利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）进行“吞噬体闭合检测”以三维可视化吞噬体形成过程

本实验方案的总体目标是利用全内反射荧光（Total Internal Reflection Fluorescence，TIRF）显微镜技术，在活体巨噬细胞中以三维方式可视化吞噬体的形成过程以及吞噬体分裂的精确位点。该方法结合TIRF显微镜与落射荧光技术，逐步监测两种不同荧光蛋白在伪足延伸及顶端融合过程中的定位变化。该技术提供了一种系统性方法，用于确定临界角并获得TIRF信号，这对于推断靠近质膜的事件至关重要。

在进行TIRF显微镜实验的前一天，将加热腔室预热至37摄氏度，以确保显微镜载物台均匀受热。次日早晨，使用100 µL PBS（含0.1% BSA）清洗每35毫米玻璃底培养皿中的7×10⁶个绵羊红细胞（SRBCs），清洗两次。第二次离心后，将细胞重悬于500 µL PBS（含0.1% BSA）中，并加入兔IgG抗SRBCs抗体（亚凝集浓度），每5 µL细胞加入5 µL抗体，缓慢旋转孵育30分钟。

孵育结束后，用含BSA的PBS洗涤SRBCs两次，并将细胞重悬于每皿2毫升、37摄氏度的无血清显微镜成像培养基中。然后，用2毫升0.1%多聚-L-赖氨酸在室温下处理35毫米玻璃底培养皿30分钟，随后用2毫升PBS洗涤两次。为实现SRBCs的非共价固定，将2毫升经IgG包被的细胞加入各多聚赖氨酸包被的培养皿中，并将样品置于摆动转子离心机中离心。

弃去上清液，用 2 毫升含 10% BSA 的 PBS 洗涤颗粒一次。然后将颗粒与 2 毫升新鲜的含 10% BSA 的 PBS 在室温下孵育 30 分钟，随后用 2 毫升 PBS 洗涤三次。最后一次洗涤后，弃去 PBS，加入 2 毫升 37 摄氏度的无血清显微镜成像培养基。

将一个涂有SRBC的培养皿置于显微镜载物台上。然后，从培养皿底部刮下转染的靶细胞，反复吹打数次以获得单细胞悬液。将转染的细胞加入到涂有SRBC的培养皿中。

启动实时采集软件。寻找表达荧光标记蛋白的细胞，并调整培养皿的位置，使目标细胞位于视野中央。在单一激发波长下，以0.01度为步长，从0度到5度范围内采集500张不同角度的图像。

为了确定入射光在玻璃-介质界面发生全反射并产生隐逝波的关键角度，请在适当的成像软件中打开图像序列。在细胞中选择一个荧光均匀的感兴趣区域。然后，在“图像”选项卡下选择“堆栈”，再选择“绘制Z轴轮廓”。

在x轴上以角度为函数，绘制在感兴趣区域内测得的z轴方向平均荧光强度分布图。在显微成像过程中，x轴上任何大于临界角的角度值均可用于获取全内反射荧光（TIRF）信号。接下来，在实时采集软件中，使用协议编辑器设置采集参数。

包括环路采集序列的数量、荧光通道及其激光强度、TIRF 角度以及曝光时间。设置物镜的 Z 向移动以到达落射荧光模式平面。然后，在落射荧光模式下，将 TIRF 角度设为 1，再将物镜的 Z 向移动恢复至 TIRF 平面。

然后，在明场LED模式下获取细胞的图像。接着，寻找一个表达中等水平荧光标记蛋白、正在吞噬SRBC且处于视野中央的细胞。注意，此类细胞可通过其颗粒周围延伸的细胞膜来识别。

在“循环次数”选项卡中输入帧数，以开始采集 500 到 1,000 帧的流式图像。如有需要，调整激光强度和曝光时间，以适应细胞中不同水平的荧光信号。为生成对应于两个通道的两个独立图像序列，请在成像软件中打开序列，然后点击“图像”选项卡。

在“超堆栈”菜单中，选择“堆栈转超堆栈”。随后，在弹出窗口中，将“顺序”设为 xyctz，将“通道”数设为所用荧光染料的数量，将“Z 轴”层数设为 z 方向的切片数，将“帧”数设为图像总数除以通道数，并将“显示模式”设为灰度。然后，拆分各通道。

此处展示了一个典型的活细胞全内反射荧光（TIRF）显微镜视频，记录了原始264.7巨噬细胞吞噬IgG包被的绵羊红细胞（SRBC）过程中吞噬体闭合的实验。当伪足的顶端在SRBC周围与玻璃盖玻片相对时，可在TIRF区域检测到F-肌动蛋白环，该环逐渐收缩直至闭合。与此同时，将载物台向上移动三微米，超出TIRF区域后，通过落射荧光检测到的模糊F-肌动蛋白信号对应于吞噬杯基部的去聚合过程。

三分钟后，经透射光成像证实，SRBC已完全被内化。利用该方法，可显示吞噬杯底部肌动蛋白的分布，此处也是细胞内区室发生局灶性胞吐的位置。细胞获取后，可进一步进行相关联的电子显微镜分析；或者将整个细胞群体固定并冷冻处理，用于经典的免疫荧光显微镜观察。

需要注意的是，吞噬作用对温度非常敏感，因此在整个实验过程中，加热腔和培养皿中的培养基温度应始终保持在恒定的37摄氏度。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对颗粒进行调理、用颗粒包被盖玻片、确定全内反射荧光显微镜（TIRF）的关键角度，以及对活细胞吞噬过程中目标蛋白的定位进行成像。