激光辅助畜禽受精卵细胞质显微注射

该程序的总体目标是在激光的帮助下使用钝头针有效地将溶液输送到牲畜受精卵的细胞质中。这种方法用于研究和动物转基因领域，因为与基因组编辑工具（如 CRISPR Cas9 系统）相关联，它可以以非常简单可靠的方式创造新的奶牛来研究基因功能和转基因动物。该技术的主要优点是它可用于将任何溶液输送到大型动物受精卵的细胞质中。

用一个方便的人的注射效率使动物肝脏的 lomotil 率最低。首先，通过将硼硅酸盐玻璃毛细管放入微量移液器拉拔器并将其锁定到位来准备注射微量移液器。使用适当的程序拉动毛细管，使其产生具有长锥度的薄尖端。

然后，小心地从设备中取出拉出的移液器，并将它们水平放置在 microforge 上。聚焦拉出的移液器和 microforge 加热丝及其玻璃珠。使用目镜标线测量所需的厚度，然后水平移动移液器，直到加热丝达到 5 微米的目标内径。

将热量调节到约 45%，然后轻轻放下移液器，使其接触灯丝。然后，短暂地启动加热器。这将使移液器略微熔化，使其粘附在细丝上，冷却后，移液器将在接触点断裂，产生笔直的切口。

设置正确的温度是此步骤的关键。温度过高会使移液器弯曲，而温度过低则不足以切割移液器。接下来，将吸头放置在距离加热灯丝约 30 微米的位置，在移液器吸头附近形成大约 10 度角。

将温度设置为 60% 并启动加热器，使移液器在灯丝上弯曲到所需的角度。使用此处显示的设置，拉动玻璃毛细管，使微量移液器具有细尖端，具有长而均匀的锥度和平行壁。小心地从拉取装置中取出拉出的移液器，并将其水平放置在 microforge 支架上。

使用目镜标线测量移液器直径并移动移液器，直到其在灯丝上的直径达到 180 微米。用金刚石笔尖在玻璃毛细管上做标记，然后轻轻按压拉出的笔尖以打破玻璃。这应该会导致笔直的切割。

接下来，将移液器移至垂直位置，使其尖端靠近细丝。将 microforge 的温度设置为 60%，并使用标准技术对移液器的尖端进行火抛光，直到内径达到目标尺寸。测量移液器的内径，应为 40 微米。

使用与之前相同的步骤，将尖端弯曲成 30 度角。将固定移液管插入左侧显微作器支架，将注射移液管插入右侧显微作支架。然后，用油填充注射移液管。

使用显微作器控件将移液器置于显微镜视野的中心。使用 4 倍放大倍率，检查微量移液器吸头的角度是否正确，以便它们与培养皿底部平行。将 50 微升的 37 摄氏度 SOF-HEPES 溶液（补充有 20% FBS）滴到 100 毫米培养皿的盖子中心。

然后，将 1 至 2 微升待注射溶液滴在靠近注射滴的位置。接下来，使用大约 10 毫升矿物油覆盖滴剂和注射板。将板放在显微镜载物台上，并使用微量分配器在注射液滴的上侧加载约 20 至 30 个受精卵。

使用 4X 物镜，通过对显微注射器施加负压，将要注射的溶液加载到注射移液管中。加载足量的溶液以注射 2 到 3 个受精卵，然后移至注射滴。在注射液滴中，移动固定移液管，使吸头靠近受精卵。

用固定的微量注射器施加负压，使受精卵固定在固定移液管上。固定受精卵后，更改为 20 倍物镜。通过轻轻触摸注射部位的受精卵，检查注射移液管是否位于胚胎的中平面上。

如果它不在中间平面上，针头会倾向于使胚胎旋转，而不是穿刺。接下来，使用软件将激光垂直放置在将要打孔的透明带中。正确定位后，使用激光控制窗口并单击 FIRE 按钮。

确保孔的大小足够大，以便在透明带上形成一个开口，以便针头通过而不会损坏质膜。将注射针穿过透明带上的孔并与质膜接触。继续向前推动移液器，直到针头进入胚胎的 3/4。

观察溶液油界面处弯月面的位置。这将用于持续控制注射量。对注射移液管施加负压，将质膜和细胞质吸入注射针中。

继续直到针头中细胞质的运动加速或可以看到细胞质内容物与注射液混合时。这些将表明质膜破裂。通过施加正压，将细胞质内容物注射回去，然后将溶液注入受精卵的细胞质中，直到溶液油间期的弯液面超过起点后方一个受精卵的直径等效物。

然后，更改为 4 倍物镜，并将注射的胚胎移动到注射液滴的下侧。通过在固定的微型注射器上施加正压来释放胚胎。使用微型分配器收集注射的胚胎。

通过将注射的胚胎穿过三滴 SOF-HEPES 来清洗注射的胚胎并培养它们，如随附的文本方案中所述。在荧光图像中可以看到溶液的成功递送，其中 dexion red 用于跟踪注射部位以及注射效率和准确性。在这里，染料均匀分布在细胞质中，这是使用这种技术时的典型情况。

该方案在牛和绵羊受精卵中的裂解率最低。由于显微注射，很少注射的胚胎在牛或绵羊体内裂解。此外，牛和绵羊胚胎的对照组和注射组的囊胚发育速率没有统计学意义差异。

一旦掌握，这项技术就可以以每分钟两个胚胎的速度完成。具有方便的人注射效率，最大限度地降低动物囊胚率。看完这个视频，你应该了解如何在牲畜受精卵中进行激光辅助卵胞浆内显微注射。

以及如何使用正负抽吸压力来确保质膜破裂以实现高效输送。