利用新型荧光探针对质膜中磷脂酰肌醇4,5-二磷酸进行单分子超分辨率成像 磷脂酰肌醇4,5-二磷酸，质膜，单分子成像，超分辨率显微镜，荧光探针

本研究的总体目标是利用单分子荧光定位显微镜技术，揭示磷脂酰肌醇4,5-二磷酸在细胞质膜中的纳米级分布。该方法有助于回答关于磷脂酰肌醇信号转导的关键问题，例如：细胞膜中信号复合物下方磷脂酰肌醇类分子的纳米级组织结构是怎样的？

该技术的主要优势在于其高空间分辨率，以及避免了去垢剂处理——这在磷脂形态学研究中是一个重要问题。该方法包括三个主要步骤。步骤一：从活细胞制备质膜片。

第二步：磷脂酰肌醇标记与单分子荧光成像。第三步：单分子定位与成像重建。在实验当天，用0.5至1毫升PDL包被盖玻片。

一到两小时后，用纸巾从盖玻片边缘吸去多余的PDL。然后将盖玻片置于金属板上，于4摄氏度保存。接着用含有1毫摩尔EGTA的冰冻PBS溶液半毫升至一毫升洗涤已生长在盖玻片上的透化INS-1细胞。

重复此洗涤步骤三次，并吸去多余的 PBS。现在用镊子将带有培养细胞的盖玻片放置到 PDL 包被的盖玻片上，细胞面朝下。此操作需在预冷的金属板上进行。

然后将培养板转移至 4°C 环境中放置 7 到 10 分钟，使细胞有足够时间贴附。接着使用镊子轻轻剥离载有细胞的盖玻片，从而在 PDL 包被的盖玻片上留下一层薄薄的细胞膜。随后用 0.5 至 1 毫升预冷的 PBS 轻柔清洗膜片。

现在将每张膜片置于约150微升冰冷的含有0.2%戊二醛的4%多聚甲醛PBS溶液中固定。在4°C条件下固定15分钟。固定后，可立即进行成像，或用冰冷的PBS覆盖样品并置于4°C保存。

如果使用 pH 探针，强烈建议立即进行成像。本实验采用基于全内反射荧光（TIRF）显微镜的单分子定位显微成像（SMLM）系统。在对膜进行成像前，将一微升荧光微珠溶液加入十毫升含 50 毫摩尔氯化镁的磷酸盐缓冲液（PBS）中稀释。

然后将样品加入成像室，加入200微升稀释液，静置10分钟。接着用PBS洗涤样品三次。现在启动PALM成像系统。

在关联的成像软件中选择 iRFP 通道按钮。然后在 iRFP 通道中找到表达 pH 探针的细胞膜，使用荧光微珠进行漂移校正。将正常的 TIRF 角度设置为 2140，该值比 TIRF 临界角深 1.5，应作为默认角度。

然后使用捕获按钮在 iRFP 通道中采集一幅常规的全内反射荧光（TIRF）图像作为参考。接下来，单击 RFP 通道按钮切换至 PAm-Cherry1 通道。随后将 AOTF 控制面板中的滚动条完全调至最右侧，以实现最大强度照明，并照射激光约 10 到 20 秒，以漂白背景膜荧光。

接下来，在“格式”选项卡下将相机设置调整为2×2 binning模式。然后，在“ND序列采集”选项卡中设置快速采集协议，以20赫兹采集30 000幅图像。在图像采集过程中，对405纳米激光器施加0.1%至1%的功率，以便每帧图像中空间上分离的点能够清晰可辨。

现在通过点击“立即运行”按钮获取 PAm-Cherry1 图像。在采集过程中，可被激活的分子数量将逐渐减少。为应对这一情况，需逐步增加 405 纳米激光的强度，以维持信号的最佳密度。

获取图像，直至所有 PAm-Cherry1 信号均被激活。后续进行图像处理与重建时，从每帧图像中识别并定位单个分子事件。通过小波变换中的阈值数设置滤波强度阈值。

文本方案中提供了更多详细信息。PIP2的空间分布对不同的固定方法敏感，文本中描述了适当的固定方法。使用PIP2抗体或特异性pH结构域标记时，PIP2探针显示出一致的分布。相比之下，用EGFP标记的pH结构域标记的活细胞成像结果并无显著差异。

所有样本均显示出探针的均匀分布。相比之下，非最佳固定会导致 PIP2 出现明显且密集的簇状聚集，并导致信号强度下降。在最佳固定条件下，固定细胞中 PIP2 的超分辨率图像显示，探针在质膜的大部分区域呈均匀分布，仅有有限的浓度梯度。

一些富含 PIP2 探针的膜区域呈稀疏分布，且大小各异。活细胞 PALM 图像显示出与固定细胞相似的空间分布。对 PIP2 信号的详细分析表明，其在局部区域的动力学变化较快，但这并未导致其总体丰度发生显著改变。

该技术为磷脂研究领域的科研人员提供了一种新方法，用于探索生理条件下其他磷脂酰肌醇亚型的分布与活性。