"吞噬体封闭试验"可视化吞噬体形成的三个维度利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）

该协议的总体目标是使用全内反射荧光或 TIRF 显微镜在活巨噬细胞中可视化吞噬体形成以及 3D 吞噬体分裂的精确位置。该方法将 TIRF 显微镜与落射荧光相结合，以监测伪足延伸和尖端融合过程中两种不同荧光蛋白的逐步定位。该技术提供了一种系统的方法来确定临界角并获得 TIRF 信号，这对于得出有关接近质膜的结论至关重要。

在 TIRF 显微镜会议的前一天，将加热室打开至 37 摄氏度，以便对显微镜载物台进行均匀加热。第二天早上，使用 100 微升 PBS，补充 0.1% BSA，每 35 毫米玻璃底培养皿洗涤 7x10 至第 6 只绵羊红细胞或 SRBC 两次。第二次离心后，将细胞重悬于 500 μL 兔 IGG 抗 SRBC 中，以亚凝集浓度，在每 5 μL 细胞中添加 0.1% BSA 的 PBS 中，并缓慢旋转孵育细胞 30 分钟。

孵育结束时，在 PBS 加 BSA 中洗涤 SRBC 两次，并将细胞重悬于每皿 2 毫升 37 摄氏度无血清显微镜培养基中。然后，在 35 毫米玻璃底培养皿中用 2 毫升 0.1% 聚-L 赖氨酸在室温下处理 30 分钟，然后用 2 毫升 PBS 洗涤两次。对于 SRBC 的非共价固定，将 2 毫升 IGG 调理素化细胞倒入每个聚赖氨酸包被的培养皿中，并在摆动转子离心机中离心样品。

弃去上清液，用 2 毫升 PBS 加 10% BSA 洗涤颗粒一次。然后，将颗粒与 2 毫米新鲜 PBS 加 10% BSA 在室温下孵育 30 分钟，然后用 2 毫升 PBS 洗涤 3 次。最后一次洗涤后，用 2 毫升 37 摄氏度的无血清显微镜培养基替换 PBS。

将 SRBC 涂层的培养皿放在显微镜载物台上。然后，从培养皿底部刮下转染的目标细胞，并移液细胞几次以获得单细胞悬液。将转染的细胞添加到 SRBC 包被的培养皿中。

启动实时采集软件。找到一个表达荧光标记蛋白的细胞，并调整培养皿的位置，使感兴趣的细胞位于视野的中间。在一个激发波长下，以 0.01 度的增量，以 0.01% 的增量以 0% 到 5% 的不同角度采集 500 张图像。

要确定入射光在玻璃介质界面处完全反射的临界角，并产生消逝波，请在适当的成像软件中打开图像序列。在细胞中选择一个具有均匀荧光的感兴趣区域。然后，在 Image 选项卡下，选择 Stacks，和 Plot Z Axis Profile。

绘制 z 轴剖面图，在感兴趣区域测量的平均荧光强度与 x 轴上角度的函数。然后，在显微镜检查期间，可以使用 x 轴上优于临界角的任何角度值来获得 TIRF 信号。接下来，在实时采集软件中，使用协议编辑器设置采集的参数。

包括环路采集序列的数量、荧光通道及其激光强度、TIRF 角度和曝光时间。设置物镜的 Z 移动以到达落射荧光模式平面。然后，在落射荧光模式下，将 TIRF 角度设置为 1，并将物镜的 Z 轴移动回 TIRF 平面。

然后，在强光 LED 模式下获取细胞的图像。现在，找到一个具有中等荧光标记蛋白表达水平的目标细胞，与 SRBC 进行吞噬作用，并将该细胞移动到视野的中间。请注意，这种细胞可以通过颗粒周围的扩展质膜来识别。

在 Loop Count 选项卡中输入帧数，以开始 500 到 1， 000 帧的流式采集。如有必要，更改激光强度和曝光时间以适应细胞中不同水平的荧光。要生成对应于两个通道的两个单独的图像序列，请在 imagine 软件中打开序列，然后单击 Image 选项卡。

在 Hyperstacks 菜单中，选择 Stack to Hyperstack。然后，在弹出窗口中，输入 xyctz 作为 顺序，用于 通道 的荧光染料数量，z 轴上的切片数量，图像数量除以 帧 下的通道数量，以及 灰度 作为 显示模式.然后，拆分通道。

在这里，显示了吞噬 IGG 调理素化 SRBC 的原始 264.7 巨噬细胞中吞噬体闭合测定的代表性活细胞 TIRF 显微镜电影。由于伪足的尖端与 SRBC 周围的玻璃盖玻片相对，因此在 TIRF 区域中检测到一个 F 肌动蛋白环，该环逐渐变窄直至闭合。同时，落射荧光检测到的模糊 F-肌动蛋白信号，在 TIRF 区域上方移动 3 微米后，对应于吞噬杯底部的解聚。

三分钟后，SRBC 完全内化，透射光成像证实了这一点。使用这种方法，肌动蛋白在吞噬杯的基部是细胞内区室的局灶性胞吐作用，可以证明。采集后，可以进一步处理细胞以进行相关电子显微镜检查，或者可以固定和冷冻处理整个细胞群以进行经典免疫荧光显微镜检查。

重要的是要记住，吞噬作用对温度非常敏感，因此，在整个过程中，加热室和培养皿培养基内的温度应保持在 37 摄氏度的恒定温度。观看本视频后，您应该对颗粒进行调理作用、用颗粒包衣盖玻片、确定 TIRF 显微镜的临界角以及在活细胞吞噬过程中对目标蛋白质的定位进行成像。