Name: 三氯化铁诱导小鼠模型的血栓形成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 了解三氯化铁诱导小鼠颈动脉和肠系膜动脉血栓形成模型的建立方法。该活体显微技术可用于研究血小板活化机制、评估抗凝药物疗效，并探索心血管疾病的新治疗策略。

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本研究工作由美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所（NHLBI）资助，资助编号为 R01 HL121212（项目负责人：Sen Gupta）、R01 HL129179（项目负责人：Sen Gupta，合作研究者：Li）和 R01 HL098217（项目负责人：Nieman）。本出版物的内容由作者全权负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

所有动物实验操作均经克利夫兰诊所机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，符合美国公共卫生局 动物人道护理与使用政策，以及美国国立卫生研究院 实验动物护理和使用的指南.
1. 准备工作：
<ol>
	<li>用于标记血小板的荧光染料
	<ol>
		<li>用生理盐水配制 0.5 mg/ml 的罗丹明 6G 溶液，并使用 0.22 µm 滤膜过滤除菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FeCl3 溶液
	<ol>
		<li>用纯水新鲜配制 30% 的 FeCl3 储存液（无水，相当于 1.85 M），并用 0.45 µm 滤膜过滤。在 6 cm 组织培养皿中，将 30% FeCl3 溶液用纯水稀释至所需浓度 [例如，2.5% (0.154 M)、5% (0.308 M)、7.5% (0.463 M)、10% (0.617 M) 和 12.5% (0.771 M)]，配制 5 ml 新鲜溶液，并保持皿盖关闭。 
		注意： 使用培养皿比从窄口容器（如 1.5 ml 微离心管）中更容易取出浸透 FeCl3 溶液的滤纸片。FeCl3 具有极高危险性，操作时必须采取防护措施，例如佩戴手套、实验服等个人防护装备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>滤纸片
	<ol>
		<li>将滤纸裁剪成 1 mm × 2 mm 的大小。将足够数量的裁剪滤纸片浸入同一培养皿中的 FeCl3 溶液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>盐酸罂粟碱溶液
	<ol>
		<li>用纯水配制 25 mg/ml 的盐酸罂粟碱溶液，并使用 0.22 µm 滤膜过滤除菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>琼脂糖凝胶
	<ol>
		<li>在 6 孔组织培养板中用 PBS 或生理盐水配制 2% 琼脂糖凝胶，厚度约 1 cm，并将其切成直径约 3 cm 的半圆形。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. FeCl3诱导的颈动脉损伤血栓形成模型
<ol>
	<li>血栓模型的手术操作步骤
	<ol>
		<li>使用8至12周龄的C57Bl6小鼠（或根据需要选用其他品系）。通过腹腔注射给予氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物以麻醉小鼠。通过脚趾夹捏反应确认麻醉深度。 
		注意： 该剂量的氯胺酮/赛拉嗪足以使动物保持稳定的麻醉状态，并在至少1小时内无疼痛反应（对脚趾夹捏无反应）。</li>
		<li>用小型动物电推剪去除颈部和上胸部的毛发，无需使用脱毛膏。涂抹中性石蜡油保护眼睛&#160;麻醉期间在眼睛上涂抹药膏以防止干燥。</li>
		<li>将小鼠仰卧位固定于15 cm组织培养板的盖子上。用一条长约10 cm的胶带固定后肢和下腹部，再用两段小胶带（2 cm × 0.5 cm）固定前肢。使用4-0缝线绕过门齿，将缝线两端粘贴于盖子上，以保持小鼠颈部伸直图2).</li>
		<li>将培养皿置于手术光源下，小鼠头部朝向操作者。</li>
		<li>用酒精棉片消毒手术部位。使用显微有齿镊夹住皮肤，用手术剪做一个小切口（2 - 3 mm）。</li>
		<li>用镊子夹住切口处的皮肤，将闭合的手术剪插入切口内。将剪刀在皮下组织中朝向胸骨柄或下颌方向推进，然后打开剪刀，分离皮肤与皮下层。</li>
		<li>用手术剪沿中线从胸骨柄至舌骨水平切开皮肤（图 3A 和 3B）。钝性分离薄层筋膜（虚线，内 图3B）在下颌下腺之间使用精细止血钳和格雷夫镊子（图 3B 以及 3C; 蓝色箭头). 
		注意： 胸骨柄（黑色箭头所示） 图3C）和气管（T） 图3C此步骤之后将观察到）</li>
		<li>用格劳费镊子夹住胸骨柄右侧可见的软组织和皮肤，将止血钳插入筋膜下方，朝向2点钟位置图3C中的黄色虚线），打开止血钳的钳口，使颈静脉脱离周围组织。</li>
		<li>向2点钟方向切开筋膜、软组织和皮肤（图3C）用手术剪剪开以暴露右侧颈静脉（图3D，箭头).</li>
		<li>抽取约 200 - 300 &#181;使用1 ml注射器和22 G针头配制l rhodamine 6G溶液，然后更换为30 G针头。 
		注意： 这可以保护30 G针头的精细尖端免受损坏。&#160; 使用30 G针头直接吸取罗丹明6G溶液不会损坏针尖；但若意外触碰容器壁，则可能造成损坏，从而导致注射困难。</li>
		<li>用30 G针头缓慢推出罗丹明6G溶液以冲洗针头，确保注射器或针头中无残留气泡。保留100 &#181;l 注射用罗丹明6G溶液</li>
		<li>将针头尖端2-3 mm处弯曲成90°&#176; 使用持针器与之形成一定角度，可防止针头插入颈静脉过深，并使注射更易于控制（图3D).</li>
		<li>将罗丹明6G溶液注入右侧颈静脉以标记血小板。注射过程中，一手持注射器，另一手持格拉夫镊子夹住针头，以固定注射器并保持针头位置稳定。注射完成后，用格拉夫镊子夹闭注射部位，防止出血。</li>
		<li>打开止血钳的钳口，将其插入格雷夫镊子下方，夹住注射部位的血管壁，然后用6-0缝线结扎注射部位。 
		注意： 作为步骤2.1.15的替代方法，用手指对注射部位施压2分钟可止血；然而，若意外移除注射部位的血凝块，该方法存在引发再次出血的风险。</li>
		<li>用止血钳和格雷夫镊子钝性分离左侧下颌下腺周围的软组织和筋膜，并将腺体向7点钟方向牵拉（图3E）以暴露左侧胸锁乳突肌（图中蓝色箭头所示） 图3E).</li>
		<li>钝性分离筋膜（图3E，虚线)位于左侧胸锁乳突肌与肩胛舌骨肌或胸骨舌骨肌之间（图3E，绿色箭头用止血钳夹住气管左侧的部位。</li>
		<li>用一根6-0丝线（长约15 cm）从胸锁乳突肌中部下方穿过（图中蓝色箭头所示） 图 3E），将缝线的两端并拢，向10点钟方向横向拉动缝线。 
		注意： 此操作应谨慎进行，以避免损伤位于胸锁乳突肌外侧的左颈静脉。</li>
		<li>钝性分离胸骨舌骨肌和/或肩胛舌骨肌，以暴露颈动脉（CA）图 3F 在拉开胸锁乳突肌后，可见（箭头所示）。必要时切断胸骨舌骨肌和/或肩胛舌骨肌。使用止血钳分离颈动脉周围的软组织，注意避免接触颈动脉。 
		注意： CA 伴随迷走神经，即所见的白色结构 图 3G （绿色箭头），在大多数情况下，它位于胸骨舌骨肌和/或肩胛舌骨肌的深层（位于黄色虚线之间） 图 3F).</li>
		<li>使用精细尖头镊子夹住颈动脉（CA）周围的侧筋膜，同时避开迷走神经和颈动脉。用另一把精细尖头镊子在颈动脉与迷走神经之间的筋膜上穿一个小孔。</li>
		<li>将钩子穿过孔洞，轻轻提起颈动脉（CA），然后将精细尖头镊子置于颈动脉下方。沿颈动脉向相反方向移动钩子和镊子，以剥离外膜软组织。游离至少约 5 mm 长度的颈动脉（CA）图3H，蓝色箭头）从周围组织中分离。</li>
		<li>为阻断背景荧光，将黑色塑料咖啡搅拌棒的一端压平，横向截取一段3 mm长的片段，然后沿折边纵向剪开，得到两片 &#34;U&#34; 塑形塑料图3H，绿色箭头).</li>
		<li>冲洗其中一块 &#34;U&#34; 用生理盐水塑形塑料，并用镊子夹住，在轻轻抬起颈动脉的同时将其置于颈动脉下方图3H，绿色箭头立即滴加2-3滴生理盐水，以防止颈动脉干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实时记录视频
	<ol>
		<li>将小鼠和培养皿盖一同转移至显微镜载物台上，并置于10倍水镜下适当位置。用生理盐水填充10倍物镜与颈动脉（CA）之间的空间。</li>
		<li>启动数字视频录制软件程序，新建一个文件并根据需要命名。录制正常血管的图像，并在视频录制停止时记录下帧编号。 
		注意： 参考计算机中的视频录制软件进行记录。我们使用数字视频录制软件，以下描述基于该应用程序。&#160; 
		注意： 由于机械损伤可能损害内皮细胞并导致血栓形成20，有必要在使用三氯化铁（FeCl₃）之前确认血管壁无手术损伤3 损伤。还必须确认颈动脉（CA）周围没有残留组织，因为残留组织可能形成屏障，削弱 FeCl₃ 的作用效果。3诱导损伤。记录视频的帧编号将便于后续根据经过时间分析视频。</li>
		<li>将小鼠连同盖玻片从10倍物镜下移开。将一张纸巾的一角折叠成细小的尖端，用其小心吸去颈总动脉（CA）周围的生理盐水（避免触碰CA），并吸去手术区域其他部位的液体。此步骤至关重要，可防止FeCl₃被稀释。3 所用溶液。</li>
		<li>使用精细尖头镊子夹取一片浸有 FeCl₃ 的滤纸3 溶液并直接置于冠状动脉上，原位保留1分钟。 
		注意： 为便于观察血流并获取准确数据，将滤纸置于暴露的颈动脉（CA）远端附近图 3I）并在近端位置保留一段较短的节段（图3I中的绿色箭头用于观察晚期血流情况（见下文）。</li>
		<li>移除滤纸（此时间点定义为“损伤后”的开始），并用生理盐水冲洗颈动脉（至少2 ml）。 &#160;</li>
		<li>将小鼠连同培养皿盖放回10倍物镜下；观察血管并开始记录视频图像。在记录的第一分钟结束时，记下视频帧编号。 
		注意： 血栓形成通过荧光标记血小板的聚集来识别，可在计算机屏幕或显微镜下实时视频图像中观察到。将小鼠放回显微镜下后，立即开始记录视频图像。从移除滤纸开始，持续记录至第一分钟结束。从远端到近端全面观察整个血管，以获取损伤相关信息，随后聚焦于感兴趣区域（通常为损伤区域的中心）进行进一步成像。</li>
		<li>每分钟记录一次视频图像，每次持续10秒，共记录前10分钟（例如， 2分55秒至3分05秒，随后每隔一分钟记录10秒，直至实验结束。每次停止记录时，记下对应的帧编号。 
		注意： 模型的终点是：1）血流完全停止时 &#62;&#160; 30秒；或者如果损伤后30分钟内未观察到闭塞，则以30分钟计入统计分析。视频记录的曝光时间初始设置为10毫秒，以便于观察血栓上方的血流情况。当血栓增大且荧光信号饱和相机传感器时，将难以识别血栓上方的血流。为解决此问题，将成像中心移至近端未损伤部位（图3I，绿色箭头）处仍可清晰观察到血流。在观察近端未损伤部位时，我们还将曝光时间延长至15或20毫秒，以便更清晰地观察血流情况。当血流即将停止时，大量较大的细胞（白细胞）开始在血栓近端的血管壁上滚动。血流通常在大细胞出现后2至3分钟内停止。若曝光时间有所调整，需在记录表上注明。若使用正常的野生型C57Bl6小鼠，从麻醉开始至实验结束通常约需30分钟。 
		警告： 不要将白色聚集的血小板凝块作为血流停止的标志，这不会提供准确的数据，且受曝光时间的影响。白色凝块覆盖血管管腔并不意味着血流已经停止（参见代表性视频1）。</li>
		<li>实验结束时，使用过量的氯胺酮/赛拉嗪（200/20 mg/kg）对小鼠实施安乐死，确认无呼吸和心跳后，进行颈椎脱位。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 三氯化铁（FeCl3）诱导的肠系膜动脉/静脉血栓形成模型
<ol>
	<li>对8至12周龄的C57Bl6小鼠进行麻醉，具体操作如第2.1.1节所述。在小鼠眼睛上涂抹兽用眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。</li>
	<li>腹腔注射罂粟碱溶液（每只小鼠总量 0.4 mg）以抑制肠道蠕动。</li>
	<li>使用动物专用电推剪去除颈部和腹部的毛发，无需使用脱毛膏。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定在15 cm组织培养皿的盖子上。使用四小段胶带（2 cm × 0.5 cm）固定四肢。用4-0缝线缠绕门齿，将缝线两端粘贴固定于盖子上，以保持颈部伸直图2).</li>
	<li>按照步骤 2.1.4 - 2.1.15 暴露颈静脉，用于注射罗丹明 6G 以标记血小板。</li>
	<li>使用手术剪从剑突至下腹部沿中线切开皮肤图4A）。提起腹中部腹膜（也称为白线， 图4A，用无齿镊轻轻提起腹膜（箭头所示），此处透明且无血管，提起约2—3 mm，确认切口线下方无肠管，然后用精细剪刀沿纵轴剪开腹膜图4B).</li>
	<li>将小鼠重新固定于右侧卧位。将半圆形琼脂糖凝胶置于腹部附近，用格拉夫镊子轻柔地将肠管引出体外，并展开铺于凝胶表面。图 4C）。将第二分支用于血栓形成实验（图4C，箭头). 
	注意： 使用止血钳或显微Adson镊子辅助将肠管外置。注意避免损伤肠管和血管。</li>
	<li>加入5-6滴生理盐水以保持肠管和血管的湿润。将小鼠连同培养皿盖一同转移至显微镜载物台，并置于10倍干镜下的适当位置。 
	注意： 使用干镜，因为空肠回肠膜无法容纳生理盐水溶液。确保将生理盐水溶液滴加到暴露的组织上以保持其湿润。</li>
	<li>处理前用吸水纸吸干肠系膜动脉和静脉周围的生理盐水。</li>
	<li>使用精细尖头镊子夹取一块浸有12.5% FeCl₃的滤纸3 溶液，并将其直接置于肠系膜动脉和静脉上作用1分钟（图4D).&#160; 移除滤纸（此时间点定义为“损伤后”的开始），并用生理盐水冲洗受损的肠系膜动脉和静脉（至少2 ml）。 &#160;</li>
	<li>将小鼠连同培养皿盖放回10倍干镜下；观察血管，并按照2.2）中的说明开始记录视频图像。 
	注意： 本实验的终点为：1）血流完全停止时 &#62; 30秒；或者，如果损伤后30分钟内未观察到闭塞，则在统计分析中使用30分钟作为时间值。</li>
	<li>实验结束时，使用过量的氯胺酮/赛拉嗪（200/20 mg/kg）对小鼠实施安乐死，待确认无呼吸和心跳后，进行颈椎脱位。</li>
</ol>

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<li>Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+anionic+region+of+human+protease-activated+receptor+4+inhibits+platelet+aggregation+and+thrombosis+without+interfering+with+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis.</a> J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

FeCl3诱导模型是最广泛应用的血栓模型之一，不仅可以提供有关基因修饰对血小板功能和血栓形成影响的重要信息7,8,16,19,31-33，还可作为评估治疗性化合物及治疗和预防动脉粥样血栓性疾病策略的有力工具11,17,34-37。本文展示了我们对该模型的改进与优化，并提供了更多证据以证明该技术的实用性，其灵敏度足以检测抗凝药物（tPA）和抗血小板药物（PAR4抗体）的作用效果。除了用于血栓形成机制研究外，该模型还可用于基于纳米技术的靶向血栓药物递送研究。此外，通过注射荧光活性氧（ROS）指示剂，该模型还可用于检测血管壁活性氧的生成21。
进行这些模型实验需要精细的技术。操作者应具备足够的外科手术技能，以及对血管和血细胞生物学的深入理解。三氯化铁（FeCl₃）模型中的几个关键要点包括：3 诱导性颈动脉血栓模型为6：(1) 暴露足够长度的颈动脉（约5 mm），以便放置滤纸，并预留空间用于在后期通过活体显微镜观察血流情况；(2) 彻底剥离颈动脉周围的外膜软组...

动脉血栓（血凝块）是许多与慢性炎症相关系统性疾病的常见并发症，包括动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖症、癌症以及慢性自身免疫性风湿性疾病。动脉循环中发生的血栓源于血小板的异常活化、聚集及随后的凝血机制，与心肌梗死、脑卒中和肢体缺血性坏死密切相关。血管壁是一个复杂的系统，包含多种细胞类型，并受到多种外部因素的影响，包括剪切应力、循环血细胞、激素和细胞因子，以及血管壁内抗氧化蛋白的表达。体外实验无法复制这一复杂环境，因此利用动物模型开展体内研究对于深入理解血栓性疾病相关机制至关重要。
研究表明，小鼠在血栓形成、动脉粥样硬化、炎症和糖尿病等方面具有与人类相似的机制1,2。此外，可构建转基因小鼠和基因敲除小鼠，以在复杂的生理或病理环境中检测特定基因产物的功能。此类研究可模拟人类疾病病理过程，有助于发现新的信号通路和治疗方法，并为表征药物对血栓形成的影响提供重要信息。
病理性动脉血栓的形成是由于内皮层受损或功能障碍，导致血液暴露于内皮下基质所致3,4。目前已开发出多种血栓形成模型以诱导此类内皮损伤，例如机械性损伤、基于光敏化合物玫瑰红（Rose Bengal）的氧化性损伤以及激光损伤5。在这些模型中，三氯化铁（FeCl3）诱导的血管损伤是一种广泛应用的血栓形成模型。当该试剂作用于血管外壁时，可引起血管细胞的氧化性损伤6-8，导致内皮细胞对循环血小板及凝血级联成分的保护作用丧失。FeCl3模型操作简便，且对抗凝药物和抗血小板药物均具有良好的敏感性，已在小鼠、大鼠、豚鼠和兔的颈动脉和股动脉、颈静脉以及肠系膜和提睾肌的小动脉和小静脉上成功应用6-15。
该模型中一个可测量的参数是从损伤到血管完全闭塞所经过的时间，可通过多普勒血流仪测量血流停止，或通过活体显微镜直接观察来确定6,7,9。在C57Bl6小鼠中，不同研究报道的时间范围为5至30分钟7-10,16，表明三氯化铁（FeCl3）浓度、麻醉类型、手术技术、小鼠年龄、基因组背景、血流测量方法以及其他环境变量对该模型具有显著影响。这种较大的变异性使得不同研究团队之间的研究难以比较，也可能导致难以检测到细微的差异。
为了减少此类变异性并建立一个高度可重复的体内模型系统，我们优化了三氯化铁（FeCl3）诱导的颈动脉损伤模型，使实验数据具有高度的可重复性且变异极小6-10,16-19。本文中，我们详细描述并分享了相关操作技术，并报告了多个可从该模型中受益的代表性实验示例。

<table><tbody><tr><td>手术剪 - 碳化钨</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>14502-14</td><td>剪切并夹持皮肤</td></tr><tr><td>显微有齿镊 - 带齿/直型/12 cm</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>11018-12</td><td>剪切并夹持皮肤</td></tr><tr><td>梅岑鲍姆精细剪 - 碳化钨/弯型/钝头-钝头/14.5 cm</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>14519-14&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>用于解剖和分离软组织</td></tr><tr><td>超细止血钳 - 光滑/弯型/12.5 cm</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>13021-12</td><td>用于解剖和分离软组织</td></tr><tr><td>格拉费镊 - 带齿/直型/10 cm</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>11050-10</td><td>用于解剖和分离软组织</td></tr><tr><td>杜蒙特#5精细镊 - 生物学尖端/直型/不锈钢/11 cm</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>11254-20&amp;nbsp;</td><td>从周围组织中分离血管</td></tr><tr><td>杜蒙特#5XL镊 - 标准尖端/直型/不锈钢/15 cm</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>11253-10</td><td>从周围组织中分离血管</td></tr><tr><td>钝头钩 - 12 cm/0.3 mm 尖端直径</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10062-12</td><td>从周围组织中分离血管</td></tr><tr><td>卡斯特罗维霍显微持针器</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>12061-02</td><td>持针器</td></tr><tr><td>4-0 缝合线</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>18020-40</td><td>用于将门齿固定在载片上</td></tr><tr><td>6-0 缝合线</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>18020-60</td><td>用于所有外科手术和结扎</td></tr><tr><td>卡尔特缝合针</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>12050-03</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明6G&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>83697-1G</td><td>用于标记血小板</td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;（无水）</td><td>Sigma</td><td>12321</td><td>用于诱导血管损伤</td></tr><tr><td>盐酸罂粟碱</td><td>Sigma</td><td>P3510</td><td>用于抑制肠道蠕动</td></tr><tr><td>Medline 外科器械灭菌蒸汽高压灭菌胶带</td><td>Medline</td><td>111625</td><td>用于将小鼠固定在载片上</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;trade;&amp;nbsp;注射器滤器 - 无菌 0.22 &amp;micro;m</td><td>Fisher</td><td>09-720-004</td><td>用于过滤注射给小鼠的溶液</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;trade;&amp;nbsp;注射器滤器 - 无菌 0.45 &amp;micro;m</td><td>Fisher</td><td>09-719D</td><td>用于过滤 FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 溶液</td></tr><tr><td>无菌酒精擦拭垫</td><td>Fisher</td><td>06-669-62</td><td>用于手术部位的消毒</td></tr><tr><td>琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>BioExpress</td><td>E-3120-500</td><td>用于制备凝胶载片</td></tr><tr><td>Leica DMLFS 荧光显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>活体显微镜</td></tr><tr><td>GIBRALTAR 平台及带加热板的 X-Y 位移系统</td><td>npi electronic GmbH</td><td></td><td>http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html</td></tr><tr><td>Streampix 版本 3.17.2 软件</td><td>NorPix</td><td></td><td>https://www.norpix.com/</td></tr></tbody></table>

氯化铁诱导的小鼠血栓形成模型

Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models

动脉血栓（血凝块）是许多与慢性炎症相关系统性疾病的常见并发症，包括动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖症、癌症以及慢性自身免疫性风湿性疾病。血栓是大多数心肌梗死、脑卒中和肢体缺血坏死的主要原因，因此血栓形成是一个极为重要的公共卫生问题。由于这些血栓源于血小板的异常活化及随后的凝血过程，针对这些系统的治疗干预在临床上具有重要意义，有助于开发更安全的治疗方法。由于止血系统的复杂性，体外（in vitro）实验无法完全模拟血液与血管壁之间的相互作用，因此体内（in vivo）研究对于理解血栓形成的病理机制至关重要。为此，研究人员已建立了多种小鼠血栓形成模型。其中，三氯化铁（FeCl3）诱导的血管损伤是一种广泛使用的闭塞性血栓模型，可在无菌且封闭的血管系统环境中反映血小板的活化与聚集情况。该模型基于氧化还原反应诱导的内皮细胞损伤，操作简便，且对抗凝药物和抗血小板药物均具有良好的敏感性。血栓形成导致血流完全阻断所需的时间，可定量反映血管损伤程度以及血小板活化和聚集水平，与血栓性疾病具有相关性。我们对该FeCl3诱导的血管血栓模型进行了显著优化，使实验数据具有高度可重复性且变异极小。本文将详细描述该模型，并展示来自多个实验设置的代表性数据，以说明该模型在血栓研究中的应用价值。

颈动脉血栓形成模型 
对于C57BL6背景的小鼠，我们建议以7.5% FeCl3处理血管1分钟作为起始条件。在7.5% FeCl3处理下，显微镜下可清晰分辨损伤区域与正常血管壁的边界（见在线视频1），提示内皮层已受到显著损伤。血栓在FeCl3处理后立即形成，并在所有野生型C57BL6小鼠中于损伤后1分钟内可见。初始形成的血栓不稳定，部分通常会被血流冲走，因此在损伤后2–3分钟时血栓体积变小。从滤纸移除后3–4分钟开始，血栓重新增大，此后形成的血栓较为稳定，通常不会被血流冲走。当使用7.5% FeCl3时，C57BL6小鼠的平均闭塞时间为11.3 ± 3.16分钟（n = 14）6,7,19（图5A和在线视频1）。在先前的研究中，我们已证明FeCl3浓度过低或过高均会削弱抗血栓小鼠品系与野生型小鼠之间的差...

我们报道了一种改良的三氯化铁（FeCl3）诱导的颈动脉、肠系膜动脉以及静脉血栓形成模型，该模型可通过活体显微镜高效地监测闭塞性血栓形成的时间。

动脉血栓（血凝块）是许多与慢性炎症相关的全身性疾病的常见并发症，包括动脉粥样硬化……

本实验的总体目标是通过在小鼠颈动脉模型中诱导三氯化铁（ferric chloride）引起的血栓形成，利用活体显微镜分析获得高度可重复的结果。这些小鼠模型有助于解答与血小板活化及闭合血管系统聚集相关的各种疾病或遗传性疾病的關鍵问题。该技术的主要优势在于操作简便，且对抗凝药物和抗血小板药物均具有敏感性，同时可与其他技术联合使用。该方法可用于深入了解血栓形成的病理生理学机制，发现新的作用机制和治疗方法，并评估新型药物（包括靶向纳米药物）对血栓形成的影响。对该方法的可视化呈现对于掌握准确测定血流停止时间的策略至关重要。在确认小鼠对足趾夹捏无反应后，使用小型电动动物剪毛器去除8至12周龄小鼠颈部和胸部上部的毛发。将中性石蜡眼膏涂抹于动物眼睛，并用胶带将小鼠仰卧固定在直径15厘米的组织培养皿盖上。用4-0缝线绕过门齿，并将缝线两端粘贴固定于皿盖，以保持颈部伸直。随后，将动物移至手术光源下，使用酒精棉片对手术区域进行消毒。接下来，使用微型 Adson 镯子夹住皮肤，并用手术剪做一个 2 至 3 毫米的切口。用镊子固定切口，将闭合的剪刀插入切口，闭合刀片，皮下推进至胸骨柄。然后张开刀片，分离皮肤与皮下组织层。现在，从胸骨柄至舌骨做一正中切口，使用精细止血钳和格拉夫镊子钝性分离下颌下腺之间的薄层筋膜。当气管可见时，用镊子夹住胸骨柄右侧的软组织，将止血钳插入筋膜下方，朝向两点钟方向推进。打开止血钳的钳口，以游离颈外静脉与其周围组织。然后，继续切开筋膜、软组织和皮肤，朝向2点钟方向，直至暴露右侧颈静脉。现在，取一支连接有1毫升注射器（内含100 µL罗丹明6G溶液）的30号针头，使用持针器将针尖前端2至3毫米处弯曲90度。接着，用一只手持注射器，另一只手持血管钳夹住颈静脉远端的软组织，将针头插入血管内。用镊子固定针头，注射罗丹明。待血小板标记溶液全部注入后，用镊子夹住注射部位，打开止血钳并将器械插入镊子下方，夹闭注射部位的血管壁以防止出血。随后，使用6-0缝线结扎注射部位。钝性分离左侧下颌下腺周围的软组织和筋膜，将腺体向7点钟方向牵拉，以暴露左侧胸锁乳突肌。随后，钝性分离左侧胸锁乳突肌与肩胛舌骨肌和胸骨舌骨肌之间的筋膜，直至气管左侧。当筋膜被充分推开后，将带有一根15厘米长6-0丝线的针从胸锁乳突肌中段下方穿过，并将缝线两端向外侧牵拉至10点钟方向。钝性分离胸骨舌骨肌和肩胛舌骨肌，以暴露颈总动脉。随后使用止血钳分离颈总动脉周围的软组织，注意避免接触动脉本身。用尖头镊子提起颈总动脉周围的外侧筋膜，操作时避开迷走神经和动脉。然后，使用另一把尖头镊子刺穿颈动脉与迷走神经之间的筋膜。接着将一把钝头钩穿过该孔，轻轻抬起颈动脉，并将尖头镊子滑至动脉下方。沿血管方向反向移动钩子和镊子，剥离约五毫米长的血管周围附属软组织。然后，用生理盐水冲洗一段U形塑料片，并用钩子轻轻提起动脉，以便将塑料片放

ferric-chloride-induced-murine-thrombosis-models

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医学

三氯化铁诱导小鼠模型的血栓形成

本文描述了在小鼠中通过FeCl3诱导血栓形成的模型。该方法通过肠系膜血管的活体显微镜观察以及颈动脉血流测量来监测血栓的生长。...

颈动脉和肠系膜血管的氯化铁诱导血栓小鼠模型

本文介绍了对一种已得到充分表征且常用的小动物氯化铁（FeCl3）诱导颈动脉损伤模型进行必要的改进，以适用于大型动物血管损伤模型。该改进后的模型可用于临床前试验，评估预防性和溶栓性药物及机械干预措施的效果。...

氯化铁诱导的犬颈动脉血栓形成：一种血管损伤的大动物模型

本方案描述了如何利用三氯化铁（FeCl3）介导的损伤诱导动脉血栓形成，以及如何在血栓形成的各个阶段收集和制备动脉损伤样本，用于电子显微镜分析。...

三氯化铁诱导的动脉血栓形成及用于三维电子显微镜分析的样本采集

本研究介绍了一种利用氯化铁诱导大鼠上矢状窦血栓形成的可重复、微创动物模型的建立方案，该方法结合丝线结扎技术，并采用激光散斑血流成像和高分辨率超声进行评估。...

改良氯化铁诱导上矢状窦血栓形成模型的建立

通过电解诱导下腔静脉内表面内皮细胞活化，可导致静脉型血栓形成，其机制涉及内皮细胞活化和部分血流淤滞，这两者均为维尔肖三联征的组成部分。...

静脉血栓形成的电解下腔静脉模型（EIM）

小鼠下腔静脉完全阻断型血栓形成模型可产生可量化的静脉壁组织和血栓。该模型已证实可用于评估静脉壁与阻塞性血栓之间的相互作用，以及急性向慢性炎症转变的过程。...

小鼠下腔静脉血栓完全淤滞模型

在利用小鼠肥胖模型的研究中，脂肪含量分析是常规操作。小型动物CT成像与分析的新兴方法为纵向、详尽的脂肪含量分析提供了可能。本文将逐步详细介绍进行小型动物CT成像、分析及可视化的方法流程。...

使用X射线计算机断层扫描对小鼠肥胖模型中的脂肪体积进行分割与测量

我们描述了利用主动脉窦和升主动脉的精密切片，结合组织化学和免疫组织化学分析，对小鼠模型中的动脉粥样硬化病变进行定量和表征的实验方法。...

小鼠主动脉窦动脉粥样硬化病变的定量分析与表征

脑出血的临床前模型用于模拟临床疾病的某些方面，从而可研究损伤机制及潜在的治疗策略。本方案中描述了两种脑出血模型，即自体血或胶原酶注入纹状体（基底节）。...

纹状体内注射自体血或梭状芽胞杆菌胶原酶作为脑内出血的小鼠模型

癌症是一种复杂的疾病，其发展受到肿瘤周围组织以及局部促炎和抗炎介质的影响。因此，与皮下注射模型相比，原位注射模型可能更适用于研究癌症进展，以更好地模拟人类疾病的病理过程。...

将乳腺癌细胞正位注射至小鼠乳腺脂肪垫以研究肿瘤生长

了解三氯化铁诱导小鼠颈动脉和肠系膜动脉血栓形成模型的建立方法。该活体显微技术可用于研究血小板活化机制、评估抗凝药物疗效，并探索心血管疾病的新治疗策略。

氯化铁诱导的小鼠血栓形成模型

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