生阶段的特征包括无纤维化瘢痕形成、新生血管生成、心外膜释放促血管生成因子以及心肌细胞增殖5-8,11。这一短暂的再生时间窗口为利用新生心脏作为构建生物人工心脏的新型材料来源提供了潜在可能。
已知细胞外基质可提供重要的信号，以促进心肌细胞的增殖与生长。已有研究探讨了新生期和成年期基质中分子可及性的显著差异及其促进再生的能力12，并进行了探索13。脱细胞化的成年基质已在多项研究中被用作细胞重植和构建生物人工心脏的细胞外基质支架。尽管这些研究以及干细胞技术的新发现正在快速推进，但仍存在若干尚未克服的障碍。例如，在基质天然结构的保存、细胞向基质壁的整合能力，以及支持细胞增殖和生长的能力等方面均存在局限，限制了该方法的成功。尽管新生心脏被认为具有更优越的再生特性，但使用此类组织的实际操作困难限制了对其的深入探索。
基于新生心脏已证实的再生能力，我们通过建立一种针对出生后第3天（P3）小鼠心脏的脱细胞技术，开发出了新型基质。选择P3阶段的心脏进行本研究，是因为该时期处于心脏再生的时间窗口内（此前已确定6），同时心脏体积足够大，便于获取、脱细胞处理及再细胞化。本研究的目标是验证从新生小鼠心脏构建基质的可行性。我们的研究结果证明，尽管新生心脏体积微小，仍可成功实现脱细胞，并在过程中维持细胞外基质（ECM）的结构完整性和蛋白质成分的完整性。我们还展示了将表达mCherry的心肌细胞再接种至该心脏ECM中的能力，并在再细胞化后检测了这些心肌细胞对多种心脏标志物的表达情况。该技术将有助于评估新生心脏基质在构建生物人工心脏方面的优越性。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1. 小鼠心脏分离所需材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>P1 小鼠幼崽（如图所示；B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J）</td><td>Jackson Laboratories</td><td>21577</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 pH 7.4（无菌）</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>一次性刀片</td><td>Stanley</td><td>28-510</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>标准剪刀</td><td>Moria Bonn（Fine Science Tools）</td><td>14381-43</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>弹簧剪刀 10 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪刀 - 3 mm 刃口</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>#5 镊子</td><td>Dumnot（Fine Science Tools）</td><td>11295-00</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. 脱细胞化所需材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>进样接头</td><td>Chemglass</td><td>CG-1013</td><td>可高压灭菌</td></tr><tr><td>隔垫</td><td>Chemglass</td><td>CG-3022-99</td><td>可高压灭菌</td></tr><tr><td>内径 1/8 英寸 × 外径 3/8 英寸 C-Flex 管</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06422-10</td><td>可高压灭菌</td></tr><tr><td>公鲁尔接头转 1/8&quot; 软管接头</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K33</td><td>可高压灭菌</td></tr><tr><td>母鲁尔接头转 1/8&quot; 软管接头</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K26</td><td>可高压灭菌</td></tr><tr><td>Prolene 7-0 外科缝合线&amp;nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>8648G</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>铁架台</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47807</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>夹子</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-6Q</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>夹子常规支架</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-754Q</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>60 cc 注射器筒体&amp;nbsp;</td><td>Coviden</td><td>1186000777T</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>烧杯</td><td>Kimble</td><td>14000250</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>22 G × 1 注射器针头</td><td>BD</td><td>305155</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>12 cc 注射器</td><td>Coviden</td><td>8881512878</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>Smith Medical</td><td>MX5311L</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>PE50 管</td><td>BD Clay Adams Intramedic</td><td>427411</td><td>必须可通过加热塑形。推荐使用聚乙烯材质。</td></tr><tr><td>1% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>推荐使用超纯级。使用前新鲜配制并过滤除菌。</td></tr><tr><td>1% Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>使用 10% 储存液新鲜配制，并在使用前过滤除菌。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>无菌 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td>或 MilliQ 系统纯化水。</td></tr><tr><td>1× 青霉素/链霉素</td><td>Corning CellGro</td><td>30-001-Cl</td><td>或同等产品&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. DNA 定量所需材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Fisher</td><td>BP1700</td><td>&gt;30 U/mg 活性</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt</td><td>5958-04</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Tween 20&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Tris 碱/盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503/T5941</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Pico-Green dsDNA 检测试剂盒</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>P7589</td><td>需使用荧光计读数</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. 组织固定与切片方法&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>猪皮来源 A 型明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>必须为 300 bloom 或更高</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;5. 组织学方法&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>冷冻模具 10 × 10 × 5 mm</td><td>Tissue-Tek</td><td>4565</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Hacker/Bright</td><td>Model OTF</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>显微镜载玻片&amp;nbsp; 25 × 75 × 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-19</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>苏木精 560&amp;nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&amp;nbsp;</td><td>3801570</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Define</td><td>Surgipath/Leica Selectech&amp;nbsp;</td><td>3803590</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>蓝色缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&amp;nbsp;</td><td>3802915</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>醇溶性伊红 Y 515&amp;nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&amp;nbsp;</td><td>3801615</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Formula 83 二甲苯替代品&amp;nbsp;</td><td>CBG Biotech&amp;nbsp;</td><td>CH0104B</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Permount 封片介质&amp;nbsp;</td><td>Fisher Chemical&amp;nbsp;</td><td>SP15-500</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>IV 型胶原抗体</td><td>Rockland</td><td>600-401-106.1</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-肌动蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>AB9465</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>mCherry 抗体</td><td>Abcam</td><td>AB205402</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>NKX2.5 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8697</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>驴抗小鼠 AF488 抗体</td><td>Life Technology</td><td>A21202</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>驴抗鸡 AF594 抗体</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-585-155&amp;nbsp;</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>驴抗山羊 CY5 抗体</td><td>Jackson Immunoresearch&amp;nbsp;</td><td>705-175-147</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Fab 片段山羊抗兔 IgG（H+L）AF594</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-587-003</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;6. 使用预铺板法分离新生大鼠心室心肌细胞&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>HBSS（无钙、无镁）</td><td>Hyclone</td><td>SH30031.02</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>HEPES（1 M）</td><td>Corning CellGro</td><td>25-060-Cl</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Primeria 100 mm 培养板</td><td>Corning</td><td>353803</td><td>Primeria 表面可增强成纤维细胞贴附，从而提高心肌细胞纯度</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Difco</td><td>215240</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>DNase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8764</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>DMEM（Dulbecco 改良最低必需培养基）</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>维生素 B12&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6629</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>纤维连接蛋白包被培养板&amp;nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>354501</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>心脏生物反应器玻璃器皿</td><td>Radnoti Glass Technology</td><td>120101BEZ</td><td>必须可通过高压灭菌或气体灭菌。</td></tr></tbody></table>

新生心脏支架：再生研究中的新型基质

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

治疗终末期心力衰竭的唯一确切方法是原位心脏移植。据估计，每年在美国进行心脏移植手术需要超过10万个供体心脏1-2。由于供体数量有限，美国每年仅能实施约2400例心脏移植手术2。迄今为止，已尝试多种方法，包括细胞治疗研究和植入机械辅助装置，单独或联合应用，旨在促进心脏自我修复或使衰竭的心脏得到休息3。尽管如此，目前心室辅助装置仍主要用于移植前的过渡治疗，而细胞治疗虽然具有一定的治愈潜力，但其应用仍局限于临床试验阶段。此外，异种直接移植也曾被尝试，但由于免疫排斥反应，成功率有限。显然，迫切需要另一种策略来制造可供移植的额外器官，理想情况下这些器官应为自体来源，以避免排斥反应及终身免疫抑制所带来的并发症。脱细胞化是一种去除组织中固有细胞以暴露天然细胞外基质（ECM）或支架结构的过程。灌注法脱细胞化可在保持组织大部分力学特性完整的同时，完整保留其三维结构4。这些支架可用于接种健康细胞，以构建研究模型，甚至可能生成急需的移植用器官。我们对新生小鼠（P3期）心脏进行了去污剂介导的脱细胞化处理，该阶段小鼠心脏已知具有显著的心脏再生能力5-8，并使用小鼠心肌细胞对所得支架进行再细胞化。这些研究证实了构建新生期心脏结构的可行性，同时也为进一步探索出生后早期心脏ECM是否含有可促进更优再细胞化策略的生物学信号提供了可能。

脱细胞化 
根据该方案，以出生后第3天（P3）新生小鼠心脏为例，平均心脏重量为23 mg时，完成脱细胞化过程平均约需14小时。
无细胞性 
图3a展示了一个完全完整的小鼠出生后第3天（P3）新生心脏（整体封片）。图3b显示同一心脏经去细胞化处理后的结果。图4a和图4b分别为完整心脏和去细胞化心脏的苏木精-伊红染色结果。注意去细胞化心脏中苏木精阳性的细胞核消失，嗜伊红结构明显减少。此外，去细胞化心脏的DNA含量从完整心脏的68.08 ± 2.25 µg（n=6）显著降低至4.73 ± 2.27 µg（n=5）。
胶原蛋白免疫反应性 
在脱细胞后维持细...

在这些研究中，我们提供了一种用于再生研究的新型新生小鼠心脏支架的方法学。

治疗终末期心力衰竭的唯一确切疗法是原位心脏移植。据估计，每年有超过100,000名供体……

本方法学的总体目标是从新生小鼠心肌组织中制备新型支架材料，用于再生医学研究。该方法有助于解答再生心脏病学领域的关键问题，为细胞-基质相互作用的研究提供一种新颖的模型，因为该细胞外基质来源于具有增殖能力的心肌组织。该技术的主要优势在于能够发现新生儿细胞外基质的新特性。演示该操作的将是本实验室的技术员 Stefan Kren。在开始操作前，将一段四厘米长的PE 50导管置于小型酒精火焰上加热，以制成更细、更短的导管。将两端修剪至适当尺寸，从PO的每一侧制备两根对称的导管，并将导管的一端短暂放入火焰中，使较细端开口处熔合一个凸缘。接下来，用12毫升PBS充满注射器，并在注射器上连接一个三通旋塞。将一根22号针头连接到旋塞上，并将针头穿过隔膜。然后，将PE导管套在针头上，并用PBS冲洗装置。当导管装置准备就绪后，用70%乙醇擦拭新生鼠的胸部。接着使用标准剪刀剪开胸部皮肤，同时用5号镊子向外侧牵拉组织。接下来，在胸骨下方稍下方处穿刺腹壁，并用镊子夹住剑突。在剪断胸部两侧肋骨的同时，将胸骨向头侧牵拉，并将肋骨向上翻折。当心脏可见时，横向牵拉胸腺以分离其两个主要叶，暴露主动脉弓以及腔静脉和肺静脉。使用10厘米长的弹簧剪，横断主动脉弓的主要动脉以及主动脉本身。抓住被切断血管的断端，将心脏向前翻转，使其与气管和食管分离，并在肺与心脏之间以及心脏两侧剪切，以横断肺血管系统及其他主要静脉。然后，抓住主要血管的断端，将心脏从纵隔中取出，并置于含有无菌PBS的60毫米培养皿中。为了对心脏进行脱细胞处理，将培养皿置于解剖显微镜下，将导管组件的针头插入主动脉，直至但不超过主动脉瓣。用一根7-0缝线固定针头，使导管的近端指状部分紧贴缝线并形成紧密密封，然后用PBS轻柔灌注心脏。若无泄漏，随着残留血液被清除，组织将均匀变白。将隔膜放入进样适配器的颈部，并将隔膜边缘折叠覆盖在玻璃上。然后，通过足够长度的管路连接一个装有60毫升1%十二烷基硫酸钠（SDS）水溶液的储液器，使液柱产生20毫米汞柱的压力，对心脏进行持续14小时的SDS灌注。灌注结束后，心脏将呈半透明状，无可见残留组织。用剩余的SDS溶液冲洗系统至旋塞处，并向储液瓶中加入10毫升去离子水。随后，依次用10毫升1% Triton X-100、10毫升去离子水以及含青霉素和链霉素的60毫升PBS冲洗心脏。最后一次灌注完成后，将心脏置于含抗生素的PBS中，于4摄氏度保存。为了对组织进行再细胞化，将带有导管的心脏基质在解剖显微镜下转移至60毫米的培养皿中，并将装有目标细胞、配有22号针头的1毫升注射器连接到导管上。确认装置内无气泡，然后通过冠状动脉以每分钟20微升的速度缓慢灌注细胞悬液进入心脏基质。当输送100微升细胞后，取下注射器，将导管推入固定在生物反应器心脏罐盖底部鲁尔接头上的22号钝头针座中。现在启动蠕动泵，确认液体流动方向为从储液器经泵流经气泡捕集器到达导管，并且心脏循环液从静脉流出，由心尖滴下，回流至培养基储液器。这些图像显示了完整心脏和脱细胞心脏的苏木精-伊红染色结果。注意观察脱细胞心脏中苏木精阳性细胞核的缺失以及嗜伊红结构的减少。为了评估新生小鼠完整心脏及脱细胞心脏中外源性基质的成分，免疫染色结果显示，IV型胶原在完整心脏和脱细胞心脏中均呈强表达，且该蛋白的定位在细胞去除后仍得以保留，而DAPI阳性的细胞核则被有效清除。新生小鼠心脏经基于去垢剂的脱细胞处理后，DNA含量亦显著降低，这与既往在其他组织中使用基于去垢剂脱细胞方法的报道一致。在这些图像中，可观察到已迁移至左心室壁内的再细胞化心肌细胞。灌流后长达23天，这些迁移的细胞可能对心脏前体细胞标志物、mCherry、分化的心肌细胞标志物或DAPI呈阳性，其中大多数细胞同时表达这四种标志物。一旦掌握，该技术若操作得当，可在34小时内完成。在进行该操作时，重要的是务必注意避免通过灌流装置引入空气而导致心脏栓塞。通过该方案，可利用凝胶制备与三维打印技术在体外构建具有增殖能力的移植物，甚至制造三维心脏。该技术可为研究人员促进心脏再生提供新的途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对新生小鼠心脏进行脱细胞与再细胞化处理。请注意，使用十二烷基硫酸钠可能存在危险，操作干燥粉末状试剂时，应始终采取防护措施，例如佩戴N-95口罩或在通风橱中进行操作。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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用于心肌组织工程的生物来源可注射材料的制备

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为了构建高度有序的复杂组织结构，必须将多种材料和细胞类型组装成一个整体复合物。这种组合设计结合了器官特异性的分层细胞片，以及两种不同的生物来源材料，后者包含强韧的纤维基质基础和内皮细胞，以促进新生血管的形成。...

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用于研究内皮-间充质转化的新生大鼠异位心脏移植模型

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