的快速方法新颖的RNA结合蛋白隔离

该程序的总体目标是有效地分离具有体内 RNA 相关蛋白质的特异性 RNA。这种方法可以帮助回答 RNA 代谢和调控中的关键问题，例如与特定转录本结合的一组不同的 fau-bee-pees 是什么。该技术的主要优点是分离效率高，可对贵重 mRNA 相关蛋白进行后续鉴定。

该快速方法利用共表达 MS2 标记的 MRNA 的酵母菌株以及 MS2 结合蛋白和 streptavadin 结合蛋白的融合蛋白。在 30 摄氏度下，在合成葡萄糖或 SD 选择性培养基中培养 500 毫升酵母细胞，使 OD600 为 0.8 至 1.0。细胞准备好后，在室温下以 3000 倍 G 离心 4 分钟，然后弃去上清液。

在 PBS 中洗涤细胞并再次离心。弃去上清液，将细胞重悬于等体积的不含蛋氨酸的 SD 中。在 30 摄氏度下孵育 45 至 60 分钟，以诱导融合蛋白的表达。

45 至 60 分钟后，留出 10 毫升细胞用于 RNA 提取，并使用剩余的细胞进行快速纯化。要开始此过程，向细胞中加入 1.35 毫升 37% 甲醛，最终浓度为 0.1% 以交联 RNA-蛋白质复合物。继续在 30 摄氏度下孵育 10 分钟。

要停止交联，加入 26.5 毫升 2.5 摩尔甘氨酸，至终浓度为 0.125 摩尔，并在 30 摄氏度下孵育 3 分钟。从这里开始，将所有东西放在冰上并快速工作以尽量减少 RNA 降解。将细胞在 4 摄氏度下以 3000 倍 G 离心 4 分钟。

弃去上清液，加入 45 毫升冷 PBS，然后再次离心。去除上清液，将细胞重悬于 5 mL含有高浓度 Rnase 抑制剂的快速裂解缓冲液中。将细胞悬液分成 500 μL 的等分试样，装在带螺口的微量离心管中，并向每个等分试样中加入约 400 毫克的冷藏玻璃珠。

在打珠器中裂解细胞 3 分钟。立即将裂解物放在冰上。将裂解物转移到新的微量离心管中。

切下 5 毫升注射器的顶部，将其放在 15 毫升空管上，用作螺旋盖管的适配器。用热针在每根试管的底部刺穿一个小孔，然后将它们放在合适的 15 毫升试管的顶部。在 4 摄氏度下以 3000 倍 G 离心 1 分钟，以将裂解物洗脱至 15 mL 试管中。

将每根 15 mL 试管中的流出液转移到新的 1.5 mL 试管中，并在 4 摄氏度下以 10， 000 倍 G 离心 10 分钟，以清除细胞碎片。将所有 1.5 mL 试管中的上清液合并到一个 15 mL 试管中。留出 1/50 和 1/100 体积的裂解物分别用于 RNA 和蛋白质分离。

通过向细胞裂解物中加入 300 μg 亲和素，开始分离 RNA 蛋白复合物的快速程序。在 4 摄氏度下不断滚动孵育 30 分钟。当细胞裂解物与亲和素一起孵育时，预洗链霉亲和素珠子，转移约 300 微升链霉亲和素珠浆，称取 1.5 毫升微量离心管，离心制剂，然后去除上清液，这将产生 250 微升珠子。

向磁珠中加入 1 mL 快速裂解缓冲液，并在 4 摄氏度下以 660 倍 G 离心 2 分钟。去除上清液并用快速裂解缓冲液再次洗涤。为了封闭磁珠，加入 0.5 mL 快速裂解缓冲液、0.5 mL/BSA 和 10 μL 酵母 TRNA，并在 4°C 下以恒定旋转孵育 1 小时。

用 1 mL 快速裂解缓冲液洗涤珠子两次。将 250 μL 预洗的链霉亲和素珠子添加到含有亲和素的裂解物中，并在 4 摄氏度下以恒定旋转孵育 1 小时。该孵育时间是提供足够的结合时间和最大限度地减少 RNA 降解机会之间的折衷方案。

1 小时后，在 4 摄氏度下以 660 倍 G 离心 2 分钟，以清除链霉亲和素珠。将上清液转移至 15 mL 试管中。留出 1/50 和 1/100 体积的裂解物分别用于 RNA 和蛋白质分离。

向磁珠中加入 1 mL 快速裂解缓冲液。通过移液混匀，转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，并在 4 °C 下以 660 倍 G 离心 2 分钟。用快速裂解缓冲液再洗涤 3 次。

用快速裂解缓冲液最后一次洗涤后，去除上清液，加入 1 毫升快速洗涤缓冲液，并在 4 摄氏度下旋转 5 分钟。离心并用快速洗涤缓冲液再洗涤 2 次。用 1 毫升 PBS 洗涤珠子，然后像以前一样离心。

取出上清液，向珠子中加入 120 μL PBS，并在滚筒中旋转 5 分钟。像以前一样离心并收集所有用于 RNA 和蛋白质提取的上清液作为洗涤样品。要洗脱 RNA 和 RNA 相关蛋白，向磁珠中加入 120 μL 6 毫摩尔生物素的 PBS 溶液，并在 4 摄氏度下以恒定旋转孵育 45 分钟。

离心珠子并将逃脱的材料转移到新的 1.5 毫升试管中。再次离心洗脱的样品，并将上层相转移到新的 1.5 mL 试管中，以确保没有磁珠残留。采集样品进行 RNA 或蛋白质提取。

为了确定 RNA 的分离效率和质量，对两个标记的 RNA 进行了 Northern 分析。PMP1 和 FPR1，来自铸型细胞裂解、快速细胞裂解和生物素洗脱后。通过溴化乙锭染色检测核糖体 RNA，洗脱样品中缺乏核糖体 RNA 表明纯化的严格性。

洗脱样品中缺乏未标记的 mRNA 信号，进一步证明了纯化的严格性和特异性。FPR1 泳道中的表观信号不是 ACT1 的大小，是先前与 MS2L 探针杂交的遗留物。尽管与通过热苯酚实验步骤纯化的 RNA 相比，输入 RNA 的降解程度更高，但正如洗脱组分中的强信号所揭示的那样，大量全长标记的 RNA 被特异性分离出来。

蛋白质样品可在蛋白质组学分析之前通过 SDS-PAGE 和银染进行分析。箭头所示的 MS2-CP-GFP-SBP 融合蛋白表现出相等的蛋白质上样量。星号表示后来从凝胶中切下用于质谱分析的具有不同强度的条带。

尝试此程序时，请务必戴上手套，确保工作区域干净，用不含 RNA 的水制备溶液，并快速有效地工作以缩短程序时间。不要忘记，使用苯酚和甲醛等试剂可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如在化学罩中工作。看完这个视频，你应该对如何高效和有效地纯化 fayn-tress 及其相关体的 RNA 有了很好的了解。

按照此程序，可以执行其他方法（如 RNA-Seq）来检测结合目标转录本的 RNA。