光介导的水凝胶形成与图案化及其在细胞培养中的应用

本实验的总体目标是在基于合成聚合物的细胞外基质中实现细胞的形成、图案化和包封。该方法可用于研究与识别调控细胞在异质微环境中响应行为的细胞外信号相关的关键生物学问题。该技术的主要优势在于，利用标准实验方案和易获取的材料，即可构建出用于细胞包封与培养的稳定合成基质。

该方法可用于可控的细胞培养以及体外研究细胞反应。该方法可应用于其他系统，包括药物递送和组织工程。按照文本方案中的描述准备水凝胶形成的材料。

将准直透镜连接到充满液体的导光管末端，以确保所有样品上的光照强度相对均匀。调节导光管与样品之间的距离，使光斑大小能够覆盖目标样品。为制备非图案化水凝胶，可通过移液将10至20微升凝胶前体溶液加入无菌剪切的注射器尖端内，制备成注射器尖端模具中的厚水凝胶。

每个注射器制备一块凝胶，根据体积和注射器直径，使其厚度约为0.5至1.5毫米。通过将橡胶垫圈放置在未涂层载玻片的边缘来制备玻璃载玻片模具，用于制备薄水凝胶。接着，用移液器将5至10微升的凝胶前体溶液滴加到未涂层的载玻片上。

将涂有防粘剂的载玻片置于凝胶溶液上方，用小型文件夹夹子固定载玻片以保持稳定。调节光源强度，使凝胶表面处的照度达到每平方厘米10毫瓦，适用于注射器针头模具或载玻片模具。

使用辐射计检测光强，并将模具置于灯下。照射 1 至 5 分钟，使凝胶完全聚合。

对于聚对苯二甲酸乙二醇酯含量较高的凝胶，使用较短的聚合时间；而对于含量较低的凝胶，则使用较长的聚合时间，以制备出模量处于软组织范围内的完全聚合水凝胶。将凝胶从注射器尖端模具中取出，放入无菌未处理的48孔板中，并将玻璃盖片放入无菌培养皿中。

为制备图案化水凝胶，按照文本方案中的描述配制前体溶液，并用力吹打溶液以确保充分混匀。接着，将预先形成的含有五聚体肽的凝胶覆盖于磷酸锂光引发剂溶液中，在37摄氏度下孵育一小时。孵育结束后，去除多余的溶液。

若凝胶在注射器尖端内成型，则使用刮铲小心地将其从48孔板转移至无菌玻璃载片上进行图案化。将带有目标图案的光掩模直接放置在注射器及成型凝胶的玻璃载片上，确保掩模的印刷部分与凝胶接触，以获得最佳的图案保真度。

将样品置于灯下照射一分钟。图案化完成后，将注射器成型的凝胶放入无菌的48孔非组织培养处理板中。将附着在玻片上的玻璃片成型凝胶放入无菌培养皿中。

用培养基或根据计划实验选择的适当缓冲液冲洗三次，每次15分钟。为进行光图案化水凝胶中游离巯基的检测与定量，首先按照文本方案中所述准备溶液并进行计算。按前述方法制备用于图案化的薄层水凝胶。

具体操作时，制备含有过量游离巯基的凝胶，并使用透明盖玻片将其中一半样品用五邻体肽进行图案化，以确保整个凝胶充分暴露于光下。将图案化与未图案化的凝胶分别放入48孔板的孔中。用Ellman反应缓冲液冲洗三次，每次15分钟，以使末端反应产物从凝胶中扩散出来，并达到平衡溶胀状态。

向清洗后的凝胶中加入额外的Ellman反应缓冲液，使凝胶溶胀后的总体积为20微升的整数倍。例如，若预测溶胀后凝胶体积为15微升，则加入5微升反应缓冲液；若预测溶胀后体积为30微升，则加入10微升反应缓冲液。

将半胱氨酸标准品以20微升的倍数加入48孔板的各个孔中。加入体积取决于前一步骤所用体积。例如，如果前一步骤中凝胶溶胀后的体积加上额外反应缓冲液总体积为40微升，则向各个空孔中分别加入40微升的标准品。

接下来，稀释Ellman试剂和反应缓冲液。将稀释后的Ellman试剂加入含有标准品和样品的孔中。对于20微升的样品，向每孔加入183.6微升溶液。

孵育或置于摇床上1小时30分钟，或直至溶液颜色与凝胶颜色通过目视观察一致，以确保黄色的2-硝基-5-硫代苯甲酸二价阴离子充分扩散，该物质由Ellman试剂与凝胶中的游离巯基反应生成。从样品和标准品中各取100 µL溶液，加入96孔板的孔中。使用酶标仪在405 nm处读取吸光度。

为了观察光刻图案，用纸巾轻轻擦拭水凝胶边缘以去除多余的反应缓冲液。将Ellman试剂直接滴加到凝胶表面，立即在10倍光学显微镜或配备彩色相机的体视显微镜下进行成像。

收集细胞并按照文本方案中的描述进行包封前处理。吸除 PBS 后，立即将沉淀的细胞重悬于前体溶液中，最终浓度为每微升五千个细胞。保留适量的游离巯基，用于后续与五邻体肽的反应。

如果需要进行光刻图案化，则按前述方法制备模具、聚合并图案化水凝胶。图案化后，用培养基冲洗凝胶，每次10分钟，共冲洗三次，以去除未反应的物质和过量的磷酸锂光引发剂。

将凝胶置于生长培养基中，在37摄氏度、5% CO2条件下孵育至所需分析时间点。每48小时或根据具体应用需求更换培养基。为测定包封细胞的活力，首先从凝胶中移除生长培养基，并用PBS冲洗三次，每次15分钟，以促进培养基从凝胶中扩散去除。

向1毫升无菌PBS中加入2微升已解冻的2毫摩尔溴化乙锭同源二聚体-1和0.5微升已解冻的4毫摩尔钙AN溶液，涡旋混匀以确保充分混合。将300微升该混合溶液加入48孔板中的每个注射器模具凝胶内，或加入足量溶液以完全覆盖无菌培养皿中载玻片上凝胶的表面。

孵育45分钟。去除多余的溶液，并进行冲洗以除去凝胶中残留的染料。在共聚焦显微镜下对细胞进行成像。

或在具有10倍放大功能的落射荧光显微镜下，使用488纳米激发光和525纳米发射光进行观察。通过Ellman试剂对未图案化和图案化水凝胶的游离巯基浓度进行定量分析，结果表明，初始聚合1分钟和5分钟的水凝胶具有统计学上相似的游离巯基浓度，说明反应迅速，且在1分钟内已实现完全凝胶化。

将水凝胶分别与五邻体肽孵育30分钟、1小时和1小时30分钟后，其游离巯基浓度降低了60%至80%，表明过量的巯基得到了有效修饰。通过将光照射到覆盖有掩膜的样品上形成的光刻图案（此处掩膜上印有线条），可在二维条件下使用Ellman试剂观察到；或者，在后续成像中结合荧光肽，可在三维条件下观察到。

将包埋于水凝胶中的成人人体干细胞用活/死染色剂和水凝胶毒性染色剂处理，并通过共聚焦显微镜成像。包埋后一天，细胞膜完整且存活的细胞呈绿色标记，表明细胞存活。

细胞在包封后六天开始在基质中铺展。如插图所示。在进行此操作时，重要的是要牢记保持无菌和谨慎的操作程序，以防止因引入污染物或机械剪切力而在包封后对细胞造成损伤。

完成此操作后，还可进行免疫染色流式细胞术和基因表达分析等其他方法，以研究细胞在响应胞外环境时的功能与命运。该技术为生物学、生物工程学和医学领域的研究人员提供了途径，使其能够在具有用户自定义特性调控的合成胞外基质中研究组织区域侵蚀或疾病进展，从而推动新治疗策略的开发。观看本视频后，您应能够充分理解如何包封细胞，以及如何对软基质进行图案化，以开展可控的细胞培养研究。