Name: 用于细胞培养应用光介导的形成和构图的水凝胶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学习利用光介导化学方法制备图案化水凝胶基质，用于三维细胞培养与封装。该技术通过生物相容性光点击反应实现可控凝胶形成，适用于研究细胞在异质微环境中的行为反应及组织工程应用。

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本工作得到了美国国立卫生研究院下属国立普通医学科学研究所资助的特拉华州药物发现COBRE项目和先进生物材料COBRE项目（资助号分别为P20GM104316和P30 GM110758-01）、Pew慈善信托基金（00026178）、美国国家科学基金会职业奖（DMR-1253906）、Burroughs Wellcome基金（1006787）以及特拉华大学国家科学基金会IGERT SBE2项目（为L. Sawicki提供奖学金）的支持。作者感谢特拉华大学特拉华生物技术研究所生物成像中心提供的共聚焦显微镜使用权限和培训，感谢Katherine Wiley女士在视频拍摄期间提供的协助，感谢Matthew Rehmann先生慷慨提供从骨髓中分离的人骨髓间充质干细胞（hMSCs），感谢Christopher J. Kloxin教授和Stephen Ma先生慷慨提供光刻掩模，以及感谢Wilfred Chen教授提供自动酶标仪的使用权限。

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文所展示的方法演示了利用巯基-烯烃点击化学反应形成的水凝胶将细胞进行光封装，并随后通过生化信号对凝胶进行光图案化。使用光来初始形成水凝胶，可在聚合前实现细胞在聚合物溶液中的均匀混合与悬浮。快速聚合过程可使凝胶“锁定”在特定模具的形状中，并将悬浮的细胞包埋于水凝胶网络内。此外，凝胶也可被塑造成多种不同形状（例如，载玻片或注射器尖端），具体取决于最终应用需求。例如，将细胞封装在附着于载玻片的水凝胶中用于三维培养，特别适用于成像应用，因为薄样品中的光衰减较小。而使用注射器模具则可实现细胞的快速封装，能够在较短时间内制备更多样品（相较于载玻片），适用于需要大量细胞的实验，如流式细胞术或定量PCR。随后，这些凝胶还可被赋予生化信号图案，以诱导细胞产生特定响应，如分化或侵袭行为。30,31
活力和代谢活性检测结果表明，在所述材料体系和图案化条件下，细胞能够存活。需注意，在不可降解凝胶（RGKGRK 肽交联）中，代谢活性监测持续至第 3 天，以评估聚合和图案化条件对细胞功能的初始影响。此外，在含有可降解肽交联（GPQGIWGQ）的凝胶中包封人骨髓间充质干细胞（hMSCs）后第 1 天和第 6 天进行的膜完整性检测（活/死细胞活力/细胞毒性染色）结果表明，细胞在培养 1 周后仍保持活性并发生铺展。已有文献报道，在与本研究所用条件相似的光图案化条件下其他细胞系的存活情况32，可通过活/死染色和代谢活性检测对本文所述水凝胶体系进行类似评估。尽管在使用本材料体系及相关操作步骤（4.2 和 4.3）时未观察到细胞活力方面的问题，但某些细胞类型可能对自由基和/或光照暴露敏感。在此情况下，使用者可考虑采用非光引发的材料体系，例如叠氮-炔烃12、FXIII31 或基于 Diels-Alder 反应的水凝胶形成化学方法33。
还介绍了检测和量化凝胶内生化信号模式的简便技术（3.1 和 3.2）。Ellman 法特别值得关注，因为其试剂可商业获取，且无需额外的合成处理步骤或更昂贵的试剂例如，需使用荧光标记的多肽）。Ellman 法可用于精确定量在不同光图案化条件下生化信号对游离巯基的修饰程度，并快速可视化图案。为定量多肽的掺入情况，可通过 Ellman 法直接测定图案化前后巯基官能团的浓度，该浓度作为多肽掺入量的定量指标。尽管此类定量也可通过荧光标记的多肽实现，34 基于成像的定量需要更耗时的处理和分析步骤（例如合成荧光标记肽并利用图像分析生成校准曲线，以关联荧光信号与肽浓度。在成像肽掺入情况时，可直接将Ellman试剂应用于样品并立即进行可视化观察。尽管该方法仅限于在x-y平面上进行图案可视化，但仍可作为一种简单、常规的方法，用于判断含有游离巯基的基质是否已被成功图案化。需注意的是，Ellman法不具备细胞相容性，因此虽然可用于观察和量化光图案，但不能在细胞存在的情况下使用。若需在三维空间中以及细胞共存条件下进行图案成像，荧光标记肽在水凝胶基质中的共价结合仍是一种强大且广泛应用的方法。利用共聚焦显微镜可在x、y和z平面上评估图案的分辨率，且该方法具有细胞相容性，可识别位于图案化区域或非图案化区域内的细胞。综上所述，Ellman法与基于成像的技术互为补充，为研究人员提供了对材料体系内生化信号光图案化效果进行定性与定量评估的有效工具。
用于在细胞存在下形成和修饰水凝胶的光引发化学反应（或更广义的光点击化学）种类繁多。本文介绍的成型、包封和图案化技术不仅限于所描述的材料体系，也可应用于其他基于光的化学反应，例如巯基-炔烃反应35、叠氮-炔烃反应4以及其他巯基-烯烃化学反应（例如，巯基-降冰片烯）10,13，并可结合不同的光引发剂使用，如Irgacure 2959、伊红Y和樟脑醌。需要注意的是，使用者可能需要调整实验参数（例如，孵育时间、聚合时间、细胞密度），以确保这些其他体系仍保持细胞相容性。由于图案化过程依赖于alloc修饰的肽段向水凝胶内的扩散（2.2.3–2.2.5），该方法在向水凝胶中添加需要与网络共价连接才能介导细胞产生牵引力并完全激活整合素的整合素结合基团（例如，肽段或细胞外基质蛋白片段）时可能最为有效36。需要注意的是，对于在溶液中或固定后均具有类似生物活性的生物分子（例如，生长因子或细胞因子），该基团向水凝胶内扩散的孵育步骤（约1小时）可能导致信号激活事件，从而干扰图案化结果。已有其他方法被建立用于生长因子的固定化或局部隔离以实现其图案化37–39。此外，图案分辨率取决于对光照的控制精度。本方法中使用光掩模可在凝胶深度方向以及x-y平面上形成图案；然而，若采用其他辐照方式（例如双光子共聚焦显微镜），可在x、y和z三个维度上实现对凝胶内生化信号更精确的空间控制34,40。最后需要强调的是，尽管本实验所用材料体系仅在初始阶段被修饰以引入生化信号，但通过正交光点击化学反应，未来可实现随时间动态调控基质性质12。本文所呈现的方法与技术进一步丰富了当前构建具有明确定义且时空可控特性的合成基质的策略。特别是，本实验中所用试剂与材料的商业化可获得性，将为广泛致力于水凝胶类生物材料在可控细胞培养中应用的研究人员提供便利。

点击化学在多种生物医学应用的材料设计中正得到日益广泛的应用，包括药物递送、组织工程和可控细胞培养，这得益于其具有选择性、高效性以及通常具备的细胞相容性反应特性。1-3 光点击化学利用光来触发或启动反应（例如，叠氮-炔烃4、巯基-烯烃5和四唑-烯烃6），在生物材料的构建或修饰方面尤其受到关注。这些反应在温和条件下具有快速反应速率，并可通过光照精确控制其发生的时间和空间位置，因此非常适合在细胞存在的情况下实现对生物材料性能的用户导向性调控。7,8 特别是，巯基-烯烃光点击化学已被用于制备具有优异机械性能的水凝胶基生物材料5,9，并可用于包封多种类型的细胞，包括但不限于人源间充质干细胞（hMSCs）、成纤维细胞、软骨细胞和胰腺细胞，在细胞培养与递送方面展现出良好前景。10,11 此外，这些化学方法还被用于生化信号分子的空间图案化，以模拟天然细胞微环境的关键特征，并促进适当的细胞-基质相互作用，包括细胞黏附、分化和侵袭等过程。3,12
在光引发构建硫醇-烯烃水凝胶的过程中，通常使含半胱氨酸（硫醇）的多肽与丙烯酸酯或降冰片烯（“烯”）官能化的聚合物发生反应，在细胞相容性条件下实现快速的光引发聚合。13 扩展这一工具箱，我们致力于建立基于新型多功能且易得构建单元的水凝胶形成方法，这些构建单元只需极少的合成加工或可直接商业获取，以促进其作为合成细胞外基质的广泛应用。14 具体而言，肽被修饰为带有烯丙氧羰基（Alloc）保护的赖氨酸：一种用于悬挂整合素结合基团以促进细胞黏附 [K(alloc)GWGRGDS = Pep1Alloc]，另一种带有两个赖氨酸用于形成不可降解或细胞可降解的交联 [K(alloc)RGKGRKGK(alloc)G 或 KK(alloc)GGPQGIWGQGK(alloc)K = Pep2Alloc]。利用这些序列，建立了在长波长紫外光（10 mW/cm²）的细胞相容剂量下，与四臂巯基修饰的聚乙二醇（PEG4SH）在1–5分钟内快速反应的条件。2 在365 nm波长光照下）以及光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次磷酸锂（LAP）。所得水凝胶在细胞培养条件下可稳定维持数周。为实现细胞驱动的降解与重塑，将一种可被酶切割的肽段整合至凝胶的交联结构中（即，GPQGIWGQ），15 以及一种模式原代细胞——人骨髓间充质干细胞（hMSCs）——在包封后及在这些基质中培养期间均保持高度活性。此外，已实现在这些材料内部对肽进行空间图案化，且hMSCs在光图案化条件下仍保持活性并具有代谢活性。其他侧接肽序列（此处未展示）例如IKVAV、YIGSR、GFOGER 等等。），也可被整合到基质中，以探究细胞与周围微环境之间的其他相互作用。这些结果表明，基于水凝胶的材料在三维（3D）细胞培养和递送方面具有广阔应用前景，可用于研究并调控多种细胞类型的细胞-基质相互作用。
本文介绍了在所提出的水凝胶体系中光封装细胞并随后对生化信号进行光图案化的技术（图1）。同时展示了观察和量化这些光图案的方法：特别是，i) 采用Ellman试剂法对图案化基底中游离巯基的修饰进行定性和定量分析，以及 ii) 利用荧光肽（AF488Pep1Alloc）进行互补的定性分析，以实现三维观察这些图案。此外，还提供了用于评估细胞活力（活/死细胞染色）和代谢活性（MTS法；3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑）的检测方法，以便使用者评估不同细胞系在水凝胶基质中进行光封装和光图案化处理时的细胞相容性。尽管本实验方案以一种简便的基于光的光点击水凝胶体系为例进行演示，但这些技术也可广泛应用于其他多种自由基引发的水凝胶体系，在细胞存在条件下实现光封装与光图案化。

<table><tbody><tr><td>定制多肽</td><td>多家供应商</td><td>----</td><td>多肽也可使用标准固相多肽合成（SPPS）技术制备，所需材料可从ChemImpex和ChemPep等供应商处获取。</td></tr><tr><td>4臂PEG硫醇，分子量20k</td><td>JenKem USA</td><td>4ARM-SH</td><td>列于多臂同功能PEG产品下。PEG4SH也可按前述方法自行合成。</td></tr><tr><td>苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次磷酸锂</td><td>Colorado Photopolymer Solutions</td><td>Li-TPO</td><td></td></tr><tr><td>二甲基苯基亚膦酸酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>149470</td><td>注意：可引起严重皮肤灼伤和眼损伤。操作时需佩戴防护手套、防护服和护目用具。</td></tr><tr><td>2,4,6-三甲基苯甲酰氯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>682519</td><td>注意：可引起严重皮肤灼伤和眼损伤。操作时需佩戴防护手套、防护服和护目用具。</td></tr><tr><td>溴化锂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213225</td><td></td></tr><tr><td>2-丁酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360473</td><td></td></tr><tr><td>圆底烧瓶，100&amp;nbsp;ml</td><td>Chemglass</td><td>CG-1506-05</td><td></td></tr><tr><td>80 ml 布氏漏斗，中号烧结</td><td>Chemglass</td><td>CG-1402-L-02</td><td>如需要，也可使用普通玻璃漏斗内衬滤纸。</td></tr><tr><td>磁力搅拌子</td><td>多家供应商</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌加热板</td><td>多家供应商</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>多家供应商</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>重水</td><td>Acros Organics</td><td>16630</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B（Fungizone）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td>根据细胞类型选择合适的培养基和胰蛋白酶。</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>多家供应商</td><td>----</td><td>1.5 或 2 ml 规格，无菌。</td></tr><tr><td>BD 带滑动（鲁尔）接头注射器（无针头）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-16H</td><td>此处列出的产品编号对应1 ml注射器（16H），其他规格也可提供（14-823-XX）。</td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium 普通载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>高纯度硅橡胶，厚度0.010&quot;，尺寸6&quot; × 8&quot;，硬度55A（垫片用）</td><td>McMaster Carr</td><td>87315K62</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，200度（无水）</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>RainX 原装</td><td>Amazon</td><td>800002243</td><td>也可从其他供应商处购买。</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>光刻掩模</td><td>Advance Reproductions Corporation</td><td>----</td><td>光刻掩模部门，可根据需要打印不同设计。</td></tr><tr><td>DTNB；Ellman试剂；5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PI-22582</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠，颗粒，ACS认证</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>正磷酸</td><td>Alfa Aesar</td><td>33266</td><td></td></tr><tr><td>盐酸半胱氨酸一水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒（适用于哺乳动物细胞）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 水溶液单试剂检测</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>多家供应商</td><td>----</td><td>转速需可达90–110 × g。</td></tr><tr><td>多孔板读板仪</td><td>多家供应商</td><td>----</td><td>可读取96孔板在405 nm处的吸光度。</td></tr><tr><td>落射荧光或共聚焦显微镜</td><td>多家供应商</td><td>----</td><td>用于观察水凝胶中的多肽图案和细胞。</td></tr><tr><td>Omnicure Exfo Series 2000</td><td>Excelitas Technologies</td><td>----</td><td>可使用其他光源系统进行水凝胶的光聚合。</td></tr><tr><td>Zeiss Zen Lite 软件</td><td>Zeiss</td><td>----</td><td>可在zeiss.com获取；适用于蔡司显微镜拍摄的图像</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>----</td><td>可在imagej.nih.gov获取；适用于常规图像分析</td></tr></tbody></table>

光介导的水凝胶形成与图案化及其在细胞培养中的应用

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

点击化学已被广泛研究用于多种生物材料领域，包括药物递送、组织工程和细胞培养。特别是光介导的点击反应，如光引发的巯基-烯（thiol−ene）和巯基-炔（thiol−yne）反应，能够实现对材料特性的时空控制，从而设计出具有高度用户可控性能的系统。利用光的精确性以及这些巯基-X光点击化学所提供的多功能性，来制备和修饰基于水凝胶的生物材料正受到越来越多的关注，尤其适用于在结构明确且仿生的微环境中进行细胞培养。本文描述了使用多功能且模块化的构建单元，通过巯基-烯光点击反应聚合，实现细胞的光包埋以及在水凝胶基质内对生化信号进行光图案化的技术方法。具体而言，介绍了一种构建水凝胶的方法：该水凝胶由烯丙氧羰基（allyloxycarbonyl, Alloc）功能化的肽交联剂和侧链肽基团，以及巯基功能化的聚乙二醇（PEG）组成，在酰基膦酸锂光引发剂和细胞相容剂量的长波长紫外光（UV）照射下可快速聚合。文中还描述了便于可视化光图案化过程以及定量所添加肽浓度的简便技术。此外，建立了包埋细胞（特别是人源间充质干细胞）并评估其存活率和活性的方法。尽管本文展示的是巯基-Alloc水凝胶的形成与初步图案化，但这些技术也可广泛应用于其他多种光引发或自由基引发的材料体系（e.g.，巯基-降冰片烯、巯基-丙烯酸酯），以制备具有特定图案的基底材料。

光封装细胞以及随后对含有封装细胞的凝胶进行光图案化的装置与操作步骤如图所示 图1， 并提供了配制10 wt%凝胶的储备溶液的示例 表1使用 表1，计算聚合水凝胶所需的单体（PEG4SH、Pep2Alloc、±Pep1Alloc）和光引发剂（LAP）的用量。根据这些计算结果，配制PEG4SH、Pep1Alloc、Pep2Alloc和LAP的储备溶液，并分别加入或不加入Pep1Alloc以形成和光图案化凝胶（图1A随后，从培养板中收集细胞，计数后按适当数量离心，用于包封。图1B). 将细胞沉淀重悬于凝胶形成溶液（PBS中的肽/聚合物/LAP）中，然后将细胞/单体混合物转移至玻璃或注射器模具中。在光照条件下（1-5分钟，10 mW/cm²）使细胞包埋于水凝胶中。2 在 365 nm 处）（图1C）。用于光刻图案化（图1D），凝胶分别浸泡于Pep1Alloc和LAP中30分钟至1小时30分钟，使肽段和引发剂扩散进入聚合基质。将含有肽段的凝胶覆盖具有特定图案的光掩膜，并接受第二轮光照（1分钟），以使肽段共价连接至基质中的游离巯基。仅在光照区域，侧链 tether 才会共价结合到凝胶上，从而促进细胞与基质间的特异性相互作用，并模拟天然细胞微环境的关键力学与生化特性，用于探究细胞功能与命运 体外.
Ellman's 法提供了一种简便且经济的方法，用于定量光图案化基质中凝胶修饰和多肽掺入的情况。图案化与非图案化凝胶（即，无论是否经过多肽修饰）在聚合后需浸泡于Ellman反应缓冲液中。随后，将半胱氨酸标准品及浸泡过的凝胶置于48孔板中，加入Ellman试剂进行孵育。图 2A， 左侧）。1小时30分钟后，取各样品等分试样加入96孔板的各个孔中，在405 nm处测定吸光度。绘制标准曲线（图2A， 右图展示了半胱氨酸标准品的吸光度随浓度变化的线性拟合曲线（吸光度 vs. 浓度），并可根据样品稀释倍数确定凝胶中游离巯基的含量。图中显示了10 wt%凝胶在不同聚合和光图案化条件下的游离巯基浓度。 图2B凝胶在无Pep1Alloc条件下分别聚合1分钟或5分钟（蓝色柱状图，I = 1分钟，II = 5分钟）时，其游离巯基浓度在统计学上无显著差异，表明反应迅速发生，且凝胶化在1分钟内已完成（双尾t检验，p < 0.05）。 &gt;0.05）。因此，额外的光照（2-5分钟）不会导致官能团的进一步转化。未添加Pep1Alloc、光照聚合1分钟的凝胶分别浸泡于Pep1Alloc（3 mg/ml）和LAP（2.2 mM）溶液中30分钟和90分钟（绿色柱，II = 30分钟，IV = 90分钟），随后接受第二轮1分钟的光照。游离巯基的减少（较1分钟条件减少60-80%）表明在此条件下，凝胶通过悬挂基团实现了高效修饰。若需更高的修饰程度，可提高Pep1Alloc溶液的浓度，因为在更稀释的肽溶液中，Pep1Alloc对游离巯基的可及性可能限制转化效率；例如，我们发现Pep1Alloc浓度高达20 mg/ml时仍可产生 &gt;游离巯基90%的转化率。
独特的是，可通过Ellman's试剂快速成像添加至水凝胶中的肽段模式图3A，5分钟内）。然而，由于黄色TNB的扩散，该图案的可视化会随着时间的推移而消失（超过5分钟）2- 通过凝胶观察二价阴离子。为了提高成像分辨率，并在细胞存在的情况下观察三维（x、y 和 z 平面）中的分布模式，可使用荧光肽标记（AF488Pep1Alloc）。在 图3B 共聚焦显微镜拍摄的图像堆栈的x、y和z投影如图所示，展示了图案分辨率（µm 比例尺）。
在可降解凝胶（Pep2Alloc = GPQG↓WGQ）中包封的人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在包封后第1天和第6天的存活率分别为（94 ± 2）% 和（94 ± 1）%，表现为绿色细胞体，仅有少量死亡细胞（红色细胞核）被观察到（图4A）。此外，在包封后第6天可观察到hMSC的伸展现象（图4A，插图），表明细胞能够重塑并与这些经RGDS修饰、可被基质金属蛋白酶（MMP）降解的基质相互作用。对包封于非可降解凝胶（Pep2Alloc = RGKGRK）中的细胞在包封后第1天和第3天进行代谢活性检测（图4B），作为细胞存活能力的另一项评估指标，结果表明，在不同光照包封和光图案化条件下（通过Ellman法测定，图2B），细胞仍保持活性。特别是，Pep1Alloc+LAP孵育30分钟与90分钟（条件III和IV）相比初始包封条件（条件I和II），其代谢活性无显著差异（双尾t检验，p &gt; 0.05），说明该方法适用于在包封细胞存在下进行光图案化操作。
<img alt="水凝胶形成过程示意图；光引发剂 LAP；Pep1Alloc 包封；凝胶图案化" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： 用于将细胞包封于水凝胶中并随后用生化信号进行光图案化的装置设置 (A) 将大分子单体和光引发剂的储备液配制并混合（PEG4SH = 主链，Pep2Alloc = 交联剂，Pep1Alloc = 侧链黏附基团（RGDS），LAP = 光引发剂）。B收集细胞用于包封。C细胞与不含或含有整合素结合肽的高分子溶液（分别为 PEG4SH/Pep2Alloc/LAP 或 PEG4SH/Pep2Alloc/Pep1Alloc/LAP）混合，并在光照下进行包封。 (D含有过量巯基的凝胶在形成过程中（此处为 PEG4SH/Pep2Alloc/LAP，含 2 mM 过量巯基）可通过后续添加带有单个烯丙氧羰基（alloc）功能化的多肽（Pep1Alloc）来实现生化信号的图案化 例如RGDS，IKVAV， 等等。以促进凝胶特定区域的细胞黏附。此处展示了用荧光标记的RGDS对凝胶进行图案化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="48孔板示意图、标准曲线及巯基分析的浓度柱状图。" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2： 定量Ellman法检测图案化水凝胶修饰的实验设置与结果。（A）将凝胶和半胱氨酸标准品与Ellman试剂在48孔板中孵育。绘制线性标准曲线以测定凝胶样品中的半胱氨酸浓度。（B）在凝胶形成过程中，水凝胶内引入过量游离巯基，并在与悬挂的alloc肽（Pep1Alloc）进行图案化时被消耗（I = 聚合1分钟；II = 聚合5分钟；III = 与Pep1Alloc孵育30分钟；IV = 与Pep1Alloc孵育90分钟；III和IV均经光照聚合1分钟并进行图案化）。所示数据为三次重复实验的平均值（n = 3），误差线表示标准误差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="时间延时荧光显微镜下的色谱方法，1至10分钟，发射分析。" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3： 使用Ellman试剂检测法和荧光图像可视化光图案化水凝胶。（A）Ellman试剂可用于快速检测x轴和y轴平面上的图案（线条）（黄色 = 未图案化区域，比例尺 = 1 mm）。（B）荧光标记的多肽可用于观察x、y和z轴三个平面上的图案（绿色 = 图案化区域；200 µm比例尺；10X水浸物镜；激发/发射波长488/525 nm）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养荧光显微镜图像与吸光度柱状图，展示细胞生长与吸光度。" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4： 不可降解光图案化水凝胶中细胞的存活率与代谢活性。（A）封装后24小时，包埋于水凝胶中的活细胞（绿色；激发/发射波长 488/525 nm）与死细胞（红色；激发/发射波长 543/580 nm）的共聚焦z轴层扫图像（z轴投影；10X水浸物镜）示例（比例尺 = 200 µm）。封装6天后，细胞在水凝胶中发生铺展（插图，比例尺 = 50 µm）。（B）在不同聚合（I = 聚合1分钟；II = 聚合5分钟）和图案化条件（III = 与Pep1Alloc孵育30分钟；IV = 与Pep1Alloc孵育90分钟；均经1分钟光照进行聚合与图案化）下，细胞在封装后第1天和第3天（分别为深色与浅色柱状图）均表现出代谢活性。所示数据为平均值（n = 3），误差线表示标准误差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="水凝胶制备流程图，包含 PEG4SH、Pep2Alloc 数据；分子量及浓度。" src="/files/ftp_upload/54462/54462tbl1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表 1"> 
表 1： 计算制备水凝胶所需各储备液体积的示例设置。 电子表格中以蓝色高亮的单元格表示用户自定义参数；其余数值将根据这些参数自动计算得出。用于制备凝胶的各储备液体积以橙色高亮显示。白色单元格中包含根据用户自定义参数计算最终体积所使用的公式。请注意，2.2 mM LAP 的浓度相当于 0.067 wt%。

我们描述了一种用于三维细胞培养的合成水凝胶基质的光介导形成及其后续生物化学图案化的连续过程。文中展示了利用细胞相容性光点击化学构建和修饰水凝胶的方法。此外，还介绍了对这些水凝胶中的图案进行定量与观察、以及测定细胞活力的简便技术。

点击化学已被研究用于多种生物材料领域，包括药物递送、组织工程和细胞培养。在……

本实验的总体目标是在基于合成聚合物的细胞外基质中形成、图案化并包封细胞。该方法可用于研究关键的生物学问题，例如识别调控细胞在异质微环境中响应行为的细胞外信号。该技术的主要优势在于，利用常规实验方案和易获取的材料即可构建出稳定的合成基质，用于细胞包封与培养。该方法可用于可控的细胞培养以及体外研究细胞反应。该方法可应用于其他系统，包括药物递送和组织工程。按照文本方案中的描述准备水凝胶形成的材料。将准直透镜连接到充满液体的导光管末端，以确保所有样品上的光照强度相对均匀。调节导光管与样品之间的距离，使光斑大小能够覆盖目标样品。为制备非图案化水凝胶，可通过移液将10至20微升凝胶前体溶液加入无菌剪断的注射器吸头中，制备成在吸头内成型的厚水凝胶。每个注射器制备一块凝胶，根据体积和注射器直径调整，使其厚度约为0.5至1.5毫米。通过将橡胶垫圈置于未涂层玻璃载片的边缘来制备玻璃载片模具，用于制备薄层水凝胶。随后，将5至10微升的凝胶前体溶液用移液器滴加到未涂层的玻璃载片上。将涂有抗粘连涂层的载玻片置于凝胶溶液上方，用小型文件夹夹固定载玻片以保持稳定。调节光源强度，使凝胶表面处的光强达到每平方厘米10毫瓦，适用于注射器尖端模具或载玻片模具。使用辐射计检测光强，并将模具置于灯下。光照 1 至 5 分钟，以确保凝胶完全聚合。聚乙烯对苯二甲酸酯含量较高的凝胶采用较短的聚合时间，含量较低的凝胶则采用较长的聚合时间，以制备出模量处于软组织范围内的完全聚合水凝胶。将凝胶从注射器尖端模具中取出，放入无菌未处理的48孔板中，并将玻璃盖片放入无菌培养皿中。为制备图案化水凝胶，按照文本方案中的描述配制前体溶液，并用力吹打溶液以确保充分混匀。接着，将预先形成的含有五聚体肽的凝胶覆盖于磷酸锂光引发剂溶液中，在37摄氏度下孵育一小时。孵育结束后，去除多余的溶液。若凝胶在注射器尖端内成型，则使用刮刀小心地将凝胶从48孔板转移至无菌载玻片上进行图案化。将带有目标图案的光掩模直接放置在注射器和载玻片成型的凝胶上方，确保掩模的印刷部分与凝胶接触，以获得最佳的图案保真度。将样品置于灯下照射一分钟。图案化后，将注射器模具制备的凝胶放入无菌的48孔非组织培养处理板中；将附着在载玻片上的玻璃片模具制备的凝胶放入无菌培养皿中。用培养基或根据计划实验选择的适当缓冲液冲洗三次，每次15分钟。为了检测和定量光图案化水凝胶中的游离巯基，首先按照文本方案中所述准备溶液并进行计算。如前所述制备用于图案化的薄水凝胶。具体操作如下：制备含有过量游离巯基的凝胶，并使用透明盖玻片将其中一半样品用五邻体肽进行图案化，以充分暴露整个凝胶接受光照。将图案化与未图案化的凝胶分别置于48孔板的孔中。用Ellman反应缓冲液冲洗15分钟，重复三次，以使末端反应产物从凝胶中扩散出来，并达到平衡溶胀状态。向清洗后的凝胶中添加额外的Ellman反应缓冲液，使凝胶溶胀后的总体积为20微升的整数倍。例如，若预测溶胀后凝胶体积为15微升，则加入5微升反应缓冲液；若预测溶胀后凝胶体积为30微升，则加入10微升反应缓冲液。将半胱氨酸标准品以20微升的倍数加入48孔板的各个独立孔中。具体体积取决于前一步骤所用体积。例如，若前一步骤中凝胶体积膨胀，并额外添加了40微升反应缓冲液，则需将每种标准品各40微升分别加入各个独立的空孔中。接下来，稀释Ellman试剂和反应缓冲液。将稀释后的Ellman试剂加入含有标准品和样品的孔中。对于20 µL的样品，向每孔中加入183.6 µL溶液。孵育或置于摇床上一小时三十分钟，或直至溶液颜色通过目视检查与凝胶颜色一致，以确保黄色的2-硝基-5-硫代苯甲酸二价阴离子充分扩散，该物质由Ellman试剂与凝胶中的游离巯基反应生成。从样品和标准品中各取100微升溶液，加入96孔板的孔中。使用酶标仪在405纳米处读取吸光度。为了观察光刻图案，用纸巾轻轻擦拭水凝胶边缘以去除多余的反应缓冲液。将Ellman试剂直接滴加到凝胶表面，立即在10倍光学显微镜或配备彩色相机的体视显微镜下进行成像。收集细胞并按照文本方案中的描述进行包封前处理。吸除PBS后，立即将沉淀的细胞重悬于前体溶液中，最终浓度为每微升五千个细胞。保留适量的游离巯基，用于后续与五邻体肽的反应。如果需要进行光刻图案化，则按前述方法制备模具、聚合并图案化水凝胶。图案化后，将凝胶在培养基中冲洗三次，每次10分钟，以去除未反应的物质和过量的磷酸锂光引发剂。将凝胶置于37摄氏度、5% CO2条件下，在生长培养基中孵育至所需分析时间点。每48小时或根据实验需求补充培养基。为测定包封细胞的活力，首先移除凝胶中的生长培养基，并用PBS冲洗三次，每次15分钟，以促进培养基从凝胶中充分扩散。向1毫升无菌PBS中加入2微升已解冻的2毫摩尔溴化乙锭同源二聚体-1和0.5微升已解冻的4毫摩尔钙AN溶液，涡旋混匀以确保充分混合。向48孔板中的每个注射器模具凝胶中加入300微升上述溶液，或加入足量溶液以覆盖无菌培养皿中载玻片上凝胶的表面。孵育45分钟。去除多余的溶液，冲洗以除去凝胶中残留的染料。在共聚焦显微镜下对细胞成像。或者在具有10倍放大功能的落射荧光显微镜下，使用488纳米激发光和525纳米发射光进行观察。通过Ellman试剂法对未图案化和图案化水凝胶的游离巯基浓度进行定量分析，结果表明，聚合1分钟和5分钟的水凝胶具有统计学上相似的游离巯基浓度，说明反应迅速，且在1分钟内已实现完全凝胶化。将水凝胶与五邻体肽分别孵育30分钟、1小时和1小时30分钟后，其游离巯基浓度降低了60%至80%，表明过量的巯基得到了有效修饰。通过将光照射到覆盖有掩膜的样品上形成的光刻图案（此处掩膜上印有线条），可在二维条件下使用Ellman试剂观察到；或者，在后续成像中结合荧光肽，可实现三维观察。将包封在水凝胶中的成人人体干细胞用细胞活力和水凝胶毒性染色剂处理，并通过共聚焦显微镜成像。细胞膜完整、具有活力的细胞呈绿色标记，表明细胞在包封后一天仍存活。细胞在包封后六天开始在基质中铺展。如插图所示。在进行该操作时，重要的是要始终牢记保持无菌和谨慎的操作程序，以防止因引入污染物或机械剪切力而在包封后对细胞造成损伤。通过这一操作，还可进一步开展免疫染色、流式细胞术和基因表达分析等其他方法，以研究细胞在响应胞外环境时的功能与命运。该技术为生物学、生物工程学和医学领域的研究人员提供了途径，使其能够在具有用户自定义特性控制的合成胞外基质中，研究组织区域的侵蚀或疾病进展，从而推动新治疗策略的开发。观看本视频后，您应能够充分理解如何包埋细胞，以及如何对软基质进行图案化，以实现可控的细胞培养研究。

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科研

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生物工程

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