Name: 多式联运定量相成像数字全息显微准确评估肠道炎症和上皮伤口愈合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学习数字全息显微技术用于肠道炎症和上皮伤口愈合的无标记定量评估。该方法利用Caco-2细胞培养实现自动化成像，为炎症性肠病研究提供客观数据。

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我们感谢 Faekah Gohar 对稿件的校对。我们感谢 Sonja Dufentester 和 Elke Weber 提供出色的技术支持。

所有动物实验均根据德国动物保护法，经地区伦理委员会（德国北莱茵-威斯特法伦州自然、环境与消费者保护局，LANUV）批准。明斯特大学本地伦理委员会批准了将人体组织用于组织学和显微镜分析。
1. 动物与材料
<ol>
	<li>使用体重为20至25克的所需DSS敏感品系的雌性或雄性小鼠，并根据当地动物护理法规进行饲养。提供啮齿类动物专用饲料和经高压灭菌的饮用水 随意摄取.</li>
	<li>诱导 急性 通过在高压灭菌的自来水中添加3%（w/v）葡聚糖硫酸钠（DSS，分子量：36,000-50,000 Da）连续饮用5天，建立DSS结肠炎模型。 
	注意： DSS 的效价因生产商和批次的不同而存在显著差异。在使用供应商提供的 DSS 诱导疾病活性前，应先行测试其效果，每日体重变化可作为可靠且客观的指标。</li>
	<li>为进行结肠组织样本的组织学评估，通过 CO₂ 处死小鼠2 实验结束时进行吹入（或根据国家和机构指南规定进行）。</li>
</ol>
2. DSS结肠炎的实验设置及 体外 伤口愈合实验
<ol>
	<li>细胞培养与伤口愈合实验的建立
	<ol>
		<li>在95%湿度和5% CO₂条件下培养Caco-2细胞2 37 °C 环境下培养。使用含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素的 RPMI 培养基。</li>
		<li>以 4 x 10 的密度接种 Caco-2 细胞5 细胞/厘米²2 在35 mm带有高培养插件的培养皿中（参见 图 4A). 
		注意： 插入物可形成两个被细胞覆盖的区域，二者之间由一段定义明确的无细胞区域分隔，该区域代表待分析的损伤区域。</li>
		<li>接种后两天更换培养基。先用自动移液器吸除含细胞碎片的残留培养基，用100 µl磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，然后加入新鲜的RPMI培养基或无血清培养基。</li>
		<li>在无血清培养基（含0.1% FBS）中培养细胞24小时，并补充20 ng EGF/ml血清或2 µg mitomycin c/ml血清，以检测伤口愈合行为的变化。对照组细胞加入正常RPMI培养基培养24小时。</li>
		<li>培养24小时后，按照步骤3.4所述移除并丢弃培养插件，然后进行数字全息显微成像（DHM）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>急性DSS结肠炎的诱导
	<ol>
		<li>将3 g DSS溶解于100 ml高压灭菌水中，配制成3%（w/v）的DSS溶液。将该溶液替代饮用水给予小鼠 随意摄取 持续7天。每只小鼠每天给予5 ml DSS溶液。对照组小鼠给予高压灭菌水，不含DSS。 随意摄取.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠和人类结肠的冷冻切片制备
	<ol>
		<li>通过 CO 处死小鼠2 实验结束时进行充气。</li>
		<li>通过剖腹手术解剖动物的腹部23用镊子小心取出整个结肠，使用手术剪切除回肠端和直肠端。沿盲肠至直肠方向用剪刀纵向剪开结肠并展开。用镊子清除标本中的全部粪便，随后用PBS冲洗。24.</li>
		<li>用棉签从盲肠端到直肠端纵向卷起整个结肠，使黏膜朝内弯曲，制备成瑞士卷状。将结肠组织样本包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并于-80 °C冷冻保存，待后续使用。</li>
		<li>将手术标本中的人结肠组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并于-80 °C冷冻保存，待后续使用。</li>
		<li>使用冷冻切片机在检测前立即对OCT包埋的标本进行7 µm厚度的切片。 
		​注意： 最佳样本厚度取决于所研究组织类型的持久性和散射特性。对于使用结肠组织的所述实验，切片厚度 &gt; 10 µm 会因光散射导致定量数字全息显微相位对比图像中噪声显著增加，而厚度较大的样品 &lt; 5 µm的切片在冷冻切片过程中更容易产生由损伤引起的假象。</li>
		<li>将切片转移至玻璃载玻片上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数字全息图采集与评估的技术设备、软件及操作流程
<ol>
	<li>用于定量细胞与组织成像的数字全息显微镜
	<ol>
		<li>使用离轴马赫-曾德尔数字全息显微系统进行活细胞成像25，如图所示 图1确保显微镜配备10倍物镜、可固定直径为35 mm的玻璃载玻片和培养皿的载物台、用于维持37 °C生理温度的加热腔室，以及用于定量相位成像的软件。25. 
		注意： 例如，如Kemper所述 等26 和 Langehanenberg 等27. 
		注意： 或者，使用功能类似的系统，该系统能够对活细胞和分离的组织切片进行明场显微成像和定量相位成像。</li>
		<li>用镜头清洁纸和清洁剂清洁显微镜镜头和聚光镜（例如， 乙醇），以去除灰尘或其他污染物，具体操作请遵循显微镜制造商的建议。</li>
		<li>启动DHM显微镜的图像采集软件，选择“明场”成像模式，并打开白光照明。在图像采集软件的实时成像窗口中观察样本时，按照显微镜制造商的建议确保样本处于科勒照明状态（此步骤也可使用标准图像采集软件）。 
		注意： 视野内的图像强度应均匀分布，且在使用显微镜的聚焦驱动进行光学重新对焦时，样品位置不应发生移动。</li>
		<li>选择“DHM”成像模式，关闭白光照明，打开激光光源。检查激光照明是否均匀即，确保DHM显微镜成像采集软件的活体成像窗口内光照强度分布均匀，并观察到所捕获图像（数字全息图）中出现具有足够对比度的离轴载波干涉条纹图案。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于数字全息显微成像的冷冻切片制备
	<ol>
		<li>从冷冻箱中取出样本（载玻片上的冷冻切片，厚度：7 µm，如2.3节所述）。在室温及正常大气条件下解冻约5分钟。</li>
		<li>用移液器将50 - 100 µl磷酸盐缓冲液（PBS）作为包埋介质加至组织切片上，直至切片完全被缓冲液覆盖。用洁净的玻璃盖玻片（厚度170 µm）覆盖样品。 
		注意：过度干燥可能导致样品的折射率和散射特性发生显著变化。</li>
		<li>确保玻璃载片和盖玻片底部清洁无灰尘及其他可能引起光散射的污染物。样品现已准备好用于明场显微镜和数字全息显微镜（DHM）观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用数字全息显微镜对组织切片进行定量相位成像
	<ol>
		<li>打开数字全息显微镜，选择10倍物镜进行成像。启动DHM显微镜的图像采集软件，并选择明场成像模式。</li>
		<li>将组织切片按照第2)步所述放置于显微镜载物台的玻片夹中，盖玻片朝向显微镜物镜。</li>
		<li>打开数字全息显微镜的明场照明。通过显微镜载物台调整样本位置，确保目标组织区域在实时监控窗口中可见。使用显微镜的聚焦驱动装置优化图像清晰度。 
		注意： 除了目标区域外，视野中还应包含一片无组织的载玻片区域。</li>
		<li>使用图像采集软件拍摄样本的明场图像，确保样本清晰对焦。</li>
		<li>选择“DHM”成像模式，关闭白光照明，开启激光照明。选择全息记录的“曝光时间”低于3 msec，观察成像采集软件实时成像窗口中出现具有足够对比度的全息离轴干涉条纹，并采集一幅数字全息图。</li>
		<li>重复步骤 3.3.3 - 3.3.5，直至记录到足够数量的不同样品区域的明场图像和数字全息图。全息图采集现已完成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DHM成像用伤口愈合实验的制备
	<ol>
		<li>在开始数字全息显微镜（DHM）实验前约1至3小时，打开DHM显微镜的培养皿加热室，以确保DHM测量期间温度条件稳定。</li>
		<li>在工作台上准备好所需设备（用于划痕愈合实验的培养皿见步骤2.3）：移液器、镊子、培养皿玻璃盖、含生理温度（37 °C）的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲细胞培养基，用于在无菌环境中制备样品。 
		​注意： Dulbecco改良型Eagle培养基（DMEM）含有10%胎牛血清（FCS）、20 mM HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）和850 mg/L NaHCO₃3.</li>
		<li>从培养皿中移去塑料盖，用移液器吸除细胞培养基。用镊子将插入物从培养皿底部取出。</li>
		<li>用1 ml HEPES缓冲的细胞培养基洗涤样本1–2次，以去除死细胞和残留的细胞成分（例如，血清）于伤口区域。加入2 ml HEPES缓冲的细胞培养基，盖上玻璃盖密封培养皿。</li>
		<li>确保玻璃盖和培养皿底部已清除灰尘和其他污染物。样品已准备好用于数字全息显微镜进行延时观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>持续多模态伤口愈合监测 体外 使用数字全息显微镜（DHM）
	<ol>
		<li>在开始实验前约1至3小时，开启DHM显微镜的培养皿加热腔，以确保DHM测量期间温度条件稳定。</li>
		<li>打开数字全息显微镜，选择10X显微物镜进行成像。启动DHM显微镜的图像采集软件，并选择“明场”成像模式。确保培养皿的加热腔处于生理温度（37 °C）下运行。</li>
		<li>将按步骤4所述制备的含伤口愈合实验的培养皿置于DHM显微镜的加热腔内。</li>
		<li>选择明场成像模式，同时在DHM显微镜图像采集软件的实时监控窗口中观察样品，通过显微镜载物台调节样品位置。观察到在白光照明下，样品的目标区域呈现清晰对焦状态。</li>
		<li>使用图像采集软件在白光照明下拍摄样本不同区域（伤口区域及周围汇合细胞区域）的明场图像，记录其外观、细胞密度和均一性。</li>
		<li>选择DHM显微镜的“明场”成像模式。在DHM显微镜图像采集软件的实时监测窗口中，利用白光照明选择一个合适的伤口区域。确保伤口区域无死亡细胞残留，且无血清存在，同时保证伤口两侧均包含单一均质的细胞层，最好具有平直的边界。</li>
		<li>使用DHM显微镜的图像采集软件，在明场成像模式下获取初始伤口区域的白光图像。</li>
		<li>关闭白光照明，选择“DHM”模式并开启激光照明。选择低于3 msec的曝光时间进行全息图记录（注意在DHM显微镜图像采集软件的实时成像窗口中，应观察到具有足够对比度的离轴全息干涉条纹），然后采集一幅数字全息图。</li>
		<li>在数字全息显微（DHM）模式下，使用图像采集软件捕获样本全息图，并利用DHM显微镜的重建软件重建定量相位图像，以检查图像质量。</li>
		<li>选择合适的时间延迟（例如，用于使用DHM显微镜的图像采集软件进行延时全息图采集（3 - 5 分钟）。</li>
		<li>选择图像采集软件中的延时成像采集模式，使样品仅在全息图采集期间被激光照射。</li>
		<li>开始延时数字全息显微镜观察划痕愈合实验。</li>
		<li>在预定时间结束后停止延时成像采集，选择明场成像模式，并在白光成像下记录样本的最终形态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重建离体组织的数字全息图，并确定平均折射率作为量化组织密度的参数
	<ol>
		<li>使用DHM显微镜的软件从离体组织的数字全息图中重建定量相位图像， 例如，如Kemper所述 等26 和 Langehanenberg 等27.</li>
		<li>在适当选择的感兴趣区域（ROI）中，测定不同组织层（上皮层、黏膜下层、基质层）的平均相位对比度 Δφ19.</li>
		<li>使用折射仪测定包埋介质的折射率，或从文献中选用合适的数值。（常见包埋介质的折射率：n水 = 1.334 28，n磷酸盐缓冲液（PBS） = 1.337 29，n细胞培养基 = 1.337-1.339 29,30).</li>
		<li>根据平均相位对比值计算不同组织层的折射率19 
		<img alt="Refractive index equation; phase shift, wavelength; optical analysis formula." src="/files/ftp_upload/54460/54460eq1.jpg" data-altupdatedat="1762215414000" data-alt="Equation 1">     (1) 
		注意： 在公式1中，λ 表示激光的波长（此处：λ = 532 nm）， d 解剖组织的厚度（此处为：7 µm）以及 n培养基 是包埋介质的折射率（此处： n培养基 = nPBS = 1.337，通过阿贝折射仪测定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从延时伤口愈合系列观察中重建和评估数字全息图
	<ol>
		<li>利用数字全息显微镜软件，从伤口愈合观察过程中获取的时间序列全息图重建定量相位图像26,27.</li>
		<li>将每组定量相位图像归一化至相位对比度最大的图像。</li>
		<li>确定面积 Sc 通过图像分割技术，在定量数字全息显微相位图像中由细胞覆盖的区域，可使用免费软件Cell Profiler（www.cellprofiler.org）实现31).</li>
		<li>计算细胞的平均相位对比度 Δφ细胞 在该区域 Sc.</li>
		<li>从平均相位对比 Δφ 中获取细胞干重 DM细胞 在该区域 Sc15 
		<img alt="Diffusion measurement formula, DM=10λ/2πα Δφ_cell S_c, equation, optics experiment." src="/files/ftp_upload/54460/54460eq2.jpg" data-altupdatedat="1762215414000" data-alt="Equation 2">     (2) 
		注意： 在公式2中，DM表示细胞干重， Sc 表示细胞所占据的区域，且 α = 0.002 m2/kg</li>
		<li>测定细胞的整体折射率 n细胞 细胞培养基的折射率 n培养基. 确定 n细胞 与悬浮细胞分开进行实验，具体方法如所述 30 并测量 n培养基 使用折射仪测定。或者，采用文献中的数值 n细胞30 和 n培养基29,30.</li>
		<li>计算平均细胞厚度 d细胞 来自 λ，Δφ细胞, n细胞 和 n培养基 26,32 
		<img alt="Equation for cell thickness calculation using optical properties, featuring refractive indices and phase difference." src="/files/ftp_upload/54460/54460eq3.jpg" data-altupdatedat="1762215414000" data-alt="Equation 3">     (3) 
		注意： 在公式 3 中，参数 d细胞 是平均细胞厚度，λ 表示激光的光波长，Δφ细胞 表示平均相位对比度，且 n细胞 和 n培养基 分别为细胞的整体折射率和周围介质的折射率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们证明了数字全息显微技术（DHM）能够对小鼠结肠炎模型及人结肠组织样本进行准确的组织学损伤评估（ex vivo）。此外，我们还表明，DHM 可在连续监测上皮伤口愈合过程的同时，提供有关细胞变化的多模态信息。在 DHM 中，数字采集的全息图通过数值方法进行重建32。因此，与明场显微镜、泽尼克相衬显微镜和微分干涉差显微镜相比，DHM 能够提供定量的相位对比图像，并可选择性地进行后续数值聚焦校正（多焦点成像）27。定量相位成像基于光学路径长度变化的测定，因而对所使用的测量设备具有高度独立性。这简化了使用不同仪器获取的测量数据之间的比较。此外，DHM 仅需较低的光照强度即可实现样本照明。这使得对未染色离体组织的分析具有最小侵入性，并在活细胞的长期延时观察过程中显著减少了对样本的干扰。
过去二十年中，炎症性肠病（IBD）的治疗手段显著扩展。除了引入在溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）中均有效且安全性可接受的抗TNF-α疗法外，近年来靶向整合素的新型特异性抗体也已进入临床应用34-37目前，还有多种其他有...

炎症性肠病（IBD）， 即， 溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）和克罗恩病（Crohn's disease, CD）是胃肠道的病因不明的炎症性疾病1炎症性肠病（IBD）潜在病理生理机制的研究，以及对潜在新药或新型诊断方法的评估尤为重要。在基础研究和IBD患者的临床管理中，肠道黏膜已成为关注的重点。2,3黏膜是一道解剖学边界，在此共生细菌、上皮细胞与肠道免疫系统的多种细胞组分相互作用，共同协调肠道稳态。4,5然而，在炎症性肠病患者中，失控且持续的肠道炎症会导致黏膜损伤，表现为溃疡或狭窄，最终可能导致上皮屏障功能的破坏，而屏障功能的破坏本身又会加剧局部炎症。6.
因此，上皮伤口愈合对于炎症后上皮再生至关重要，同时也是胃肠道溃疡愈合或胃肠道手术后吻合口漏修复的基本要求7上皮伤口愈合可在体外模拟 体外 伤口愈合实验及小鼠肠道炎症模型8,9. 两者 体外 和 体内 这些方法存在缺陷，限制了实验评估的准确性。 体外 检测方法，如经典的划痕实验，需要耗时的染色步骤或转染荧光发色团。这些方法通常受限于对细胞增殖和迁移的间断性监测，且难以实现自动化。10. 体内 模型，如葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎，常常缺乏可靠的读出指标，部分原因是实验室标志物存在显著变异，使得这些标志物不适合用于评估结肠炎严重程度11,12. 对炎症黏膜进行组织学分析目前仍是确定结肠炎严重程度最有效的方法，但这种方法与 体外 上皮伤口愈合实验，需要染色，且依赖于研究者的操作经验13.
近年来，数字全息显微镜（DHM）作为定量相位显微镜的一种变体14被确定为评估上皮伤口愈合的有用工具 体外 和 体内15. DHM 通过测量光程差（OPD）来评估组织密度，为癌症诊断提供了新前景16-18 炎症相关组织改变的检测与定量19此外，数字全息显微技术（DHM）可通过测定细胞厚度、细胞覆盖表面积及细胞内（蛋白质）含量，实现对细胞形态动态的监测。15,20在 体外 检测，数字全息显微镜还能实现对生理过程的分析， 例如， 通过评估细胞体积和厚度的变化来测定细胞水通透性21,22此外，数字全息显微测量可实现自动化，从而避免由操作者引起的样本偏差。
在此，我们展示了数字全息显微技术（DHM）在小鼠肠道炎症模型中的应用，并将DHM用于人组织样本的分析，以实现对伤口愈合过程的无标记定量监测 体外 检测。首先，我们评估结肠炎小鼠以及炎症性肠病（IBD）患者结肠壁各层的炎症性改变。在描述数字全息显微镜（DHM）定量相位成像步骤后，我们提供了显微镜组件使用、组织切片制备的详细操作指南，并阐述了所获得的定量相位图像的分析方法。
接下来，我们展示数字全息显微技术（DHM）可用于上皮伤口愈合过程的连续多模态监测 体外，并描述细胞特征（如细胞层厚度、干质量及细胞体积）的分析，可深入了解药物诱导及生理性的细胞变化。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>偶氮甲烷（AOM）</td><td>Sigma - Aldrich，德国德意志豪芬</td><td>A5486</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶</td><td>Greiner Bio-One，德国弗里克豪森</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>Costar Stripette</td><td>康宁公司，美国纽约</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖硫酸钠（DSS）</td><td>TdB 顾问公司，乌普萨拉，瑞典</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12</td><td>PAA实验室 - 帕兴 - 奥地利</td><td>E15-813</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma-Aldrich，德国德伊森霍芬</td><td>SPR3196</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma - Aldrich，德国德意志豪芬</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml 离心管</td><td>BD 生物科学公司，比利时埃伦博德海姆</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>异戊烷（2-甲基丁烷）</td><td>Sigma-Aldrich，德国德伊森霍芬</td><td>M32631-1L</td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>默克公司，达姆施塔特，德国</td><td>1159430025</td><td></td></tr><tr><td>丝裂霉素C</td><td>Sigma-Aldrich，德国德伊森霍芬</td><td>M4287</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>G. Menzel，德国布伦瑞克</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Tissue Tek 包埋剂&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sakura，Zoeterwonde，荷兰</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/两性霉素B</td><td>Lonza，比利时韦尔维耶</td><td>1558</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，PBS</td><td>Lonza，比利时韦尔维耶</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza，比利时韦尔维耶</td><td>3626</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠</td><td>德国美尔松根，勃朗公司</td><td>5/12211095/0411</td><td></td></tr><tr><td>标准饮食</td><td>Altromin，Lage，德国</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura，荷兰莱顿</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶EDTA</td><td>Lonza，比利时韦尔维耶</td><td>7815</td><td></td></tr><tr><td>体外 &amp;ndash; 云</td><td>R. Langenbrinck，德国滕宁根</td><td>04-0002&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;micro;- 带高型细胞培养插件的35 mm培养皿</td><td>ibidi GmbH，德国慕尼黑</td><td>81176</td><td></td></tr><tr><td>DIC盖板 &amp;micro;- 培养皿，带玻璃插片</td><td>ibidi GmbH，德国慕尼黑</td><td>80050</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROM HM550</td><td>赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>46320</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;数字全息显微镜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;组分&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;模型&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>iMIC</td><td>Till Photonics，Graefelfing，德国</td><td></td></tr><tr><td>激光</td><td>Compass 315M</td><td>Coherent GmbH，德国吕贝克</td><td></td></tr><tr><td>显微镜物镜</td><td>蔡司 EC Plan Neofluar 10x/0.3</td><td>蔡司，德国哥廷根</td><td></td></tr><tr><td>CCD相机</td><td>DMK 41BF02</td><td>The Imaging Source，德国不来梅</td><td></td></tr></tbody></table>

利用数字全息显微术的多模态定量相位成像可准确评估肠道炎症与上皮伤口愈合

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

炎症性肠病的发病率， 即， 在过去十年中，克罗恩病和溃疡性结肠炎的发病率显著上升。炎症性肠病（IBD）的病因至今尚不明确，现有的治疗策略主要基于对免疫系统的非特异性抑制。开发能够特异性靶向肠道炎症和上皮伤口愈合的治疗方法，有望显著改善IBD的管理，但这需要对炎症变化进行准确检测。目前，潜在的药物候选物通常通过动物模型进行评估。 体内 或基于细胞培养的技术 体外组织学检查通常需要对目标细胞或组织进行染色，这可能会改变样本的特性，且研究结果的解读还可能因研究者经验不同而存在差异。数字全息显微术（DHM）基于光学路径长度延迟的检测，可实现无需染色的定量相位对比成像，从而使实验结果能够直接关联于绝对的生物物理参数。我们展示了如何利用DHM通过折射率测量来检测组织密度的变化，从而在无需染色的情况下定量评估患有结肠炎的小鼠和人类结肠组织样本中不同层次的炎症改变。此外，我们还展示了上皮伤口愈合过程的连续多模态无标记监测 体外，可通过数字全息显微技术（DHM）对损伤区域进行简单自动测定，同时测定迁移细胞的干质量、层厚度等形态学参数。综上所述，DHM 是一种有价值的、新颖且可定量的工具，可用于评估肠道炎症，并可获得参数的绝对值，简化上皮伤口愈合的定量分析 体外 因此在转化诊断应用方面具有很高的潜力。

数字全息显微镜（DHM）成像的典型设置
为了进行明场成像和定量数字全息显微（DHM）相位对比成像，我们采用了如图1B所示的倒置显微镜。该系统通过连接一个DHM模块进行了改造，具体方法如前所述25。在马赫-曾德尔光路配置下，使用倍频Nd:YAG激光器（λ = 532 nm）照射样品，生成数字全息图（图1A）。分离的组织样本被置于玻璃载片上进行离体（ex vivo）分析。活细胞培养物则在特制的培养皿中观察，用于检测伤口愈合过程，如图1C所示。样品通过透射照明方式，利用10倍物镜（NA = 0.3）和管镜成像。采用电荷耦合器件（CCD）相机记录由样品图像（物波）与轻微倾斜的参考波叠加所产生的干涉图样（数字离轴全息图）。所采集的数字全息图通过空间相移重建方法，并结合可选的全息自动聚焦技术...

准确评估抗炎效果对于评价治疗炎症性肠病潜在新药至关重要。数字全息显微技术可对小鼠和人类结肠组织样本中的炎症进行评估，并实现上皮伤口愈合的自动化多模态分析 体外.

炎症性肠病（即克罗恩病和溃疡性结肠炎）的发病率在过去十年中显著上升。

本研究的总体目标是利用数字全息显微技术（DHM），对肠道炎症结肠组织样本进行自动化、无需染色的定量相位对比成像，从而实现体外多模态评估上皮伤口愈合。该方法有助于解答胃肠道炎症与伤口愈合领域中的关键问题，例如疾病活动性相关的炎症人源及啮齿类动物组织反应。该技术的主要优势在于，能够以无需染色且客观的方式，通过物理参数对细胞和组织进行检测与定量。示范实验操作的将是来自生物医学技术中心的技术员 Fittest Ketelhut。接种细胞培养，将4 × 10⁵个Caco-2细胞每平方厘米接种于35毫米培养皿中，培养皿内放置高壁培养小室，使用添加了胎牛血清和抗生素的RPMI培养基，在37°C、95%湿度及5%二氧化碳条件下培养。两天后，用目标处理剂处理细胞，并将培养物放回孵箱继续培养24小时。次日，吸除上清液，并用镊子取出培养小室。用一毫升 HEPES 缓冲的细胞培养基将培养物清洗一至两次，以去除伤口区域的任何死细胞及残留的细胞组分。然后加入两毫升新鲜的 HEPES 缓冲培养基，并盖上培养皿。将培养皿放入数字全息显微镜中，选择 10 × 物镜。打开图像采集软件，选择明场成像模式。将培养箱温度设置为37摄氏度，并将培养物放入加热舱中。接着移动观察视野，直至在实时监测窗口中可观察到一个具有单层致密细胞、两侧边界清晰且无死亡细胞或血清干扰的合适伤口区域。拍摄初始伤口区域的白光图像。然后关闭白光照明，选择数字全息显微模式。打开激光照明，并为全息图记录选择小于三毫秒的曝光时间。如果全息离轴干涉条纹具有足够的对比度，则采集一个样本全息图，并使用重建软件重构定量相位图像以检查图像质量。随后，开始进行延时数字全息显微镜观察伤口，在适当的时间终点停止记录，并在白光照明下获取样本的最终图像。对于急性葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎，向小鼠自由饮用含有3克DSS溶于100毫升高压灭菌水中的溶液。七天后，从对照组和处理组动物的瑞士卷结肠样本中获取厚度为七微米的切片。将每张切片浸入50至100微升的PBS中，并用单独的玻璃盖玻片覆盖样本。确认载玻片底部无灰尘及其他污染。然后，将第一张载玻片放置在显微镜载物台上，调整视野，直至目标组织区域可见。将样本调至清晰对焦，并在图像采集软件中获取一幅明场图像。接着，选择数字全息显微成像模式，并切换至激光光源照明。设置曝光时间小于三毫秒，并确认在实时成像窗口中全息离轴干涉条纹具有足够的对比度。随后，采集组织的数字全息图。内镜下中重度结肠炎的表现包括结肠壁增厚、血管形态改变、纤维样渗出物以及黏膜表面颗粒样改变。对结肠切片进行常规组织学评估显示，与对照组动物相比，DSS处理组动物的结肠壁出现明显水肿，主要位于黏膜下层。相应的定量数字全息显微镜（DHM）相位对比图像及相关折射率图谱也表明，这些组织改变在未染色的天然组织样本中尤为显著，而上皮与间质的密度则无可见差异。与健康对照组相比，结肠炎小鼠的上皮层、黏膜下层和间质的折射率显著降低，且实验动物体重相对下降程度与折射率之间存在显著相关性。此处展示了利用数字全息显微技术对伤口愈合实验进行长达45小时的代表性连续监测。该方法可在伤口愈合过程中持续计算细胞覆盖的表面积、平均细胞厚度以及细胞干质量。我们已证明，数字全息显微技术（DHM）能够在连续监测上皮细胞伤口愈合的同时，提供有关细胞因子诱导细胞变化的生物核心信息。此外，我们通过数字全息显微技术（DHM）测量折射率变化，展示了其在结肠炎模型及人类结肠组织样本中对组织学损伤进行精确评估的能力。由于DHM基于光学路径长度延迟的检测，因此可通过无染色定量相位对比成像分析绝对的生物物理参数，例如组织密度、干质量或细胞厚度。DHM与常规研究用显微镜的结合，以及该技术本身的稳健性，为该方法在细胞生物学和数字病理学中的常规应用铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何在生物医学实验室环境中利用数字全息显微技术对活细胞培养组织进行分析。总之，数字全息显微技术（DHM）为炎症绝对参数的评估以及上皮细胞体外自主性活动的简化定量分析提供了一种有价值的、新颖且定量的工具，具有很高的转化诊断应用潜力。

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利用数字全息显微术的多模态定量相位成像可准确评估肠道炎症与上皮伤口愈合

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