利用数字全息显微术的多模态定量相位成像可准确评估肠道炎症与上皮伤口愈合

本研究的总体目标是利用数字全息显微技术（DHM），对肠道炎症结肠组织样本进行自动化、无需染色的定量相位对比成像，从而实现体外多模态评估上皮伤口愈合。该方法有助于解答胃肠道炎症与伤口愈合领域中的关键问题，例如疾病活动性相关的炎症人源及啮齿类动物组织反应。该技术的主要优势在于，能够以无需染色且客观的方式，通过物理参数对细胞和组织进行检测与定量。示范实验操作的将是来自生物医学技术中心的技术员 Fittest Ketelhut。

接种细胞培养，将4 × 10⁵个Caco-2细胞每平方厘米接种于35毫米培养皿中，培养皿内放置高壁培养小室，使用添加了胎牛血清和抗生素的RPMI培养基，在37°C、95%湿度及5%二氧化碳条件下培养。两天后，用目标处理剂处理细胞，并将培养物放回孵箱继续培养24小时。次日，吸除上清液，并用镊子取出培养小室。

用一毫升 HEPES 缓冲的细胞培养基将培养物清洗一至两次，以去除伤口区域的任何死细胞及残留的细胞组分。然后加入两毫升新鲜的 HEPES 缓冲培养基，并盖上培养皿。将培养皿放入数字全息显微镜中，选择 10 × 物镜。

打开图像采集软件，选择明场成像模式。将培养箱温度设置为37摄氏度，并将培养物放入加热舱中。接着移动观察视野，直至在实时监测窗口中可观察到一个具有单层致密细胞、两侧边界清晰且无死亡细胞或血清干扰的合适伤口区域。

拍摄初始伤口区域的白光图像。然后关闭白光照明，选择数字全息显微模式。打开激光照明，并为全息图记录选择小于三毫秒的曝光时间。

如果全息离轴干涉条纹具有足够的对比度，则采集一个样本全息图，并使用重建软件重构定量相位图像以检查图像质量。随后，开始进行延时数字全息显微镜观察伤口，在适当的时间终点停止记录，并在白光照明下获取样本的最终图像。对于急性葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎，向小鼠自由饮用含有3克DSS溶于100毫升高压灭菌水中的溶液。

七天后，从对照组和处理组动物的瑞士卷结肠样本中获取厚度为七微米的切片。将每张切片浸入50至100微升的PBS中，并用单独的玻璃盖玻片覆盖样本。确认载玻片底部无灰尘及其他污染。

然后，将第一张载玻片放置在显微镜载物台上，调整视野，直至目标组织区域可见。将样本调至清晰对焦，并在图像采集软件中获取一幅明场图像。接着，选择数字全息显微成像模式，并切换至激光光源照明。

设置曝光时间小于三毫秒，并确认在实时成像窗口中全息离轴干涉条纹具有足够的对比度。随后，采集组织的数字全息图。内镜下中重度结肠炎的表现包括结肠壁增厚、血管形态改变、纤维样渗出物以及黏膜表面颗粒样改变。

对结肠切片进行常规组织学评估显示，与对照组动物相比，DSS处理组动物的结肠壁出现明显水肿，主要位于黏膜下层。相应的定量数字全息显微镜（DHM）相位对比图像及相关折射率图谱也表明，这些组织改变在未染色的天然组织样本中尤为显著，而上皮与间质的密度则无可见差异。与健康对照组相比，结肠炎小鼠的上皮层、黏膜下层和间质的折射率显著降低，且实验动物体重相对下降程度与折射率之间存在显著相关性。

此处展示了利用数字全息显微技术对伤口愈合实验进行长达45小时的代表性连续监测。该方法可在伤口愈合过程中持续计算细胞覆盖的表面积、平均细胞厚度以及细胞干质量。我们已证明，数字全息显微技术（DHM）能够在连续监测上皮细胞伤口愈合的同时，提供有关细胞因子诱导细胞变化的生物核心信息。

此外，我们通过数字全息显微技术（DHM）测量折射率变化，展示了其在结肠炎模型及人类结肠组织样本中对组织学损伤进行精确评估的能力。由于DHM基于光学路径长度延迟的检测，因此可通过无染色定量相位对比成像分析绝对的生物物理参数，例如组织密度、干质量或细胞厚度。DHM与常规研究用显微镜的结合，以及该技术本身的稳健性，为该方法在细胞生物学和数字病理学中的常规应用铺平了道路。

观看本视频后，您应能够充分理解如何在生物医学实验室环境中利用数字全息显微技术对活细胞培养组织进行分析。总之，数字全息显微技术（DHM）为炎症绝对参数的评估以及上皮细胞体外自主性活动的简化定量分析提供了一种有价值的、新颖且定量的工具，具有很高的转化诊断应用潜力。