融合绝对定量与相对定量PCR数据以定量STAT3剪接变异体转录本

本实验方案的总体目标是定量嗜酸性粒细胞中STAT3剪接变异体转录本的比例及绝对水平。该方法可用于解答剪接调控领域中的关键问题，例如远端剪接事件的共关联性，以及识别可导致串联剪接比例发生变化的条件。该技术的主要优势在于采用质粒标准品，可获得绝对和相对的qPCR数据，从而确定四种STAT3转录本的比例及其总体表达水平。

在本研究中，我们希望了解当嗜酸性粒细胞受到细胞因子刺激时，四种 STAT3 亚型 S alpha、S beta、delta S alpha 和 delta S beta 的变化情况。尽管该方法可揭示嗜酸性粒细胞中 STAT3 的组成，也可应用于其他能够获得 cDNA 的细胞类型。由于 S 与 delta S 仅存在三个核苷酸的差异，因此我们在建立各亚型的定量标准品时，不得不牺牲扩增效率以获得特异性。

本方案中，以从人嗜酸性粒细胞制备的 cDNA 作为模板，用于扩增 STAT3 剪接变体。在按照文字方案构建质粒后，需对多个菌落来源的质粒进行测序反应。每个 20 微升的反应体系应包含 3 微升测序反应缓冲液、2 微升测序反应混合液、12 微升超纯水、1 微升质粒和 2 微升测序引物。

当测序结果可用时，分析编码各变异体的质粒的电泳图谱：S alpha、S beta、delta S alpha 和 delta S beta。测定纯体质粒 DNA 的浓度，单位为纳克每微升（ng/µL），并计算每微升的拷贝数。开始该操作前，使用超纯水制备 STAT3 质粒的一系列 10 倍稀释液。

每微升含有约10的八次方至10的三次方个拷贝。测定浓度最高样本的浓度。将质粒稀释后，为每种剪接变体分别制备四个非靶向混合液作为阴性对照，每种变体的浓度为每微升10的六次方个拷贝。

将四种模板各以每微升10的6次方拷贝的相等浓度混合，制备靶标混合液。为每种剪接变体分别制备引物对溶液，每种引物各取60微升，浓度均为7微摩尔，使样品中引物的终浓度为560纳摩尔。用纯水将DNA聚合酶和双链DNA结合染料混合液按7:5比例稀释。

按照此模板在96孔PCR板中建立反应体系。首先向每个孔中加入21微升稀释的DNA聚合酶和双链DNA结合染料混合液，然后加入2微升引物混合液和2微升模板。

在每个无模板对照孔中加入两微升过滤水，代替模板。每个反应设置两个重复孔，以评估重复性。用粘性封板膜密封qPCR板，并在12摄氏度、1,200 ×g条件下离心五分钟。

打开qPCR仪并插入密封的qPCR板。如果使用ABI实时PCR系统，请按照演示设置实验。点击“文件”，选择“新建”，点击“下一步”，选择“新建检测器”，然后输入名称，并选择报告荧光基团（Reporter）和淬灭荧光基团（Quencher）。

为每种剪接变体设置一个新的检测器。选择“下一步”，然后根据“设置样本板”页面的提示设置标准品，确保将数量输入表格中，并选择相应的检测器。单击“完成”。

设置适当的PCR扩增程序。确保在每个循环的72摄氏度步骤中进行荧光读取，以确定阈值循环（Ct）值。选择“运行”。

运行完成后，单击“结果”选项卡中的“扩增图”选项卡。评估输出的扩增图以判断数据质量。呈指数增长的曲线表明扩增结果可靠。

将结果导出至电子表格软件。按照文本方案中所述进行数据分析，是判断该检测是否需要进一步优化以提高可重复性的关键。本检测所用的 cDNA 是由经细胞因子处理以促进转录的嗜酸性粒细胞制备而来。

将两份样本 cDNA 等分试样进行系列稀释，稀释范围为 1 至 1,024。在 96 孔板中建立检测体系，每孔反应体积为 25 µL，用于分析引物特异性，同时设置多种引物浓度用于泛 STAT3 和看家基因 GUSB。本表展示了实验模板。

将密封的PCR板放入qPCR仪中。使用软件设置实验，为GUSB添加新的检测通道，并选择合适的PCR扩增程序。随后，根据文本方案中所述方法，利用结果计算每个样本的阈值循环数（Ct值）。

开始此实验步骤时，首先比较在相对定量qPCR中获得的内参基因GUSB的循环阈值（Ct值），并根据结果用超纯水相应稀释cDNA，以确保所有样品的浓度均在同一个数量级范围内。在96孔板中设置样品的绝对定量qPCR实验。S alpha和S beta请遵循此模板，delta S alpha和delta S beta请遵循另一对应模板。

按照先前所示方法进行检测，并至少重复一次检测。接下来，使用泛 STAT3 引物（终浓度 400 微摩尔）以及四种质粒的混合物或单一质粒，按照此模板设置 25 微升反应体系的绝对定量 qPCR 96 孔板。用粘性封板膜密封 qPCR 板，在 12 摄氏度、1,200 ×g 条件下离心 5 分钟。

将密封的PCR板放入qPCR仪中，并按照之前所示设置实验，为泛STAT3添加新的检测通道。循环参数设置与相对qPCR相同。重复实验至少一次后，按照文本方案中所述分析结果。

高质量的qPCR数据将产生S型扩增曲线，表明在扩增循环过程中转录本呈指数增长。这些数据来自含有STAT3 S alpha的质粒的两个系列稀释样本的qPCR检测。每对彩色线条代表在40个循环过程中，重复稀释样本的荧光水平变化。

为模板校准质粒生成的标准曲线将指示扩增效率。本实验中STAT3 S alpha的扩增效率为83.9%。为了评估STAT3水平的一致性，分别测量了四种剪接变体各自的绝对值以及总STAT3的水平。理想情况下，线性回归的相关系数和斜率均应接近于1。

绝对定量qPCR数据以饼图形式呈现，以显示在细胞因子处理过程中四种STAT3剪接变异体所占的比例。整合绝对与相对qPCR数据表明，在IL3和TNF alpha细胞因子刺激后，所有STAT3剪接变异体的表达水平均上升，并在六小时达到峰值。合并所有时间点的数据发现，β与δS剪接事件之间存在轻微但具有显著性的共关联倾向。

一旦优化完成，如果操作得当，基于该技术的检测可在四小时内完成。在进行此操作时，重要的是要始终在无菌条件下工作，以防止污染。包含或排除一个密码子的剪接决定占框内剪接变异的20%。

我们的方案应可轻松适用于此类变异体的定量分析。该技术建立后，使得毛·张能够在李善·瑞的团队中与我合作，开展在ABC淋巴瘤细胞中对STAT3变异体进行基因沉默与重新表达的实验。这些实验表明，在培养条件下细胞存活需要S与ΔS变异体的共同存在。

观看本视频后，您应能充分理解如何开展绝对定量与相对定量qPCR，以及如何设置适宜条件以区分和定量细微的剪接差异。