通过RaPID方法分离新型RNA结合蛋白

本实验的总体目标是高效分离与特定 RNA 在体内结合的蛋白质。该方法有助于解答 RNA 代谢与调控领域中的关键问题，例如某一特定转录本上结合的独特 RNA 结合蛋白有哪些。该技术的主要优势在于其高效率的分离能力，可进一步用于鉴定与特定 mRNA 相关的蛋白质。

该快速方法利用一种酵母菌株，该菌株共表达带有MS2标签的mRNA以及MS2结合蛋白与链霉亲和素结合蛋白的融合蛋白。在30°C下，将500毫升酵母细胞在合成葡萄糖（SD）选择性培养基中培养至OD600为0.8至1.0。当细胞生长达到所需状态时，在室温下以3000 × g离心4分钟，并弃去上清液。

用 PBS 洗涤细胞，再次离心。弃去上清液，并将细胞重悬于等体积的无甲硫氨酸 SD 培养基中。在 30 摄氏度下孵育 45 至 60 分钟，以诱导融合蛋白的表达。

孵育45至60分钟后，留出10毫升细胞用于RNA提取，其余细胞用于快速纯化。开始该步骤时，向细胞中加入1.35毫升37%甲醛，使终浓度达到0.1%，以交联RNA-蛋白质复合物。随后在30摄氏度继续孵育10分钟。

为终止交联反应，加入26.5毫升2.5摩尔的甘氨酸，使终浓度达到0.125摩尔，并在30摄氏度下孵育3分钟。此后，将所有样品置于冰上并快速操作，以尽量减少RNA降解。在4摄氏度下以3000 × g离心4分钟。

弃去上清液，加入45毫升冷的PBS，再次离心。移除上清液，将细胞重悬于5毫升含有高浓度RNase抑制剂的快速裂解缓冲液中。将细胞悬液分装至带螺帽的微量离心管中，每管500微升，并向每管加入约400毫克预冷的玻璃珠。

使用珠磨机裂解细胞，持续三分钟。立即将裂解液置于冰上。将裂解液转移至新的微量离心管中。

剪下5毫升注射器的顶部，并将其套在一个空的15毫升离心管上，作为螺口管的适配器。用加热的针在每个管底部刺一个小孔，然后将这些管子放在已改装的15毫升离心管上。将管组件在4°C条件下以3000 × g离心1分钟，以使裂解液流入15毫升离心管中。

将每个15毫升离心管中的流穿液转移至新的1.5毫升离心管中，在4摄氏度下以10,000 × g离心10分钟，以去除细胞碎片。将所有1.5毫升离心管中的上清液合并至一个15毫升离心管中。分别留取裂解液体积的1/50和1/100用于RNA和蛋白质的提取。

通过向细胞裂解液中加入300微克亲和素（Avidin）开始快速分离RNA-蛋白质复合物的操作。在4摄氏度下持续滚动孵育30分钟。在细胞裂解液与亲和素孵育的同时，预先洗涤链霉亲和素磁珠，将约300微升链霉亲和素磁珠悬液转移至1.5毫升微量离心管中，离心处理后弃去上清液，得到250微升磁珠。

向珠子中加入1毫升快速裂解缓冲液，在4摄氏度下以660 × g离心2分钟。弃去上清液，并用快速裂解缓冲液再次洗涤。为封闭珠子，加入0.5毫升快速裂解缓冲液、0.5毫升BSA和10微升酵母tRNA，在4摄氏度下持续旋转孵育1小时。

用1毫升快速裂解缓冲液洗涤磁珠两次。将250微升预洗涤的链霉亲和素磁珠加入含亲和素的裂解液中，在4摄氏度下持续旋转孵育1小时。该孵育时间是在保证充分结合时间与尽量减少RNA降解风险之间的一种折中方案。

孵育1小时后，在4摄氏度下以660 × g离心2分钟，以去除链霉亲和素磁珠。将上清液转移至15毫升离心管中。分别保留裂解液总体积的1/50和1/100，用于RNA和蛋白质的分离。

加入1毫升快速裂解缓冲液至珠子中，用移液器混匀，转移至新的1.5毫升微量离心管中，在4摄氏度、660 × g条件下离心2分钟。再用快速裂解缓冲液洗涤3次。

用快速裂解缓冲液进行最后一次洗涤后，移去上清液，加入1毫升快速洗涤缓冲液，在4摄氏度下旋转5分钟。离心后，再用快速洗涤缓冲液洗涤2次。用1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤磁珠，并按前述方法离心。

移除上清液，向珠粒中加入 120 µL PBS，于滚轴混合器上旋转孵育 5 分钟。按前述条件离心，收集全部上清液用于 RNA 和蛋白质提取，作为洗涤样本。为洗脱 RNA 及与 RNA 结合的蛋白质，向珠粒中加入 120 µL 含 6 mM 生物素的 PBS，4 °C 下持续旋转孵育 45 分钟。

离心磁珠，并将洗脱的液体转移至新的1.5毫升离心管中。再次离心洗脱样品，将上清液转移至新的1.5毫升离心管，以确保无磁珠残留。取样用于RNA或蛋白质提取。

为了确定RNA的分离效率和质量，对来自铸模细胞裂解、快速细胞裂解以及生物素洗脱后的两种标记RNA（PMP1和FPR1）进行了Northern分析。核糖体RNA通过溴化乙锭染色检测，洗脱样品中缺乏核糖体RNA表明纯化过程具有较高的严谨性。

纯化的严谨性和特异性进一步体现在洗脱样品中未检测到无标签mRNA的信号。FPR1泳道中出现的微弱信号并非ACT1大小的条带，而是之前使用MS2L探针杂交残留所致。尽管输入RNA的降解程度略高于采用热酚法纯化得到的RNA，但洗脱组分中仍能特异性地分离出大量全长的标签RNA，这由洗脱组分中的强信号所证实。

在进行蛋白质组学分析之前，可通过SDS-PAGE和银染分析蛋白质样品。箭头所示的MS2-CP-GFP-SBP融合蛋白表明各泳道蛋白质上样量均等。星号标记的条带具有不同的强度，随后被从凝胶中切下用于质谱分析。

进行该实验操作时，务必佩戴手套，确保工作区域清洁，使用无RNA酶的水配制溶液，并快速高效地操作以缩短实验时间。切勿忘记，使用苯酚和甲醛等试剂可能具有极高危险性，因此在操作过程中应始终采取预防措施，例如在通风橱内进行实验。观看本视频后，您应能够充分理解如何高效且有效地纯化纤毛及其相关结构中的RNA。

完成此操作后，可进行其他方法（如RNA-Seq），以检测与目标转录本结合的RNA。